專利名稱：一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及牛奶中殘留抗生素的檢測方法，特別是
涉及一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法。
背景技術(shù)：
工業(yè)化奶牛養(yǎng)殖中，經(jīng)常使用抗生素治療牛乳腺炎和其他乳牛疾病，這些抗生素 不可避免地會轉(zhuǎn)移到最初幾天的牛乳中。牛乳中殘留的抗生素會對乳制品品質(zhì)帶來嚴(yán)重的 影響。世界糧農(nóng)組織(FA0)、世界衛(wèi)生組織(WHO)的食品法對牛奶中抗生素最高殘留限量都 有明確規(guī)定，歐盟亦對最大殘留量(MRL)作了詳細(xì)的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部2001年頒布實施了 《無公害食品生鮮牛乳行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》，對新鮮牛乳的衛(wèi)生指標(biāo)明確了"抗生素不得檢出"。
青霉素，因其高效、低毒是目前獸醫(yī)學(xué)臨床上應(yīng)用最受青睞的藥物之一。但青霉素 對乳酸菌的抑制作用與其他抗生素相比又是最強(qiáng)烈的，而且青霉素的熱穩(wěn)定性相當(dāng)好，超 過任何一種其他常用抗生素，一般的加熱殺菌處理不能將其完全破壞。牛奶生產(chǎn)中，如果使 用含有青霉素殘留的生鮮乳生產(chǎn)巴氏消毒奶和超高溫滅菌奶，產(chǎn)品中仍會有相當(dāng)量的青霉 素殘留；同時牛奶中青霉素殘留可能會導(dǎo)致人體的各種不良反應(yīng)，人體對青霉素類抗生素 藥物的敏感性下降，增加病原菌對藥物的耐藥性。 青霉素的檢測至今都是該領(lǐng)域的技術(shù)難點，原因是青霉素的水溶液不穩(wěn)定，會產(chǎn) 生降解，且結(jié)構(gòu)中不含活性基團(tuán)氨基。現(xiàn)有技術(shù)中，已應(yīng)用的青霉素殘留技術(shù)有微生物檢 測法如TTC法，理化檢測方法包括色譜法，以及免疫分析法等。上述方法在檢測精密度等 方面各有所長，有的靈敏度低、選擇性差；有的操作過程步驟較為繁瑣，有的需購置昂貴儀 器，但大都存在檢測耗時長、成本高的缺點，給乳品加工企業(yè)造成諸多不便。中國發(fā)明專利 200910041985. 1(CN101633948)公開的"牛奶中P _內(nèi)酰胺類抗生素殘留試劑盒檢測方法" 涉及的是一種以微生物為原理的檢測方法，與本發(fā)明有本質(zhì)的不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡便、成本低廉、檢測結(jié)果
準(zhǔn)確的牛奶中青霉素殘留量的檢測方法。 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。 —種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，包括以下步驟 1、青霉素的降解及荷移復(fù)合物的形成配制青霉素鈉濃度O. 01 100mg/L的標(biāo)準(zhǔn) 工作無水乙醇液，用稀HC1調(diào)至pH 2±0. 5或4±0. 5，沸水浴10 30min使其降解，得到降 解產(chǎn)物青霉胺或青霉烯酸，兩種降解產(chǎn)物再分別與濃度為1X10—3 10X10—3mol/L的苯醌 類物質(zhì)在常溫下反應(yīng)5 10min，得到荷移復(fù)合物，備用； 2、測定波長的選擇將步驟1得到的青霉胺荷移復(fù)合物在紫外分光光度計下測 定紫外最大吸收波長，或是將得到的青霉烯酸荷移復(fù)合物在熒光分光光度計下測定熒光 的激發(fā)和發(fā)射光譜；其中，所述的紫外吸收或是熒光的激發(fā)發(fā)射波長的測定選擇范圍為200nm 600nm ; 3、針對不同的荷移復(fù)合物分別計算吸收光強(qiáng)度與荷移復(fù)合物的線性范圍、回收 率、標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢測限和工作曲線； 4、樣品前處理將牛奶樣品與脫蛋白、脫脂肪沉淀劑混合均勻，在轉(zhuǎn)速800 3000r/min條件下離心分離3 10min，取上清液備用； 5、樣品測定取步驟4中的上清液，按照步驟1進(jìn)行降解、荷移反應(yīng)，得到相應(yīng)的荷 移復(fù)合物，再按照步驟2的要求測定紫外最大吸收波長或熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜，計算該 荷移復(fù)合物的吸收度，代入步驟3所得的該類荷移復(fù)合物的工作曲線中即可求得牛奶中青 霉素的殘留量。 步驟(1)中以水、甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種作為反應(yīng)介質(zhì)；所述的苯醌
類物質(zhì)為苯醌、甲氧基苯醌、四氯苯醌或四氰基對二次甲基苯醌中的一種。 步驟(4)中所述的脫蛋白、脫脂肪沉淀劑選自酸性乙腈(pH2)、三氯乙酸、鎢酸鈉、
醋酸鈉或醋酸鉛中的一種。其中，使用酸性乙腈或三氯乙酸時將其與牛奶等體積混合；使用
鎢酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉛時按牛奶重量的2 10%重量百分?jǐn)?shù)混合。 同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點 1、本發(fā)明解決了青霉素檢測的難點。由于青霉素本身紫外吸收很弱，無熒光，且
水溶液易降解，現(xiàn)有技術(shù)一直無法直接用紫外或熒光分光光度法測定牛奶中的青霉素殘留
量。本發(fā)明首創(chuàng)將青霉素降解后再與苯醌類物質(zhì)發(fā)生荷移反應(yīng)，反應(yīng)生成的青霉胺荷移復(fù)
合物具有強(qiáng)的紫外吸收能力，而青霉烯酸荷移復(fù)合物具有強(qiáng)的熒光吸收能力，從而一舉攻
克了這一技術(shù)難題，為乳品加工企業(yè)降低生產(chǎn)成本、減輕運(yùn)作風(fēng)險提供了保證； 2、檢測速度快，檢測范圍寬，靈敏度高，準(zhǔn)確率高，選擇性好，全部操作過程可在
40min內(nèi)完成; 3、無需購置昂貴的抗生素檢測儀器，只需配備低速離心機(jī)與紫外或熒光分光光度 計即可完成檢測； 4、操作方法簡單，對操作人員無特殊技術(shù)要求。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
實施例1 以下實施例中牛奶樣品均為牛奶生產(chǎn)企業(yè)收購的生鮮乳。 1、取100mL、0. 50mg/L青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)工作無水乙醇液于小燒杯中。用稀HC1調(diào)至 pH4，沸水浴10min，降解得到青霉烯酸。 2、取上述青霉素鈉降解物青霉烯酸3mL置于10mL比色管中，加入 3. 00mL5X10—3mol/L四氯苯醌無水乙醇溶液，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置10min， 得到荷移復(fù)合物。 3、將上述荷移復(fù)合物溶液以323nm為激發(fā)波長，475nm為發(fā)射波長測定荷移反應(yīng) 產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，同時做空白試驗。 4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟分別進(jìn)行荷 移熒光測定，其線性回歸方程為A = 0. 04568C+0. 058，線性范圍0. 05mg/L-100mg/L，相關(guān)系
4數(shù)r = 0. 9990，回收率95% -103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2. 6% (n = 6)，檢測限0. 05mg/L。
5、加標(biāo)準(zhǔn)回收試驗，分別將100mL牛奶樣品、5g醋酸鈉與5mL、 10mL、20mL 0. 50mg/L青霉素鈉混合，在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進(jìn)行，進(jìn)行加標(biāo)回收測定，平均回收率(n = 3)為91.4%。 6、取含青霉素鈉抗生素的牛奶樣品100mL與5g醋酸鈉在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進(jìn)行，測定熒光吸收強(qiáng)度，帶入步驟4的回歸方程，求出青霉素濃度為12. 3mg/L。 該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實施例2 : 1、取100mL、0. 50mg/L青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)工作無水乙醇液于小燒杯中。用稀HC1調(diào)至pH2，沸水浴20min，降解得到青霉胺。 2、取上述青霉素鈉降解物青霉胺3mL置于10mL比色管中，加入5. OOmL1X10—3mol/L四氯苯醌無水乙醇溶液，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置5min，得到荷移復(fù)合物。 3、將上述荷移復(fù)合物溶液以400nm為紫外吸收波長測定荷移反應(yīng)產(chǎn)物的紫外強(qiáng)度，同時做空白試驗。4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟進(jìn)行荷移紫外測定，其線性回歸方程為A = 0. 03901C+0. 04821，線性范圍0. 5mg/L-50mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0. 9991，回收率97% _101%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2. 3% (n = 6)，檢測限0. 5mg/L。
5、取含青霉素鈉抗生素的牛奶樣品100mL與5g醋酸鈉在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進(jìn)行，測定紫外吸收強(qiáng)度，帶入步驟4的回歸方程，求出青霉素濃度為3. 5mg/L。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實施例3 :
1、同實例1。 2、取上述3mL的青霉素鈉降解物于10mL比色管中，加入3. OOmL 5X10—^01/L對苯醌丙酮溶液，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，室溫下放置10min。 3、將上述溶液以335nm為激發(fā)波長，460nm為發(fā)射波長測定荷移反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，同時做空白試驗。4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟進(jìn)行荷移熒光測定，，其線性回歸方程為A = 0. 06412C+0. 07634，線性范圍0. lmg/L-50mg/L，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9992，回收率97% _103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2. 8% (n = 6)，檢測限0. lmg/L。
5、取含青霉素鈉抗生素的牛奶樣品100mL與5g醋酸鈉在3000r/min條件下離心3min，取上清液5mL按步驟1、2、3進(jìn)行，測定熒光吸收強(qiáng)度，帶入步驟3的回歸方程，求出青霉素濃度為4. lmg/L。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
實施例4 :
1、同實例1。 2、將實例2中的四氯苯醌無水乙醇溶液換成對苯醌丙酮溶液，其余相同。
3、將實例2中的紫外吸收波長換成320nm。4、取步驟1的降解青霉素溶液lmL、5mL、10mL、20mL、30mL，按2、3步驟進(jìn)行荷移紫外測定，其線性回歸方程為A = 0. 08124C+0. 0126，線性范圍0. 5mg/L-50mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0. 9990，回收率95% _103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2. 5% (n = 6)，檢測限0. lmg/L。
5、取含青霉素抗生素的牛奶樣品20mL與三氯乙酸20mL在2500r/min條件下離心5min，取上清液5mL按步驟1、2、3進(jìn)行，測定紫外吸收強(qiáng)度，帶入步驟4的回歸方程，求出青霉素濃度為1. 4mg/L。該法檢測結(jié)果與用GB-19301-2003檢測結(jié)果一致。
權(quán)利要求
一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，包括以下步驟(1)青霉素的降解及荷移復(fù)合物的形成配制青霉素鈉濃度0.01～100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作無水乙醇液，用稀HCl調(diào)至pH 2±0.5或4±0.5，沸水浴10～30min使其降解，得到降解產(chǎn)物青霉胺或青霉烯酸，兩種降解產(chǎn)物再分別與濃度為1×10-3～10×10-3mol/L的苯醌類物質(zhì)在常溫下反應(yīng)5～10min，得到荷移復(fù)合物，備用；(2)測定波長的選擇將步驟1得到的青霉胺荷移復(fù)合物在紫外分光光度計下測定紫外最大吸收波長，或是將得到的青霉烯酸荷移復(fù)合物在熒光分光光度計下測定熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜；其中，所述的紫外吸收或是熒光的激發(fā)發(fā)射波長的測定選擇范圍為200nm～600nm；(3)針對不同的荷移復(fù)合物分別計算吸收光強(qiáng)度與荷移復(fù)合物的線性范圍、回收率、標(biāo)準(zhǔn)偏差、檢測限和工作曲線；(4)樣品前處理將牛奶樣品與脫蛋白、脫脂肪沉淀劑混合均勻，在轉(zhuǎn)速800～3000r/min條件下離心分離3～10min，取上清液備用；(5)樣品測定取步驟4中的上清液，按照步驟1進(jìn)行降解、荷移反應(yīng)，得到相應(yīng)的荷移復(fù)合物，再按照步驟2的要求測定紫外最大吸收波長或熒光的激發(fā)和發(fā)射光譜，計算該荷移復(fù)合物的吸收度，代入步驟3所得的該類荷移復(fù)合物的工作曲線中即可求得牛奶中青霉素的殘留量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，其特征在于步驟(1)中，以水、甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種作為反應(yīng)介質(zhì)；所述的苯醌類物質(zhì)為苯醌、甲氧基苯醌、四氯苯醌或四氰基對二次甲基苯醌中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，其特征在于步驟(4)中所述的脫蛋白、脫脂肪沉淀劑選自酸性乙腈(pH2)、三氯乙酸、鎢酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉛中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測牛奶中青霉素殘留量的方法，其特征在于當(dāng)使用酸性乙腈或三氯乙酸時將其與牛奶等體積混合；使用鎢酸鈉、醋酸鈉或醋酸鉛時按牛奶重量的 2 10%重量百分?jǐn)?shù)混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測牛奶中青霉素殘留量的方法。配制青霉素鈉標(biāo)準(zhǔn)工作無水乙醇液，用稀HCl調(diào)至pH 2±0.5或4±0.5，沸水浴得到降解產(chǎn)物青霉胺或青霉烯酸，兩種降解產(chǎn)物再分別與苯醌類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，得到荷移復(fù)合物，計算不同荷移復(fù)合物的工作曲線。檢測時以同樣的方法計算牛奶樣品的荷移復(fù)合物的吸收度，代入該類荷移復(fù)合物的工作曲線中即可求得牛奶中青霉素的殘留量。本發(fā)明率先實現(xiàn)了直接用紫外或熒光分光光度法測定牛奶中的青霉素殘留量。該方法檢測速度快，檢測范圍寬，靈敏度高，準(zhǔn)確率高，選擇性好，無需購置昂貴的抗生素檢測儀器，操作方法簡單，為乳品加工企業(yè)降低生產(chǎn)成本、減輕運(yùn)作風(fēng)險提供了保證，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/64GK101776591SQ20101010937
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者楊亞玲, 耿衛(wèi)東 申請人:云南健牛生物科技有限公司