專(zhuān)利名稱(chēng)：纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物的檢測(cè)以及產(chǎn)生和用于癌的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的相關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及生產(chǎn)針對(duì)纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)的抗體群的方法和涉及針對(duì)纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)的抗體群的產(chǎn)生，涉及抗體群本身和涉及相關(guān)的使用方法，涉及通過(guò)免疫化學(xué)測(cè)量血清中的FDP的量檢測(cè)癌和用于監(jiān)測(cè)癌治療的進(jìn)展。
背景技術(shù)：
盡管對(duì)癌的理解有新的進(jìn)展，但當(dāng)前用于癌的篩查和識(shí)別的技術(shù)留有改進(jìn)的空間。本領(lǐng)域中已知的用于篩查癌的方法試圖通過(guò)使用抗體來(lái)檢測(cè)癌相關(guān)抗原。抗原是大分子(例如蛋白、核酸或多糖)，其能在體內(nèi)引起免疫應(yīng)答。哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物的免疫系統(tǒng)具有檢測(cè)外源因子(例如與癌相關(guān)的抗原)和通過(guò)產(chǎn)生下述抗體而對(duì)這些外源因子應(yīng)答的能力，所述抗體特異地靶向那些癌相關(guān)抗原并與那些癌相關(guān)抗原反應(yīng)。因而，在哺乳動(dòng)物的循環(huán)血液中的這些癌相關(guān)抗原或靶向這些抗原的循環(huán)抗體的檢測(cè)與在該個(gè)體中的癌的存在之間有強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。因此，檢測(cè)此類(lèi)抗原或抗體的存在的試驗(yàn)在癌的篩查和診斷中是有用的。一種有前途的癌相關(guān)抗原靶是由纖維蛋白和纖維蛋白原二者的降解產(chǎn)物(FDP) 組成的庫(kù)(pool)。雖然纖維蛋白和纖維蛋白原二者的降解產(chǎn)物的產(chǎn)生在健康個(gè)體中是被限制的，但當(dāng)癌細(xì)胞釋放出蛋白水解酶(例如纖溶酶和凝血酶)時(shí)，F(xiàn)DP在癌患者中是過(guò)量產(chǎn)生的。此外，F(xiàn)DP被作為其他的癌相關(guān)過(guò)程(例如血管生成和轉(zhuǎn)移)的副產(chǎn)物產(chǎn)生。因?yàn)?FDP從腫瘤滲漏到周?chē)后w中，在患有膀胱癌的受試者的尿中、在肺癌受試者的血漿中和在其他癌患者的血漿或血清中可測(cè)量到升高的FDP水平。FDP測(cè)量在癌診斷中的效用已被猜想了多年；但還沒(méi)有發(fā)展出具有所需的敏感性的能定量測(cè)量FDP的精制化的檢驗(yàn)。當(dāng)前的 FDP檢驗(yàn)通常被限制于測(cè)量作為該組的代表的一種特定的FDP組分，例如D- 二聚體。癌提高了纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)的水平，這都是通過(guò)產(chǎn)生纖維蛋白原降解產(chǎn)物和纖維蛋白降解產(chǎn)物二者的組織因子(TF)和尿激酶型纖溶酶原激活劑 (uPA)調(diào)控途徑(

圖1)。通過(guò)纖溶酶切割纖維蛋白原產(chǎn)生作為初級(jí)末端產(chǎn)物的片段D和E。 凝血酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，作為對(duì)來(lái)自凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的信號(hào)的響應(yīng)。通過(guò)纖溶酶切割纖維蛋白產(chǎn)生作為初級(jí)末端產(chǎn)物的D-二聚體。通過(guò)癌誘導(dǎo)的纖溶酶切割產(chǎn)生的FDP 的組成受兩種底物——纖維蛋白和纖維蛋白原的相對(duì)量影響。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開(kāi)了用于癌的檢測(cè)的方法，其包括對(duì)含有三種基本片段類(lèi)型(片段D、片段 E和D- 二聚體)和任選地額外的三種片段類(lèi)型(片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物-IPDP的兩種可辨別形式)總計(jì)六種FDP組分的纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)的確定混合物的同步檢測(cè)。方法包括用特異性多克隆抗體庫(kù)對(duì)生物樣品中的三種基本FDP抗原進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，其中所述多克隆抗體對(duì)三種FDP片段是特異性的。在本公開(kāi)的一種實(shí)施方式中，提供了用于檢測(cè)受試者中的癌的方法，所述方法包括下述步驟從受試者中獲得生物樣品；使生物樣品與抗體制劑反應(yīng)，所述抗體制劑結(jié)合與纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)相關(guān)的至少三種抗原，以形成抗體-FDP復(fù)合物， 其中三種FDP相關(guān)的抗原是片段D、片段E和D- 二聚體；檢測(cè)抗體-FDP復(fù)合物；并診斷受試者中的癌。在另一實(shí)施方式中，抗體制劑額外地任選地與片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物 (IPDP)中的至少一種結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗體制劑是多克隆抗體制劑。在另一實(shí)施方式中，所述方法包括酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)。在另一實(shí)施方式中，診斷步驟還包括至少一種額外的診斷測(cè)試。在本公開(kāi)的一種實(shí)施方式中，提供了用于監(jiān)測(cè)患者中的癌的方法，其包括下述步驟(a)從受試者中獲得第一生物樣品，所述第一樣品在第一取樣時(shí)間點(diǎn)收集；(b)從受試者中獲得第二生物樣品，所述第二樣品在第一取樣時(shí)間點(diǎn)之后的第二取樣時(shí)間點(diǎn)收集； (c)使生物樣品與抗體制劑反應(yīng)，所述抗體制劑結(jié)合與FDP相關(guān)的至少三種抗原，以形成抗體-FDP復(fù)合物，其中三種FDP相關(guān)抗原是片段D、片段E和D- 二聚體；(d)檢測(cè)抗體-FDP 復(fù)合物；(e)確定第二生物樣品中的FDP水平與第一生物樣品中的FDP水平的比率；(f)對(duì)癌發(fā)展進(jìn)行判斷；并任選地用在第一和第二時(shí)間點(diǎn)后的時(shí)間點(diǎn)下得到的額外的生物樣品重復(fù)步驟(a)-(e)。在另一實(shí)施方式中，抗體制劑額外地任選地與片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物 (IPDP)中的至少一種結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗體制劑是多克隆抗體制劑。在另一實(shí)施方式中，所述方法包括酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)。在另一實(shí)施方式中，如果比率高于或等于1. 15，癌已進(jìn)展。還在另一實(shí)施方式中， 如果比率小于1. 15，癌已退化(regress)或是穩(wěn)定的。在本公開(kāi)的一種實(shí)施方式中，提供了用于檢測(cè)受試者中的癌的試劑盒，所述試劑盒包含結(jié)合與FDP相關(guān)的至少三種抗原的抗體制劑，其中所述三種FDP相關(guān)抗原是片段D、 片段E和D- 二聚體；檢測(cè)系統(tǒng)；和用于測(cè)量FDP和使FDP的存在與癌關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)；在另一實(shí)施方式中，檢測(cè)系統(tǒng)包含特異性針對(duì)與FDP相關(guān)的至少三種抗原的檢測(cè)抗體，其中所述三種FDP相關(guān)抗原是片段D、片段E和D- 二聚體。在另一實(shí)施方式中，抗體制劑任選地額外地與片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物(IPDP)中的至少一種結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，抗體和檢測(cè)系統(tǒng)包含酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)。附圖簡(jiǎn)述圖1描繪了癌誘導(dǎo)的纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)的產(chǎn)生的示意圖。圖2描繪了多個(gè)FDP免疫原批次(指定為03、13、15、17、19、21、對(duì)和25的8個(gè)批次)的非還原性(圖2A)和還原性(圖2B) SDS-PAGE凝膠。UD指未消化的纖維蛋白原；D 指片段D;E指片段E。圖3描繪了與來(lái)自結(jié)腸直腸癌(CRC)患者血清(n = 5)和正常對(duì)照血清(n = 5) 的人血清樣品結(jié)合的抗-FDP抗體的Western印跡分析(圖3A 曝光到膠片上大約5秒， 圖:3B 曝光到膠片上大約30秒)。圖3C描繪了描繪每個(gè)泳道負(fù)載的蛋白總量的陪伴凝膠 (companion gel)的考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Blue)染色。在凝膠上指出了 FDP亞型的位置。
圖4描繪了使用抗-FDP多克隆抗體庫(kù)⑴和結(jié)合兔IgG(-)的珠粒的來(lái)自人血清 (正常和CRC患者)的抗原的免疫沉淀(IP)。測(cè)試了三個(gè)樣品FDP標(biāo)定物對(duì)照(FDP)、正常人血清(N4)和CRC血清(C15)。圖5描繪了使用抗-FDP多克隆抗體庫(kù)(圖5A)或結(jié)合兔IgG(對(duì)照)的珠粒(圖 5B)從五個(gè)CRC和五個(gè)正?；颊叩难逯忻庖叱恋淼腇DP抗原。發(fā)明詳述纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)的檢測(cè)可以是許多癌中的有價(jià)值的臨床診斷工具。FDP水平與癌發(fā)生、階段、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)聯(lián)。當(dāng)前的FDP測(cè)試通常被限制于測(cè)量作為該組的代表的一種特定的FDP組分，例如D-二聚體。相反，本發(fā)明人已確定，許多纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物必須被同時(shí)測(cè)量，以使FDP的存在或FDP水平的變化分別與癌的存在或發(fā)展相關(guān)聯(lián)。就本公開(kāi)的目的而言，短語(yǔ)“癌的發(fā)展”包括患者中的癌的發(fā)展、退化或復(fù)發(fā)(re-occurrence)。本發(fā)明公開(kāi)的檢驗(yàn)使用了特異地識(shí)別至少三種FDP抗原的抗體制劑，所述FDP抗原在癌的檢測(cè)和癌發(fā)展的監(jiān)測(cè)中是特別有用的。這三種基本的FDP是片段D、片段E和D- 二聚體(也稱(chēng)為片段X)。用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)癌的有用的三種額外的FDP 是通過(guò)測(cè)序確定的兩種初始纖溶酶消化產(chǎn)物(IPDP)和片段Y。在即時(shí)方法的一個(gè)實(shí)施方式中，三種基本的FDP抗原在同一檢驗(yàn)中被大致同時(shí)地檢測(cè)。在其他實(shí)施方式中，四種、五種或六種FDP抗原在同一檢驗(yàn)中被同時(shí)檢測(cè)。在一種實(shí)施方式中，所公開(kāi)的檢驗(yàn)測(cè)量片段D、片段E和D-二聚體。在另一實(shí)施方式中，所公開(kāi)的檢驗(yàn)測(cè)量片段D、片段E、D-二聚體以及一種或二種IPDP。在另一實(shí)施方式中，所公開(kāi)的檢驗(yàn)測(cè)量片段D、片段E、D-二聚體和片段Y。在另一實(shí)施方式中，所公開(kāi)的檢驗(yàn)測(cè)量片段D、片段E、D- 二聚體、片段Y和一種或兩種IPDP。免疫檢驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的并且本文公開(kāi)的親和純化的抗-FDP抗體可被用在不同的檢驗(yàn)方法中，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)(ELISA)、斑點(diǎn)或狹縫印跡、捕獲分析物的瓊脂糖珠粒系統(tǒng)或各種快速測(cè)試形式例如側(cè)流式系統(tǒng)或穿流式系統(tǒng)。本發(fā)明描述的方法的一個(gè)特別的特征是，捕獲和/或檢測(cè)抗體能與三種、四種、五種或六種FDP抗原特異地結(jié)合?？贵w制劑在本文中是指抗體庫(kù)，以體現(xiàn)抗體制劑含有多種抗體特異性。在一種實(shí)施方式中，抗體制劑是針對(duì)含有三種、四種、五種或六種FDP抗原種的免疫原制劑培育的多克隆抗體制劑。多克隆抗體可在包括但不限于兔、山羊、馬、驢、綿羊、雞或鯊魚(yú)的多種物種中產(chǎn)生。在另一實(shí)施方式中，針對(duì)三種、四種、五種或六種FDP抗原中的每一種生產(chǎn)的抗體制劑可獨(dú)立制備并合并在一起，以形成抗-FDP的抗體庫(kù)。而且，在其他實(shí)施方式中，抗體制劑可包含單克隆、單一特異性多克隆、嵌合或人源化抗體或抗體片段的庫(kù)，其中，每種抗體與六種FDP抗原中的一種或多種反應(yīng)，只要在同一檢驗(yàn)中所述抗體庫(kù)能與三種、四種、五種或六種FDP抗原大致同時(shí)反應(yīng)。此類(lèi)抗體的制備是本領(lǐng)域熟知的并且將不在本公開(kāi)中詳細(xì)描述。本公開(kāi)還包括用于結(jié)合FDP并檢測(cè)受試者中的癌的存在或監(jiān)測(cè)受試者中的癌的發(fā)展的系統(tǒng)和試劑盒。在一種實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含抗體庫(kù)和檢測(cè)試劑，用于結(jié)合并檢測(cè)生物樣品中的三種、四種、五種或六種FDP并使三種、四種、五種或六種FDP抗原的存在與受試者中的癌的存在或發(fā)展關(guān)聯(lián)。在一種實(shí)施方式中，試劑盒包含抗體庫(kù)和檢測(cè)試劑，用于結(jié)合并檢測(cè)生物樣品中的三種、四種、五種或六種FDP并用于使三種、四種、五種或六種FDP的存在與受試者中的癌的存在或發(fā)展關(guān)聯(lián)。在另一實(shí)施方式中，試劑盒可含有在包裝(package)或容器中的下述的一種或多種(1)結(jié)合三種、四種、五種或六種FDP以從生物樣品捕獲FDP的一個(gè)或多個(gè)抗體庫(kù)；( 檢測(cè)抗體；C3)用于固定(a)抗體庫(kù)或(b)檢測(cè)抗體中的至少一種的固相載體 (solid support) ； (4)檢測(cè)試劑；(5)洗滌液；和(6)對(duì)于使用試劑盒組件(component)和生物樣品進(jìn)行檢驗(yàn)的指導(dǎo)?？墒褂闷渲薪M件(1)-(6)中的兩個(gè)或多個(gè)被發(fā)現(xiàn)于同一容器中的實(shí)施方式。當(dāng)試劑盒被提供時(shí)，不同的試劑可被包裝在單獨(dú)的容器中并在使用前立即混合或附到固相載體上。此種組件的單獨(dú)包裝可允許長(zhǎng)期儲(chǔ)存而不會(huì)喪失活性組件的功能。包括在具體試劑盒中的組合物可在任何類(lèi)型的容器中提供，使得不同組件的壽命可被維持并且不會(huì)被容器的材料吸收或改變。如上述，試劑盒還可提供有指導(dǎo)性材料。指導(dǎo)可打印在紙或其他基材上，和/或可作為電子可讀介質(zhì)(例如軟盤(pán)、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盤(pán)、錄像帶、錄音帶、閃存設(shè)備等等) 提供。詳細(xì)的指導(dǎo)可以不與試劑盒物理上相關(guān)；代之以，使用者可到由試劑盒的制造商或發(fā)行者指定的因特網(wǎng)網(wǎng)站上，或作為電子郵件提供。此外，所要求保護(hù)的方法、系統(tǒng)和試劑盒可被用來(lái)檢測(cè)來(lái)自包括但限于血清、全血、血漿、唾液、痰、尿、腹腔液、腫瘤組織、腦脊液、陰道或直腸分泌物和淚液的各種來(lái)源的生物樣品中的癌相關(guān)FDP。當(dāng)使用作為癌的篩查的檢驗(yàn)方法時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須建立其自己的正常范圍和異常范圍，這基于當(dāng)?shù)胤N群研究。實(shí)施例11提供了正常和癌患者樣品的典型分布。通過(guò)鑒別出超過(guò)正常范圍預(yù)定的數(shù)目的那些樣品，將來(lái)自被懷疑患有癌的患者的生物樣品中的FDP 水平與癌的存在關(guān)聯(lián)。當(dāng)使用檢驗(yàn)方法用于監(jiān)測(cè)有證實(shí)的癌癥診斷的患者時(shí)，基準(zhǔn)讀數(shù)應(yīng)先于他們的 FDP水平的評(píng)估。初始血清抽取物的FDP值作為基準(zhǔn)讀數(shù)。通過(guò)構(gòu)建下述比率(R)，評(píng)估連續(xù)的血清提取的值；其中a =初始FDP值并且b =當(dāng)前FDP值。R = b/a在當(dāng)前FDP值相對(duì)于基準(zhǔn)FDP的比率高于1. 15時(shí)，患者可能有疾病發(fā)展，但測(cè)試的FDP抗原的結(jié)果應(yīng)與其他臨床形態(tài)(modality)結(jié)合使用，所述臨床形態(tài)是用于監(jiān)測(cè)這些癌患者中的疾病發(fā)展的監(jiān)護(hù)標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例除非另外指出，按照制造商的指導(dǎo)使用在實(shí)施例中涉及的商購(gòu)試劑。實(shí)施例1FDP免疫原的制備通過(guò)購(gòu)買(mǎi)含有纖維蛋白和纖維蛋白原二者(就該過(guò)程的目的而言，其被稱(chēng)為纖維蛋白/纖維蛋白原)的經(jīng)純化的人纖維蛋白原產(chǎn)物，制備FDP免疫原。然后通過(guò)Haverkate 和Timan過(guò)程(Thromb. Res. 10 =803-812,1977)使纖維蛋白/纖維蛋白原與纖溶酶反應(yīng)，以形成纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)。通過(guò)將反應(yīng)運(yùn)行(rim)特定的一段時(shí)間并接著用蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)停止反應(yīng)來(lái)控制纖溶酶降解纖維蛋白/纖維蛋白原。
具體地，使用下述過(guò)程使用50ml錐形管，將20ml的MOPS緩沖液(5mM的3- (N-嗎啉代)丙磺酸，PH 7. 4，含有0. IM的氯化鈉和20mM的氯化鈣)在37°C的溫育器中溫育直到溶液達(dá)到37°C的溫度(大約20-25分鐘)并將經(jīng)純化的人纖維蛋白/纖維蛋白原添加到溫的MOPS緩沖液中并在37°C下攪拌直到溶解。將PH 7. 4的一毫升的PBS添加到纖溶酶中來(lái)重建，然后將5單位的纖溶酶添加到在MOPS溶液中的纖維蛋白/纖維蛋白原中。然后將該混合物在37°C的溫育器中攪拌3小時(shí)。消化的FDP被從搖瓶中去除，并添加200 μ 1的蛋白酶抑制劑混合物并將溶液完全混合。接著測(cè)量濃縮原液FDP溶液的總蛋白濃度，在變性和還原條件下，F(xiàn)DP分解產(chǎn)物標(biāo)志在4-20%梯度SDS-PAGE上被驗(yàn)證(見(jiàn)圖幻。產(chǎn)生的FDP 溶液在-40°C下存儲(chǔ)。FDP免疫原還被用在抗體的免疫親和純化中并在FDP檢測(cè)系統(tǒng)中用作為FDP標(biāo)定物和對(duì)照。實(shí)施例2兔抗-FDP抗體的產(chǎn)牛用根據(jù)實(shí)施例1制備的FDP免疫原使兔免疫。每只兔接受由在1. 0到1. 5ml的磷酸鹽緩沖液中的Img免疫原和等體積的弗氏完全佐劑組成的乳液的注射，用于第一次免疫。注射后三周，將每只兔放血并針對(duì)抗FDP的抗體檢測(cè)血清。放血后一周，通過(guò)注射在1 到1. 5ml的磷酸鹽緩沖液中的Img免疫原和等體積的弗氏不完全佐劑組成的乳液，給予每只兔加強(qiáng)免疫。根據(jù)加強(qiáng)免疫和放血方案喂養(yǎng)兔，直到它們不再能活。通過(guò)使用96孔板系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)價(jià)效檢驗(yàn)，檢驗(yàn)在免疫接種后不同時(shí)間間隔下獲得的兔血清的抗FDP的抗體的濃度。在典型的血清價(jià)效檢驗(yàn)中，使10 μ g的免疫原固定在96 孔微量滴定板的孔中；用FBS封閉；然后與各種兔血清的一系列1 1稀釋物反應(yīng)；洗滌； 用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的山羊抗-兔抗體(Sigma)檢測(cè)；洗滌；用3,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液溫育；停止溶解并在OD 450nm下讀數(shù)。通過(guò)將0D450nm值對(duì)稀釋倍數(shù)作圖來(lái)確定效價(jià)；然后確定曲線(xiàn)的拐點(diǎn)。兔抗-FDP如實(shí)施例6中那樣被免疫親和純化。實(shí)施例3雞抗-FDP抗體的產(chǎn)生用根據(jù)實(shí)施例1制備的FDP免疫原使雞免疫。每只雞接受由在1. 0到1. 5ml的磷酸鹽緩沖液中的Img免疫原和等體積的弗氏完全佐劑組成的乳液的注射，用于第一次免疫 (第0天)。在第35、56、77和98天給予每只雞額外的免疫接種。這些雞在第沈、40、60、81 和100天被放血(收集血清)。血清應(yīng)答測(cè)試在第45天開(kāi)始。在第53天出現(xiàn)IgY的第一次收獲物。在第56天開(kāi)始第一次親和純化。通過(guò)使用96孔板系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)在免疫接種后不同時(shí)間間隔下獲得的雞血清的抗FDP的抗體的濃度。在檢驗(yàn)之前，雞抗-FDP的IgY抗體的亞組被綴合到 HRP上。在典型的血清效價(jià)檢測(cè)中，使10 μ g的免疫原固定在96孔微量滴定板的孔中；用 FBS封閉；然后與各種雞血清的一系列1 1稀釋物反應(yīng)；洗滌；用TMB溶液溫育；停止溶解并在OD 450nm下讀數(shù)。通過(guò)將OD 450nm值對(duì)稀釋倍數(shù)作圖來(lái)確定效價(jià)；然后確定曲線(xiàn)的拐點(diǎn)。雞抗-FDP如實(shí)施例6中那樣被免疫親和純化。
實(shí)施例4山羊抗-FDP抗體的產(chǎn)牛用根據(jù)實(shí)施例1制備的FDP免疫原使山羊免疫。每只山羊接受由在1. 0到1. 5ml 的磷酸鹽緩沖液中的Img免疫原和等體積的弗氏完全佐劑組成的乳液的注射，用于第一次免疫。注射后三周，將每只山羊放血并檢驗(yàn)血漿的針對(duì)FDP的抗體。放血后一周，通過(guò)注射由在1. 0到1. 5ml的磷酸鹽緩沖液中的Img免疫原和等體積的弗氏不完全佐劑組成的乳液，給予每只山羊加強(qiáng)免疫。根據(jù)加強(qiáng)免疫和放血方案喂養(yǎng)山羊，直到它們不再能活。通過(guò)使用96孔板系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)在免疫接種后不同時(shí)間間隔下獲得的山羊血清的抗FDP的抗體的濃度。在典型的血清效價(jià)檢驗(yàn)中，使10 μ g的免疫原固定在 96孔微量滴定板的孔中；用FBS封閉；然后與各種山羊血清的一系列1 1稀釋物反應(yīng)；洗滌；用偶聯(lián)HRP的兔抗-山羊抗體的(Sigma)檢測(cè)；洗滌；用TMB溶液溫育；停止溶解并在 0D450nm下讀數(shù)。通過(guò)將OD 450nm值對(duì)稀釋倍數(shù)作圖來(lái)確定效價(jià)；然后確定曲線(xiàn)的拐點(diǎn)。山羊抗-FDP如實(shí)施例6中那樣被免疫親和純化。實(shí)施例5偶聯(lián)FDP的SeDharose瓊脂糖CL 4B的制備用10倍瓊脂糖(kpharose)凝膠體積(即20ml瓊脂糖凝膠的10倍，其等于 200ml)的PH 7. 5磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌高碘酸鹽氧化的瓊脂糖CL4B QOml)。將洗滌過(guò)的并排水的瓊脂糖CL 4B與20ml (1倍凝膠體積)的2. Omg/ml的合并的FDP抗原溶液(在 MOPS中的FDP，見(jiàn)實(shí)施例1)反應(yīng)。將3. 5毫升(凝膠體積的1/6)在去離子(DI)水中的0. IM 氰基硼氫化鈉添加到該懸浮液中并且在室溫下?lián)u動(dòng)懸浮液16-20小時(shí)。然后，將40ml (凝膠體積的2倍)的在PH 7. 5的PBS中的0. IM甘氨酸和0. IM氰基硼氫化鈉添加到懸浮液中并且在室溫下繼續(xù)攪拌懸浮液另外的2小時(shí)。FDP-偶聯(lián)的瓊脂糖CL 4B凝膠被脫氣15 分鐘并接著通過(guò)重力流被裝填在色譜柱中。用下述溶液順序洗滌凝膠DI水(10倍凝膠體積)、PH為7. 5的PBS (10倍凝膠體積)、含有0. 5M NaCl的PBS (10倍凝膠體積)、PH為3 的0. IM乙酸鈉/0. 15M NaCl (10倍凝膠體積)、PH 7. 5的PBS (10倍凝膠體積)。當(dāng)不使用時(shí)，將凝膠存儲(chǔ)在4°C下含有0. 疊氮化鈉的PBS中至多1周。實(shí)施例6抗FDP的多克隆抗體的免疫親和純化在使多克隆抗血清負(fù)載在如實(shí)施例5中制備的FDP-偶聯(lián)的瓊脂糖kpharose CL 4B凝膠柱上之前，將多克隆抗血清過(guò)濾通過(guò)0. 2μπι的針式過(guò)濾器。添加的經(jīng)過(guò)濾的多克隆抗血清的體積大約等于凝膠的體積(1倍凝膠體積)。多克隆抗血清被添加之后，用PBS(5 倍凝膠體積)并接著用含有0. 5M NaCl的PBS (5倍凝膠體積)，再次洗滌FDP-偶聯(lián)的瓊脂糖CL 4B凝膠柱。用PH為3的0. IM乙酸鈉/0. 15M NaCl洗脫與在柱上的FDP結(jié)合的免疫親和純化的抗-FDP抗體。洗脫液被收集在分級(jí)管(fraction tube)中用于監(jiān)測(cè)，并且具有可檢測(cè)的蛋白濃度(0D 280nm大于0.2)的隨后的那些級(jí)分被轉(zhuǎn)移到PETG瓶中用于長(zhǎng)期存儲(chǔ)。通過(guò)添加PH為8. 5的IM的Tris緩沖液，中和所得的抗體溶液的PH。實(shí)施例7抗FDP的兔多克隆抗體的表征在一種實(shí)施方式中，捕獲抗體是親和純化的多克隆的針對(duì)FDP的兔抗體。兔被免疫并且如實(shí)施例3分離抗體。親和純化抗體的SDS-PAGE表明了高度的純度。在非還原的抗-FDP制劑中的主要的蛋白帶具有大約152kDa的分子量，其與兔IgG的分子量一致。當(dāng)還原時(shí)，152kDa的蛋白帶消失了，并且同時(shí)，出現(xiàn)了大約59kDa和30kDa的兩條蛋白帶，其分別與IgG分子的重鏈和輕鏈的分子量相似。因此，抗FDP抗體最初是IgG，不是IgM(M. W.大約900kDa)也不是 IgA (大約320kDa的二聚體)?；赟DS-PAGE分析，親和純化的FDP抗體庫(kù)的純度定性地被估算為大約90%。抗-FDP抗體與FDP抗原的結(jié)合遵循典型的Langmuir吸附等溫線(xiàn)。從該數(shù)據(jù)中， 使用雙倒數(shù)作圖，抗體的結(jié)合常數(shù)被計(jì)算為1.25X10—^。因?yàn)榭贵w制備劑是多克隆源，在該研究中獲得的結(jié)合常數(shù)是復(fù)合結(jié)合常數(shù)，即通過(guò)由不同克隆產(chǎn)生的抗體貢獻(xiàn)的平均結(jié)合常數(shù)。捕獲和檢測(cè)抗體確?；贓LISA的任何測(cè)試的特異性。在Western印跡(圖3) 和免疫沉淀(IP)兩種實(shí)驗(yàn)(圖4和5和表幻中，使FDP抗體庫(kù)與人血清樣品交叉反應(yīng)，以證實(shí)FDP抗體庫(kù)捕獲人血清樣品中的FDP。此外，通過(guò)FDP抗體庫(kù)免疫沉淀的蛋白被測(cè)序并使用質(zhì)譜鑒定。來(lái)自結(jié)腸直腸癌(CRC)和正常對(duì)照患者二者的人血清樣品的Western印跡分析被用來(lái)確定人血清中的FDP抗原的數(shù)目和估算分子量。圖3A和;3B描繪了分別曝光到膠片5 秒和30秒的相同凝膠的Western印跡。圖3C描繪了對(duì)應(yīng)的考馬斯染色的凝膠。在圖3 中，在CRC血清樣品中檢測(cè)出具有340J60-320、220、150、80和50kDa的估算分子量的六種主要的FDP抗原。這些環(huán)帶分別對(duì)應(yīng)于未消化的纖維蛋白原、初始纖溶酶消化產(chǎn)物(IPDP)、 片段D- 二聚體/片段X、片段Y、片段D和片段E。與之相對(duì)地，在正常的對(duì)照血清中僅檢測(cè)出在大約220kDa下的一條主要帶。就所有的測(cè)試的血清樣品而言，來(lái)自CRC患者的血清樣品中的反應(yīng)的強(qiáng)度比來(lái)自正常對(duì)照的血清樣品中的反應(yīng)的強(qiáng)度高得多。表1癌血清vs.正常血清中的抗-FDP交叉反應(yīng)性的分析
纖維蛋白原降解產(chǎn)物估算的MW面積來(lái)自各個(gè)受試者旳平均密度的平均值平均的平均密度的比率P-值(kDa)(in2)癌 n=5正常 n=5癌/正常未消化的& IPDP3400.150.34.012.65.1E-08IPDP260-3200.4150.74.136.71.3E-10片段X/片段 D-二聚體2200.2131.114.88.84.0E-10片段Y1500.277.45.115.25.4E-10片段D單體800.251.03.813.55.4E-09片段E單體500.239.13.311.95.0E-08
如在表1中所表明的，來(lái)自5個(gè)CRC患者的血清樣品中的這些FDP組分的所有六種的平均信號(hào)密度顯著(P-值彡0. 00000005)高于來(lái)自5個(gè)正常對(duì)照患者的平均信號(hào)密度。 在Western印跡(圖3A)中的交叉反應(yīng)水平的基于光密度測(cè)定的分析使用了 Scion影像光密度測(cè)定軟件(Scion公司)。表1確認(rèn)了抗-FDP庫(kù)可基于它們各自的FDP水平區(qū)分癌和正常的血清樣品。為了證實(shí)從人血清樣品捕獲的FDP抗原的數(shù)目和大小，使用結(jié)合到瓊脂糖珠粒上的兔抗-FDP IgG或?qū)φ胀肐gG進(jìn)行免疫沉淀研究(圖4和幻。免疫沉淀還濃縮了 FDP抗原，使得FDP抗原可從考馬斯染色的SDS-PAGE中測(cè)序。根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用Affl-Gel Hz免疫親和試劑盒(BIO-RAD)，通過(guò)在IgG重
鏈上的Fc部分中的保守碳水化合物部分，將兔抗-FDP IgG或?qū)φ胀肐gG抗體共價(jià)連接到 Sepharose瓊脂糖珠粒上。人血清樣品被隨機(jī)選擇并在PH為7. 4的PBS中稀釋1到10倍。 將稀釋的血清樣品用結(jié)合抗-FDP的珠粒或結(jié)合對(duì)照兔IgG的珠粒溫育。此外，兩種類(lèi)型的珠粒用預(yù)制的FDP的0. 25mg/ml溶液溫育，以用作IP反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。在稀釋的血清和結(jié)合對(duì)照兔IgG的珠粒之間IP的反應(yīng)用作識(shí)別在非特異性兔IgGs和血清抗原之間的假陽(yáng)性反應(yīng)的對(duì)照。IP反應(yīng)在翻轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)器上在4°C下整夜溫育。用PBS洗滌IP珠粒5次，并且抗原在非還原性L(fǎng)aemmli樣品緩沖液中、在95°C下被萃取8分鐘。接著，從抗-FDP和對(duì)照兔 IgG珠粒萃取的抗原在4-20% SDS-PAGE上運(yùn)行。圖4顯示了兩個(gè)代表性血清樣品的一整套的實(shí)驗(yàn)條件N4來(lái)自正常患者4并且C15來(lái)自結(jié)腸直腸癌患者15。通過(guò)在IP檢驗(yàn)中顯示五個(gè)額外的正?；颊吆臀鍌€(gè)額外的結(jié)腸直腸癌患者，圖5A和5B展示了這些IP反應(yīng)的再現(xiàn)性。在圖4中列出的IP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果展示了四種主要的FDP特異性抗原和一種非特異性抗原已由抗-FDP珠粒(+)從結(jié)腸直腸癌患者的血清中捕獲。從該樣品(C15(+)，從右第二條泳道)中，四種主要FDP特異性抗原的估算分子量(MW)以遞減的順序分別為340、300、 220和50kDa。在該泳道中的一種非特異性抗原大約是25kDa。血清樣品的對(duì)照泳道N4 (-) 和C15(_)(從右第三條和第五條泳道)也顯示了與25kDa蛋白的反應(yīng)，其與如在N4(+)和 C15(+)(從右第二條和第四條泳道)中所示的、暴露于抗-FDP珠粒(+)的N4和C15樣品中的25kDa蛋白相符合。在所有這些泳道N4(_)、N4(+)、C15(_)、C15(+)中的25kDa蛋白的存在，證實(shí)了從血清樣品的IP反應(yīng)提取的25kDa蛋白與結(jié)合任何IgG的珠粒非特異性相互作用。IP檢驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)被指定為FDP (-)和FDP (+)(從左第6條和第7條泳道)。珠粒對(duì)照泳道(FDP(-))表明在不是基于血清的FDP標(biāo)定物溶液和陰性對(duì)照珠粒之間沒(méi)有相互作用。FDP (+)反應(yīng)含有一條次要帶和三條主要帶。一條次要帶的估算MW是340kDa，其與未消化的纖維蛋白原的MW相符合。在FDP對(duì)照免疫原溶液中的三種主要FDP特異性抗原的估算的分子量是220kDa(其與纖維蛋白原片段X或D- 二聚體的MW相符合)、80kDa (其與纖維蛋白原片段D單體的MW相符合)和50kDa (其與纖維蛋白原片段E單體的相符合)。 抗-FDP珠粒從結(jié)腸直腸癌患者的人血清中捕獲四種主要的FDP抗原；而在正常血清中同樣的珠粒僅帶來(lái)在大約53kDa下的一條次要帶(弱帶)。人血清樣品(和FDP)與抗-FDP珠粒的IP反應(yīng)和人血清樣品(和FDP)與對(duì)照珠粒的IP反應(yīng)之間的比較證實(shí)了抗-FDP抗體庫(kù)的特異性。圖5展示了多個(gè)患者樣品之間的FDP抗原的模式是可再現(xiàn)的。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，分別用對(duì)照兔IgG珠粒和抗-FDP珠粒二者在免疫沉淀反應(yīng)中測(cè)試來(lái)自額外的五個(gè)CRC和額外五個(gè)正常患者的血清(從臨床測(cè)試樣品中隨機(jī)選擇)。另外，用兩種類(lèi)型的珠粒測(cè)試FDP免疫原(校準(zhǔn)溶液)。在圖5A中的SDS-PAGE含有從FDP (陽(yáng)性對(duì)照)、CRC患者血清樣品和正常血清樣品提取的FDP特異性抗原。在圖5B中的SDS-PAGE示出了來(lái)自與圖5A中的相同的樣品并以相同樣品順序附到對(duì)照兔IgG珠粒上的抗原。圖5中所示的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了，在人血清中有四種主要的FDP特異性抗原和在25kDa 下的一種非特異性抗原。在圖5A中，由在受控條件下纖維蛋白和纖維蛋白原的體外纖溶酶消化得到的FDP對(duì)照泳道含有三條主要帶和一條次要帶。基于這些非還原的樣品的近似分子量，通過(guò)FDP抗體庫(kù)從FDP對(duì)照樣品捕獲的主要帶按關(guān)于分子量的遞減次序與纖維蛋白原片段D- 二聚體、片段D單體和片段E單體對(duì)應(yīng)。在340kDa下的次要帶大概是未消化的纖維蛋白，這也基于其近似的分子量。來(lái)自人血清的FDP特異性抗原大約是340、 300(觀0-320)、210和50kDa。這些帶分別與未消化的纖維蛋白原、初始纖溶酶消化產(chǎn)物 (IPDP)、片段D- 二聚體/片段X和片段E對(duì)應(yīng)。通過(guò)將同等濃度的每個(gè)血清樣品添加到IP 反應(yīng)中，在該實(shí)驗(yàn)(和所有其他IP實(shí)驗(yàn))中的IP反應(yīng)被標(biāo)準(zhǔn)化。在圖5B中，主要抗原在大約25kDa下。如之前討論的，這表明，在25kDa的血清蛋白與所有的結(jié)合兔IgG的珠粒非特異性反應(yīng)。25kDa蛋白還明顯地與示于圖5A中的結(jié)合兔抗-FDP IgG的珠粒反應(yīng)非特異性地相互作用。表2來(lái)自CRC患者血清的DR-70 (FDP)-特異性抗原的定量
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)受試者中的癌的方法，所述方法包括下述步驟 從所述受試者獲得生物樣品；使所述生物樣品與抗體制劑反應(yīng)，所述抗體制劑至少結(jié)合與纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)相關(guān)的三種抗原，以形成抗體-FDP復(fù)合物，其中所述三種FDP相關(guān)抗原是片段D、片段E和D-二聚體；檢測(cè)所述抗體-FDP復(fù)合物；并診斷所述受試者中的癌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體制劑額外地任選地與片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物(IPDP)中的至少一種結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗體制劑是多克隆抗體制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述診斷步驟還包括至少一種額外的診斷測(cè)試。
6.一種監(jiān)測(cè)患者中的癌的方法，其包括(a)從所述受試者獲得第一生物樣品，所述第一樣品在第一采樣時(shí)間點(diǎn)收集；(b)從所述受試者獲得第二生物樣品，所述第二樣品在所述第一采樣時(shí)間點(diǎn)之后在第二采樣時(shí)間點(diǎn)收集；(c)使所述生物樣品與抗體制劑反應(yīng)，所述抗體制劑結(jié)合與FDP相關(guān)的至少三種抗原， 以形成抗體-FDP復(fù)合物，其中所述三種FDP相關(guān)抗原是片段D、片段E和D- 二聚體；(d)檢測(cè)所述抗體-FDP復(fù)合物；并(e)確定在所述第二生物樣品中的FDP水平與在所述第一生物樣品中的FDP水平的比率；(f)對(duì)癌發(fā)展進(jìn)行判斷；并任選地用在所述第一時(shí)間點(diǎn)和所述第二時(shí)間點(diǎn)后的時(shí)間點(diǎn)下得到的額外的生物樣品重復(fù)步驟(a)-(e)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體制劑任選地額外地與片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物(IPDP)中的至少一種結(jié)合。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述抗體制劑是多克隆抗體制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述反應(yīng)和檢測(cè)步驟包括酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中如果所述比率大于或等于1.15，所述癌已發(fā)展。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中如果所述比率小于1.15，所述癌已退化或是穩(wěn)定的。
12.用于檢測(cè)受試者中的癌的試劑盒，所述試劑盒包括至少結(jié)合與FDP相關(guān)的三種抗原的抗體制劑，其中所述三種FDP相關(guān)抗原是片段D、片段E和D-二聚體； 檢測(cè)系統(tǒng)；和用于測(cè)量所述FDP并使所述FDP的存在與癌關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述檢測(cè)系統(tǒng)包括特異性針對(duì)與FDP相關(guān)的至少三種抗原的檢測(cè)抗體，其中所述三種FDP相關(guān)抗原是片段D、片段EJP D- 二聚體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述抗體制劑任選地額外地與片段Y和初始纖溶酶消化產(chǎn)物(IPDP)中的至少一種結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述抗體和所述檢測(cè)系統(tǒng)包括酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)。
全文摘要
本文公開(kāi)了通過(guò)在一個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)生物樣品中的六種纖維蛋白和纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)的存在，用于檢測(cè)癌或監(jiān)測(cè)癌的發(fā)展的方法、系統(tǒng)和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102405413SQ200980158402
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2009年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月30日
發(fā)明者安德烈婭·斯莫爾-霍華德 申請(qǐng)人:Amdl有限公司