專利名稱：靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝螺旋藻保健食品中粗多糖的提取和測定方法，特別是涉及一種靈芝螺旋藻片中粗多糖的提取和測定方法。
背景技術(shù)：
靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細(xì)小的孢子，靈芝被《本經(jīng)》稱為 上品，被譽為“仙草”。靈芝孢子粉為靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質(zhì)，其營 養(yǎng)價值和藥理作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靈芝本身。靈芝孢子中含有蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、維生素 類、胡蘿卜素、留醇類、三萜類、生物堿類、脂肪酸類、內(nèi)酯和無機離子類等。其中粗粗多糖能 夠抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)；調(diào)節(jié)血脂以及對神經(jīng)、心血管和呼吸系統(tǒng)有調(diào)節(jié)改善作用。從增強重 要器官系統(tǒng)的功能(如強心、保肝、促進(jìn)造血、增強免疫功能等)和通過神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系 統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用以及它們之間的相互調(diào)節(jié)來協(xié)調(diào)機體的功能活動，使之能適應(yīng)內(nèi) 外環(huán)境的改變，減輕各種致病因素對機體的損害，提高機體的抗病能力。螺旋藻是一種高蛋白食品，干藻粉中植物性蛋白含量為50% 70%，相當(dāng)于大豆 的1. 68倍，牛肉的3. 3倍，雞蛋的3. 1倍，魚肉的3. 7倍；其脂肪含量只有5%，且不含膽固 醇，它含有17種氨基酸，人體所必需的8種在螺旋藻中都含有，且含量高于FAO標(biāo)準(zhǔn)及西洋 參等其它滋補品。螺旋藻中粗多糖成分具有抗輻射和顯著提高細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD) 的活力，增強機體的非特異性免疫力，改善造血功能，促進(jìn)人體外周血中NR細(xì)胞活性，延緩 機體衰老；它還具有提高巨噬細(xì)胞清除異物的能力。螺旋藻粗多糖對電離輻射的損傷具有 明顯的防護(hù)作用，減輕放射性治療對癌癥病人血細(xì)胞的破壞，作為癌癥病人進(jìn)行放化療的 輔助治療藥物；也可用于貧血病的輔助治療。螺旋藻中還含有的β-胡蘿素、維生素E多種 維生素和硒等對人體有益微量元素成分，具有防癌、抗癌、清除人體自由基、增強人體免疫 功能和延緩衰老的作用。破壁靈芝孢子粉和螺旋藻粉中已證明具有增強免疫力功能的功效成分為水溶性 粗多糖，但是成熟可靠的提取其中水溶性粗多糖的方法還不多，相應(yīng)的可靠的檢測方法幾 乎沒有。特別是因為靈芝螺旋藻保健品中具有多種的干擾成分，很多測定方法的測定數(shù)據(jù) 準(zhǔn)確率不高，提取和測定方法步驟也較為復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種步驟簡單并且準(zhǔn)確率高的在含有破壁靈 芝孢子粉和螺旋藻粉的營養(yǎng)品或保健食品中水溶性粗多糖的提取和含量測定的方法，特別 是一種靈芝螺旋藻片中粗多糖的提取以及測定方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種靈芝螺旋藻中粗多糖的提取 和測定方法，其步驟包括1)稱取樣品細(xì)粉0. 5 1. 0g，加入30 60倍重量的濃度為80 100%乙醇溶 液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20 40min，離心棄去液體；
2)將步驟1中得到的沉淀物再加入30 60倍重量的濃度為80 100%的乙醇 溶液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20 40min，離心棄去液體；3)沉淀物加入30 100倍重量的純化水后在70 100°C的水浴中提取1 3h， 過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到IOOml容量瓶中，再將殘渣洗滌2 4次，該多次洗滌的溶液一并轉(zhuǎn)移 到容量瓶中定容，搖勻，作為樣品溶液，所述的樣品溶液中僅含有靈芝螺旋藻中的多糖；4)用硫酸苯酚法測出樣品溶液中多糖的含量。上述的方法中，其特征在于所述樣品為靈芝螺旋藻片。上述的方法中，優(yōu)選地，所述的乙醇溶液濃度為80%。上述的方法中，所述水浴溫度為100°C。優(yōu)選地，上述硫酸苯酚法的具體步驟為1)取Iml樣品溶液置于20ml具塞試管中，加入1. Oml濃度為5%的苯酚溶液，然 后快速加入5. Oml的濃硫酸，靜置IOmin后，振蕩并且充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min， 使用紫外分光光度儀于490nm處測吸光度；2)測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密稱取干燥至恒重的葡萄糖或葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，制成0. Img/ ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0、0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、1. Oml體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于20ml 具塞試管中并分別補蒸餾水至1. Oml,同樣再加入1. Oml濃度為5%的苯酚溶液，然后快速 加入5. Oml濃硫酸，靜置IOmin后，振蕩并且充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min，使用紫外 分光光度儀在490nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算 得到回歸方程；3)將步驟1)中得到的樣品溶液的吸光度代入該回歸方程，計算樣品中粗多糖的含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于簡化了靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定的 步驟，并且測定的準(zhǔn)確率高，靈敏度高，常規(guī)實驗室均可應(yīng)用，并且彌補了市場上并沒有可 靠提取和測定靈芝螺旋藻保健品中粗多糖含量方法的空白。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，是將靈芝螺旋藻類保健食品、特別是不 含有糊精、淀粉等干擾物的靈芝螺旋藻類保健食品、尤其是其片劑研磨成細(xì)粉，精密稱量后 置于大容量離心管中，加入乙醇水溶液混勻，超聲提取、離心，棄去溶液；得到的沉淀物再 加入乙醇水溶液，震蕩混勻，超聲提取、離心，將沉淀加水后轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，沸水浴提取 后，過濾，再將濾液定容，以葡萄糖或葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液為對照，采用硫酸苯酚法測定粗多 糖的含量。具體步驟為(1)精密稱取靈芝螺旋藻樣品細(xì)粉0. 5 1. Og,加入30 60倍重量的濃度為 80 100%乙醇水溶液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20 40min，離心棄去溶液。 (2)將步驟1中得到的沉淀物再加入30 60倍的重量的濃度為80 100%的乙 醇水溶液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20 40min，離心棄去溶液。(3)將步驟2中得到的沉淀物加入30 100倍重量的純化水在70 100°C的水浴中提取1 3h，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到IOOml容量瓶中，再將殘渣洗滌2 4次，該多次洗滌 的溶液一并轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容，搖勻，作為樣品溶液。所述的樣品溶液僅含有靈芝螺旋藻 中的多糖。以上步驟即為提取靈芝螺旋藻中多糖的步驟。(4)用硫酸苯酚法測定樣品溶液中的粗多糖的含量。
其中硫酸苯酚法測定多糖含量的具體步驟為吸取Iml樣品溶液置于20ml具塞試 管中，加入1. Oml濃度為5%的苯酚溶液，然后快速加入5. Oml濃硫酸，靜置IOmin后，振蕩 并且充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min，使用紫外分光光度儀于490nm處測吸光度。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖或葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，制成0. lmg/ml的對照溶液，分別 取0,0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、l. Oml體積的溶液置于20ml具塞試管中并補蒸餾水至 1. Oml,同樣再加入1. Oml濃度為5 %的苯酚溶液，然后快速加入5. Oml濃硫酸，靜置IOmin 后，振蕩并且充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min，使用紫外分光光度儀在490nm處測定吸 光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合曲線得回歸方程。(5)將步驟(4)中得到的樣品溶液的吸光度代入回歸方程，計算樣品溶液中粗多 糖的含量，并且通過換算可得到樣品中粗多糖的含量。以下為測定靈芝螺旋藻片中吸光度的幾個具體實施例。實施例1 精密稱取靈芝螺旋藻片細(xì)粉0. 9552g，加入30g的濃度為80%乙醇溶液，振蕩攪拌 均勻，超聲提取40min，離心棄去溶液。沉淀再加入30g的80%濃度的乙醇溶液，振蕩攪拌 均勻，超聲提取40min，離心棄去溶液。將沉淀加入30ml純化水并且在100°C的水浴提取 3h，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到IOOml容量瓶中，殘渣洗滌4次，洗滌的溶液一并轉(zhuǎn)移到容量瓶定容， 搖勻，作為樣品溶液。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0. 1080g，加蒸餾水溶解并定容于IOOOml容 量瓶中，制成0. 108mg/ml的對照溶液，并且分別取該葡萄糖溶液0、0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml、 0. 8ml、1. Oml分別置于20ml具塞試管中并補蒸餾水至1. 0ml，加入1. 0ml5%的苯酚溶液，然 后快速加入5. Oml濃硫酸，靜置lOmin，振蕩充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min，用紫外分 光光度儀于490nm處測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表 計算擬合后得到回歸方程y = 6. 3148x-0. 0042，相關(guān)參數(shù)R2 = 0. 9993。吸取Iml樣品溶液與20ml具塞試管中，同法制備，用紫外分光光度儀于490nm處 測吸光度A = 0. 676，將樣品溶液吸光度帶入方程式可得樣品溶液中粗多糖的含量，并且將 mg/ml的單位換算成mg/g，即進(jìn)行樣品溶液和樣品之間的換算，計算得樣品中粗多糖的含 量為 11. 28mg/g。實施例2精密稱取靈芝螺旋藻片細(xì)粉0. 5016g，加入15g的濃度為80%的乙醇水溶液，振蕩 攪拌均勻，超聲提取20min，離心棄去溶液。沉淀物再加入15g的80%乙醇水溶液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20min，離心棄去溶液。沉淀加入50ml純化水100°C水浴提取lh，過濾，濾液轉(zhuǎn)移到IOOml容量瓶中，殘渣洗滌2次，洗滌溶液一并轉(zhuǎn)移到容量瓶定容，搖勻，作為樣品 溶液。吸取Iml樣品溶液于20ml的具塞試管中，同測定標(biāo)準(zhǔn)溶液方法制備，用紫外分光光 度儀于490nm處測吸光度A = O. 356，將樣品溶液吸光度帶入方程式即得到樣品溶液中粗多 糖的含量，將mg/ml的單位換算成mg/g，即進(jìn)行樣品溶液和樣品之間的換算，計算樣品中粗 多糖的含量為11.37mg/g。 盡管以上詳細(xì)地描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但是應(yīng)該清楚地理解，對于本領(lǐng)域 的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任 何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，其步驟包括1)稱取樣品細(xì)粉0.5～1.0g，加入30～60倍重量的濃度為80～100％乙醇溶液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20～40min，離心棄去液體；2)將步驟1中得到的沉淀物再加入30～60倍重量的濃度為80～100％的乙醇溶液，振蕩攪拌均勻，超聲提取20～40min，離心棄去液體；3)將步驟2中得到的沉淀物加入30～100倍重量的純化水后，在70～100℃的水浴中提取1～3h，過濾，將濾液轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，再將殘渣洗滌2～4次，該多次洗滌的溶液一并轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容，搖勻，作為樣品溶液，該樣品溶液僅含有靈芝螺旋藻中的多糖；4)用硫酸苯酚法測出樣品溶液中多糖的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，其特征在于所述樣品 為靈芝螺旋藻片。
3.如權(quán)利要求1所述的靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，其特征在于所述的乙 醇溶液濃度為80%。
4.如權(quán)利要求1所述的靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，其特征在于所述水浴 溫度為100°C。
5.如權(quán)利要求1所述的靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，其特征在于所述硫酸 苯酚法的具體步驟為1)吸取1ml樣品溶液置于20ml具塞試管中，加入1.0ml濃度為5%的苯酚溶液，然后 快速加入5. 0ml的濃硫酸，靜置lOmin后，振蕩并且充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min，使 用紫外分光光度儀于490nm處測吸光度；2)測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密稱取干燥至恒重的葡萄糖或葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，制成0.lmg/ml的 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0、0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、1. 0ml體積的該標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于20ml具 塞試管中并分別補蒸餾水至1. 0ml,同樣再加入1. 0ml濃度為5%的苯酚溶液，然后快速加 入5. 0ml濃硫酸，靜置lOmin后，振蕩并且充分混勻，置30°C水浴中反應(yīng)20min，使用紫外分 光光度儀在490nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線，得回歸方程；3)將步驟1)中得到的樣品溶液的吸光度代入回歸方程，計算樣品溶液中粗多糖的含 量，通過換算可得樣品中粗多糖的含量。
全文摘要
一種靈芝螺旋藻中粗多糖的提取和測定方法，精密稱量靈芝螺旋藻樣品置于大容量離心管中，加入乙醇水溶液混勻，超聲提取、離心、棄去溶液；得到的沉淀物再加入乙醇水溶液，震蕩混勻，超聲提取、離心，沉淀，加水后轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，沸水浴提取后，過濾，再將濾液定容，以葡萄糖或葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液為對照，采用硫酸苯酚法測定粗多糖的含量。該方法步驟簡單并且準(zhǔn)確、靈敏度高，特別適用于不含糊精、淀粉等干擾物的靈芝螺旋藻保健食品中粗多糖的提取和測定。
文檔編號G01N1/34GK101839863SQ201010109669
公開日2010年9月22日 申請日期2010年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者賈福懷, 邢曉偉, 黃金寶 申請人:寧波御坊堂生物科技有限公司