專(zhuān)利名稱(chēng)：降解赤霉病菌毒素基因產(chǎn)物檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降解赤霉病菌毒素基因產(chǎn)物檢測(cè)。
背景技術(shù)：
赤霉病(Fusaruim head blight or scab)是危害小麥(Triticum aestivum)、 大麥(Hordeum vulgare)、燕麥(Avena sativa L·)、玉米(Zea mays L.)、7jC禾S (Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale L.)等多種禾谷類(lèi)作物的一種流行性病害，廣泛分布于世界溫暖潮濕地區(qū)。1884年，英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)小麥赤霉病。近年來(lái)，隨著全球氣候的逐漸變暖以及稻-麥、玉米-麥輪作或免耕等耕作制度和方式的變化，小麥赤霉病在全世界各小麥產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)擴(kuò)展趨勢(shì)，赤霉病帶來(lái)的直接經(jīng)濟(jì)損失也越來(lái)越嚴(yán)重(Bai G H, Shaner G.Scab of wheat :Prospects for control [J]. Plant Disease,1994, 78 :760-766 ；Parry D W, Nicholson P，Mcleod LFusarium ear blight (scba) in small grain cereals-a review[J]. Plant Pathology, 1995,44 :207-238 ；McMullen M，Jones R，Gallenberg D. FHB of wheat and barlye :Are_emerging disease of devastating impact [J]Plant Disease, 1997,81 :1340-1348.)。我國(guó)小麥赤霉病主要發(fā)生在長(zhǎng)江中下游諸省、直轄市以及華南冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)東部，近年來(lái)在黃河流域及其附近區(qū)域也時(shí)有發(fā)生，逐漸向北擴(kuò)展蔓延。小麥赤霉病的發(fā)生區(qū)域面積已達(dá)7 X 106hm2，約占全國(guó)小麥種植總面積的1/4，是目前我國(guó)小麥生產(chǎn)中最主要的病害之一(姚金保，陸維忠.中國(guó)小麥抗赤霉病育種研究進(jìn)展 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，16 ) J42-M8 ；陸維忠，程順和，王裕中.小麥赤霉病研究[M], 北京科學(xué)技術(shù)出版社，2001. 2-39.)。赤霉病的發(fā)生與流行造成了嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。長(zhǎng)江中下游麥區(qū)、華南麥區(qū)及東北春麥區(qū)，流行頻繁，危害嚴(yán)重，重災(zāi)年穗發(fā)病率可達(dá)50-100%， 產(chǎn)量損失10-40% (李克昌.小麥赤霉病及其防治(第二版)[M].上海上?？萍汲霭嫔?，1982. 1-12.)。美國(guó)和加拿大每年損失約40億美元(Carol E W. Economic and Social Impacts of Fusarium Head Blight Changing Farms and Rurak Communities in the Northen Great Plains. Phytopathology. 2000,90 (1) :16-21 ；Perkowsky J, Kiecana I, Stachowiak J,Basinski T. Natural occurrence of scirpentriol in cereals infected by Fusarium species [J] · Food Addit Contam. 2003,20(6) :572-8.)。如果發(fā)生赤霉病的小麥被貯藏在濕度較高的倉(cāng)庫(kù)內(nèi)，還可造成二次侵染，造成更大的損失。小麥赤霉病由多種鐮刀菌引起。在世界上不同的地區(qū)，因生態(tài)地理環(huán)境的不同， 引起赤霉病的優(yōu)勢(shì)致病菌種不同。1984年全國(guó)小麥赤霉病研究協(xié)作組從我國(guó)21個(gè)省市、 自治區(qū)采集小麥赤霉病穗M50份，分離鑒定出18個(gè)鐮刀菌種，主要是以下5種禾谷鐮刀 |if (Fusarium graminearum)(Fusarium culmorum)lif (Fusarium avenaceum)、梨孢鐮刀菌(Fusarium poae)、雪腐鐮刀菌(Microdochium nivale)，其中禾谷鐮刀菌在各地均占優(yōu)勢(shì)，占94. 5% (全國(guó)小麥抗赤霉病研究協(xié)作組.小麥品種資源抗赤霉病鑒定研究[J].作物品種資源，1984,4:2-7.)。禾谷鐮刀菌屬于半知菌亞門(mén)鐮孢屬真菌。 其生命力強(qiáng)，寄主范圍廣，腐生性強(qiáng)，主要危害大麥、小麥、玉米等禾本科作物。侵染麥粒或玉米后，生出白色紅色絮狀或絨狀菌絲，菌株生長(zhǎng)形態(tài)性狀不同，變化和變異較大。小麥赤霉病發(fā)生后，不僅造成產(chǎn)量損失，還因病麥粒中含有多種病菌產(chǎn)生的多種衍生真菌毒素及次生代謝物質(zhì)而污染糧食作物種子，影響小麥的品質(zhì)和商用價(jià)值，嚴(yán)重時(shí)引起嘔吐、腹痛、頭昏等急性中毒現(xiàn)象，該毒素可在食物鏈中長(zhǎng)期存留，還可能產(chǎn)生致癌物質(zhì)，嚴(yán)重威脅著人和動(dòng)物的健康(Placinta C M，D，Mello JPF, Macdonald A M C. A review of worldwide contamination of cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins[J]. Anim Feed Sci Tech,1999, 78 :21-37 ；Windels C Ε.Economic and social impacts of Fusarium head blihgt Changing farms and rural communities in the Northern Great Plains [J]. PhytoPathology, 2000,90 :17-21 ；Cleveland T E, Dowd P F, Desjardins A E, Bhatnagar D, Cotty P J. United States Department of Agricultuer—Agricultural Research Service research on pre—harvest Prevention of mycotoxins and mycotoxigenic fungi in US crops[J]. Pest Manag Sci, 59 :629-642.)。 真菌毒素(Mycotoxin Deoxynivalenol)是一類(lèi)由絲狀真菌在適宜的條件下產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，可在作物收獲前和貯藏期間廣泛污染禾谷類(lèi)作物及其加工品。小麥赤霉病病麥粒中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、T_2毒素、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-Ac-D0N)、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-Ac-DON)、雪腐鐮刀菌烯醇 (Nivalenol, NIV)和玉米赤霉烯酮(karalenone，ZEN)等多種對(duì)人、畜有毒的單端孢霉烯族類(lèi)真菌毒素及其它類(lèi)型的真菌毒素。人、畜、禽誤食赤霉病麥?；蛴善浼庸こ傻氖称坊蝻暳虾?，通常1 池內(nèi)即可出現(xiàn)多種不同程度的中毒癥狀人可出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命；畜、禽常出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振或拒食、腹瀉等癥狀(徐雍皋， 陳利鋒.小麥赤霉病防治理論與實(shí)踐[M].南京江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1993.)。為保障人民身體健康，各國(guó)政府均對(duì)商品小麥中毒素含量作出嚴(yán)格限制。我國(guó)政府明確規(guī)定“小麥赤霉病粒最大允許含量為4.0%”，DON含量不得超過(guò)lmg/kg(= lppm)(中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-小麥 GB1351-2008.)。在發(fā)達(dá)國(guó)家，主要的真菌毒素花費(fèi)是用于防治真菌毒素進(jìn)入食物鏈而做的監(jiān)測(cè)， 認(rèn)證和管理上。每年美國(guó)用于真菌毒素的資金大概在10 15億美元之間?？紤]到控制真菌毒素的花費(fèi)，恐怕只有發(fā)達(dá)國(guó)家才能夠支付。因此，建立安全有效的去毒技術(shù)非常必要。盡管關(guān)于真菌毒素的生化、毒性和作用方式有很多的研究報(bào)道，但是仍舊沒(méi)有有效防治和根除這些毒素的可行性辦法。物理，化學(xué)和生物方法常被用來(lái)去除單端孢霉烯毒素的污染，例如，熱處理，比重分選和清洗，但通常都沒(méi)有效果(Siapira R，Paster N. Mycotoxins in food detection and control· 2004·) 。 Mfiff 5 ]^ , Mi圭白勺月兌_ 方法是通過(guò)篩選微生物，在溫和條件下降解真菌毒素，無(wú)須使用有害化學(xué)試劑、不影響適口性且無(wú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重大流失。植物具有真菌毒素的生物轉(zhuǎn)化和脫毒能力，如赭曲霉素 (Ruhland M，Engelhardt G，Wallnofer P R. Transformation of the mycotoxin chratoxin A in plants. 2. Time course and rates of degradation and metabolite production in cell-suspension cultures of different crop plants. MycopathoIogia,1996， 134(2) :97-102.)鐮孢菌酸。它會(huì)把原來(lái)的毒素轉(zhuǎn)為一些結(jié)構(gòu)不明的產(chǎn)物和化合共軛物，例如玉米烯酮可以被轉(zhuǎn)化為玉米烯酮糖苷(Engelhardt G，Zill G, Wohner B， et al. Transformation of the Fusarium mycotoxin zearalenone in maize cell
5suspension cultures. Naturwissenschaften, 1988, 75 :309-310.)；微生物中如乳酸菌禾口 ftOpioni細(xì)菌的變種在一定條件下可以降解真菌毒素，達(dá)到生物脫毒作用(Pierides M， El-Nazemi H，Peltonen K，et al· Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind aflatoxin Ml in a food model. J. Food. Protec, 2000,63 :645-650. ；Haskard C A，El-Nazemi H，Kankaanpaa P，et al. Surface binding ofaflatoxin Bl by lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol, 2001,67 :3086-3091. ；El-Nazemi H，Mykkanen H，Kankaanpaa P，et al. Ability of Lactobacillus and Propionibacterium strains to remove aflatoxin Bl from the chicken duodenum. J. Food Protec.，2000，63 M9-552.)，這類(lèi)微生物降解避免了使用有害的化學(xué)物質(zhì)，并保留了實(shí)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和口味。細(xì)菌發(fā)酵法可能會(huì)降低真菌毒素的含量，但是應(yīng)用范圍較小，發(fā)酵也有可能使毒素轉(zhuǎn)化為其他有害物質(zhì)(Ryu D, Jackson L S, Bullerman L B. Effects of processing on zearalenone. Adv. Exp. Med. Biol.，2002，504 :205-216.)。利用自然細(xì)菌的基因嵌合和植物的基因改造有望有效的降低真菌毒素。真菌毒素不僅對(duì)動(dòng)植物有毒性，對(duì)產(chǎn)毒菌本身也有毒性。因此，為避免受自產(chǎn)毒素的毒害，病菌必須將毒素轉(zhuǎn)化成無(wú)毒或低毒物質(zhì)排出體外。研究表明TrilOl基因是編碼單端孢霉烯3-0-乙酰轉(zhuǎn)移酶(trichothecene 3-0-acetyltransferase)的一種結(jié)構(gòu)基因，與鍵刀菌抵抗自身毒素有關(guān)(Kimura M, Kaneko I. Trichothecene 3-0-Acetyltransferase protests both the producing organism and transformed yeast from related mycotoxins [J] The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273 (3) : 1654-1661.)。單端孢霉烯3-0-乙酰轉(zhuǎn)移酶使單端孢霉烯轉(zhuǎn)化為類(lèi)似單端孢霉烯C-3羥基變種的乙?；苌?，從而降 氐其毒 生(Kimura M，Shingu Y，Yoneyama K，et al. Features of TrilOl，the trichothecene 3-0-acetyltransferase gene，related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J].Biosci Biotechnol Biochem，1998，62 (5) 1033-1036 ； Shima J，Takase S，Takahashi Y，et al. Novel detoxification of the trichotecene mycotoxin deoxinivalenol by a soil bacterium isolated by enrichment culture[J] Appl.Environ. Microbiol, 1997,63 :3825-3830.)。國(guó)外對(duì)TrilOl基因的結(jié)構(gòu)、功能以及在酵母(Mccomick S P，AlexanderN J.Disruption of TrilOl, the Gene Encodin Trichothecene 3-0-Acety!transferase, from Fusarium sporptrichioid[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(12) :5252-5256.)、煙草(Muhitch M J，McCormick S P, AlexanderN J， et al.Transgenic expression of the TRIlOl or PDR5 gene increases resistance of tobacco to the phytotoxic effects of the trichothecene 4， 15-diacetoxyscirpenol [J]Plant Science，2000，157 (2) :201-207.)、小麥(Okubara P A， Blechl A E，McCormick S P，et al. Engineering deoxynivalenol metabolism in wheat through the expression of a fungal trichothecene acetyltransferase gene[J]. Theoretical and Applied Genetics，2002，106 :74-83.)]禾口大麥(Manoharan M，Dahleen L S，Hohn T M，et al. Expression of 3-OH trichothecene acetyltransferase in barley(Hordeum vulgare L. ) and effects on deoxynivalenol[J]. Plant Science， 2006,171 :699-706.)中的成功表達(dá)已多有報(bào)道(Eriksen G S，Pettersson H，LundhT. Comparative cytotoxicity of deoxynivalenol, nivalenol, their acetylated derives and de-expoxy metabolites[J]. Food and Chemical Toxicology,2004,42 619-624.)。但至今還沒(méi)有禾谷鐮刀菌 Fg0623(Fusarium graminearium 0623) TrilOl 基因表達(dá)檢測(cè)方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種降解赤霉病菌毒素基因產(chǎn)物檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案降解赤霉病毒素的TrilOl基因，來(lái)源于禾谷鐮刀菌 (Fusarium graminearum) Fg0623，GenBank 登陸號(hào)為 GQ907236，具有 SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列，氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。編碼的蛋白為單端孢霉烯3-0-乙酰轉(zhuǎn)化酶。 編碼451個(gè)氨基酸的多肽，推測(cè)分子量為49. 45kDa，等電點(diǎn)為5. 14 ；編碼451個(gè)氨基酸殘基，有其起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。所用禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)Fg0623，利用MEGA3. 1軟件對(duì)編碼單端孢酶烯3-0-乙酰轉(zhuǎn)移酶的TrilOl、Tri201和TAT基因的氨基酸序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)， 分析結(jié)果表明，F(xiàn)usarium graminearium 0623 與 Fusarium sporotrichioides 屬于同一進(jìn)化枝且與Fusarium asiaticum有較近的親緣關(guān)系，而與F. oxysporum、F. moniliforme、 F. nygamai> F. nisikadoi 禾口 F. decemcellulare 的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。將培養(yǎng)好的Fg0623按韓利剛等(韓利剛，袁毅，王罡.絲狀真菌組織DNA的提取 [J].生物技術(shù)，1999，9 (6) :38-41.)的方法收集菌體，依據(jù)RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)上方法提取菌體總RNA，進(jìn)而反轉(zhuǎn)錄合成禾谷鐮刀菌Fg0623 cDNA。根據(jù)GenBank中已經(jīng)登陸的其他鐮刀菌的TrilOl基因序列設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物 Bp-TrilOl-F 5' -GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3‘，引入 BamHI 酶切位點(diǎn)；下游引物 Bp-TrilOl-R 5' -CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3’，引入 XhoI 酶切位點(diǎn)。利用上述一對(duì)引物和合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，得到特異性PCR條帶。再將目的片段與PMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 菌株，經(jīng)篩選、鑒定得到插入目的片段的陽(yáng)性克隆。最后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定，利用DNAclub軟件并通過(guò)NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對(duì)所測(cè)定序列進(jìn)行比較分析。本發(fā)明中的Fg0623 TrilOl基因含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，閱讀框架全長(zhǎng) 135^3ρ。該基因在GenBank中的登陸號(hào)為GQ907236。它與Kimura報(bào)道的禾谷鐮刀菌iTri 101 SStIf1SIji^J (Kimura M, Shingu Y, Yoneyama K, et al. Features of TrilOl, the trichothecene 3-0-acetyltransferase gene,related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J]. Biosci Biotechnol Biochem,1998,62 (5) 1033-1036.) 同源性最高，為99. 78%，堿基序列只在444位由A變異為G，在1 173位由T變異為C，從而引起TrilOl基因推導(dǎo)的氨基酸序列中第148位氨基酸由異亮氨酸(Ile)變異為纈氨酸 (Val)，第391位氨基酸由苯丙氨酸(Wie)變異為亮氨酸(Leu)，雖然核苷酸序列的830位也由T變異為C，但該變化沒(méi)有引起氨基酸的變化。該基因編碼451個(gè)氨基酸殘基，有其起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
該基因編碼的蛋白為單端孢酶烯3-0-乙酰轉(zhuǎn)移酶，Blast數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明， 其屬于轉(zhuǎn)移酶總科。對(duì)TrilOl基因編碼氨基酸序列的基本特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為49. 45kDa，等電點(diǎn)為5. 14，氨基酸組成中帶正電荷氨基酸 (Arg、Lys) 47個(gè)，占10. 42%，帶負(fù)電荷氨基酸(Asp、Glu) 57個(gè)，占12. 64%，疏水性氨基酸 217個(gè)，占48. 12%，親水性氨基酸184個(gè)，占40. 80%。利用Genedoc軟件，將Fg0623 TrilOl 基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果表明，它與Kimura報(bào)道的禾谷鐮刀菌TrilOl氨基酸序列同源性最高，為99. 56%，與其它13種鐮刀菌的TrilOl氨基酸序列的同源性分別為 97. 91% 75. 68%。本發(fā)明所提供降解赤霉病菌毒素的TrilOl基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法，以制備的兔抗GST-Tri 101抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有TrilOl蛋白的待檢測(cè)物進(jìn)行Western blot分析。本發(fā)明優(yōu)選的用于檢測(cè)感赤霉病小麥中TrilOl基因的表達(dá)。本發(fā)明通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白是否表達(dá)，待SDS-PAGE結(jié)束后，用250mM KCl染膠，就可見(jiàn)白色的蛋白條帶。割取含目的條帶的凝膠，回收GST-TrilOl融合蛋白。融合蛋白GST-TrilOl 分子量為75. 45kDa。然后，用純化的GST-TrilOl融合蛋白作為抗原，注射健康新西蘭大白兔制備兔抗GST-TrilOl抗體，GST-TrilOl融合蛋白制備和鈍化的步驟如下(I)GST-TrilOl融合蛋白抗血清的制備①選取14-16周齡的健康新西蘭大白兔，每次注射180 μ g左右純化的GST-Tri 101 融合蛋白抗原，在免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對(duì)照；②GST-Tri 101融合蛋白抗原500 μ L，加500 μ L福氏完全佐劑乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫；③3周后，GST-TrilOl融合蛋白抗原500 μ L，加500 μ L福氏不完全佐劑乳化，腿部肌肉多點(diǎn)注射免疫；④2周后，500 μ L GST-TrilOl融合蛋白抗原免疫；⑤1周后，再次用ImL GST-TrilOl融合蛋白抗原加強(qiáng)免疫，同時(shí)，從兔耳抽血樣， 采用間接ELISA進(jìn)行多抗血清效價(jià)測(cè)定；⑥1周后，殺兔收集血液，收集的血液置室溫下凝固；⑦將凝固的血液放入37°C溫箱內(nèi)半小時(shí)，再置4°C冰箱過(guò)夜，使血塊收縮，抗血清析出；⑧吸出抗血清，3000rpm離心lOmin，吸上清液分裝，_70°C保存?zhèn)溆茫?2) GST-Tri 101融合蛋白抗血清的純化步驟①用pH值為7. 4的PBS溶液將血清稀釋2倍；②攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，其pH值為7. 4，使其飽和度達(dá)到50%，4°C靜置2小時(shí)以上；③在4°C條件下，以12000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)速)離心20min，將其沉淀溶于2倍的PBS 溶液中；④加入飽和硫酸銨溶液，其pH值為7. 4至溶液飽和度達(dá)到33%，4°C靜置2小時(shí)以上；⑤在4°C條件下，以12000rpm離心20min，沉淀用少量的PBS溶液溶解；⑥在4°C條件下，在大于20倍體積的PBS溶液中透析M小時(shí)，中間更換(通常等
8時(shí)間段更換)透析液3次；⑦收集透析液，-20°C保存?zhèn)溆?。兔抗GST-TrilOl抗體為多克隆抗體。兔抗GST-Tri 101抗體經(jīng)ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)為1 256000，制備的抗體與原核細(xì)胞體外表達(dá)的TrilOl蛋白可以特異性結(jié)合。TrilOl蛋白是pGEX_4T2/Tril01轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的約 75. 45kD的蛋白。羊抗兔IgG-HRP為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體。本發(fā)明多克隆抗體的Wfestern印跡分析參照Sambrook等(1989)方法，具體操作如下首先將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用封閉液封閉2小時(shí)，接著用 PBST+5%脫脂奶粉+純化后抗體2 μ L，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用PBST洗3 6次，IOmin/次，加入PBST和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用PBS洗膜3次，IOmin/ 次；最后將PVDF膜置于含有DAB的顯色液中至條帶清晰，將膜放入蒸餾水終止顯色反應(yīng)。 以上方法參照Sambrook等(1989)方法。所述檢測(cè)方法在含有或可能含有TrilOl蛋白的小麥、玉米等待檢測(cè)糧食作物和或其加工的產(chǎn)品的應(yīng)用。本發(fā)明利用TrilOl抗體檢測(cè)TrilOl基因在感病小麥中的表達(dá)培養(yǎng)Fg0623菌株，收集孢子，配制分生孢子懸浮液，采用分生孢子單小花注滴法對(duì)大小相對(duì)一致的麥穗接種，以無(wú)菌水做對(duì)照。22天后，采集感病和對(duì)照小麥籽粒提取蛋白。進(jìn)而以制備的兔抗 GST-TrilOl抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與感赤霉病小麥籽粒中提取的蛋白進(jìn)行Western blot分析。所制備的抗血清能特異性地識(shí)別在感病小麥中表達(dá)的TrilOl蛋白， 雜交顯示的條帶很專(zhuān)一。本發(fā)明將Fg0623的TrilOl基因在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，將純化的蛋白免疫新西蘭白兔，得到特異性較好的抗體，并能與在BL21(DE3)中分泌表達(dá)的TrilOl蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，為轉(zhuǎn)入小麥和玉米中的TrilOl基因提供一種新的檢測(cè)方法，降低了檢測(cè)成本，并為進(jìn)一步研究TrilOl基因及其蛋白的生物學(xué)功能、細(xì)胞定位以及在植物中的表達(dá)等奠定了基礎(chǔ)，有助于實(shí)現(xiàn)控制小麥、玉米毒素的代謝和降低小麥、玉米中毒素的含量，找到食物和飼料中真菌毒素，經(jīng)濟(jì)、高效和安全的凈化方法，進(jìn)而提高作物產(chǎn)量，食品安全和避免真菌毒素在公共健康方面的影響。


圖 1 為 iTri 101基因 RT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果，其中，Lane M :DNA Marker DL2000 ；Lane 1:PCR product ；圖2為重組質(zhì)粒pMD19_T/Tril01酶切鑒定結(jié)果，其中，Lane M :DNA Marker DL15000 ；Lane 1 :recombinant plasmid pMD19-T/Tril01 ；圖3為T(mén)rilOl氨基酸組成；圖4為T(mén)rilOl蛋白質(zhì)種類(lèi)；圖5為重組質(zhì)粒pGEX_4T2/Tril01酶切鑒定結(jié)果，其中，Lane M =DNA Marker DL15000 ；Lane 1 -recombinant plasmid pGEX_4T2/Tril01 ；
圖 6 為 pGEX-4T2/Tril01 原核表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析，其中，Lane M =Protein marker ；Lane 1 :pGEX_4T2/Tril01 induced with IPTG ；Lane 2 :pGEX_4T2 induced with IPTG ；Lane 3 :BL21 without induction ；圖7為不同IPTG濃度誘導(dǎo)的表達(dá)產(chǎn)物量的SDS-PAGE比較，其中，Lane Μ Protein marker ；Lane 1-5 :Proteins of pGEX_4T2/Tril01 induced by IPTG at 0. 4, 0.6,0.8,1. Oand 1. 2mM ；Lane 6 :pGEX-4T2 induced with IPTG ；Lane 7 :BL21 without induction ；圖8為兔抗GST-TrilOl多克隆抗體效價(jià)的ELISA檢測(cè)；圖 9 為 pGEX-4T2/Tril01 表達(dá)蛋白的 Western blot 分析，其中，Lane M =Protein marker ；Lanel :pGEX_4T2/Tril01 ；Lane2 :pGEX_4T2 ；Lane3 :BL21 ；圖10為感赤霉病小麥籽粒蛋白的Wfestern blot分析，其中，Lane M =Protein marker ；Lanel Protein of gibberella damaged kernels for wheat ；Lane2 Protein of health wheat grain。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。下述實(shí)施例中所用方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例一禾谷鐮刀菌降解毒素基因TrilOl的表達(dá)1、總RNA的提取和cDNA的合成將新鮮PDA斜面培養(yǎng)好的Fg0623孢子接種于液體培養(yǎng)基中，150rpm, 28°C，振蕩培養(yǎng)48h ；吸取ImL培養(yǎng)好的菌液于1. 5mL無(wú)菌EP管中，10 OOOrpm離心IOmin ；收集菌體， 依據(jù)RNAiso Plus說(shuō)明書(shū)上方法提取菌體總RNA。以提取的總RNA為模板，合成cDNA。 RTl 體系RNase Free dH20 6. 5 μ L, dNTP-Mix (IOmM) 1 μ L, Oligo dT (50 μ Μ) 2 μ L，Total RNA 0. 5μ L于PCR儀上65°C反應(yīng)5min，冰上急冷。RT2體系上述變性、退火后的反應(yīng)液 10μ L,5XPrimeScript Buffer 4 μ L, RNase Inhibitor (40U/ μ L) 0. 5 μ L, PrimeScript RTase (200U/ μ L) 1 μ L, RNase Free dH20 4.5 yL。反應(yīng)程序30 °C lOmin，42 °C 60min， 70°C 15min，后 4°C保持，得到 cDNA。2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中已經(jīng)登陸的其他鐮刀菌的TrilOl基因序列設(shè)計(jì)并合成引物。上游引物Bp-TrilOl-F:5' -GGATCCATGGCTTTCAAGATACAGCT-3‘，引入了 BamHI 酶切位點(diǎn)；下游引物Bp-TrilOl-R :5' -CTCGAGCTAACCAACGTACTGCGCAT-3’，引入了 XhoI 酶切位點(diǎn)。以上引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。3、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化PCR 擴(kuò)增體系(25 μ L)_10 X Buffer (Mg2+free)2. 5 μ LMgCl2 (25mM)2. 5 μ L
dNTP (IOmM)0. 4 μ LF primer (10 μ Μ)1 μ LR primer (10 μ Μ)1 μ LrTaq DNA 聚合酶(0· 5U/ μ L)0. 2 μ L
模板 cDNA (lOng/ μ L) 6 μ LddH2011. 4μ L_Total25 μ L_擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性:3min ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，l(TC保持。PCR產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用U-gene公司DNA凝膠同收試劑盒回收1. 4kb 左右的目的片段。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。純化產(chǎn)物_20°C保存?zhèn)溆?。以Fg0623總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果得到1 400bp左右的特異性PCR條帶(圖1)。4、PCR回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化將PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T vector 16°C連接過(guò)夜，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。參照文獻(xiàn)(Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular cloning :A laboratory manual,2nd Edition[M]. New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，所用大腸桿菌為JM109菌株。熱擊轉(zhuǎn)化步驟如下(1)取出-70°C保存的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上5min。(2)加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30min。(3) 42°C水浴熱擊90s，迅速置于冰上，冰浴5min。(4)加入790 μ L新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37°C，150rpm,振蕩培養(yǎng)lh。(5)取出菌液，4°C，10 OOOrpm，離心 2min。(6)棄上清(約殘留200 μ L上清液)，重懸沉淀，將其全部均勻涂布于含X_gal、 IPTG 的 LB 平板(含 50mg/L Amp)上，37°C，培養(yǎng)約 14h。(7)將培養(yǎng)皿置于4°C (約l_2h)，進(jìn)行顯色反應(yīng)。5、質(zhì)粒提取與重組質(zhì)粒鑒定(1)隨機(jī)挑取陽(yáng)性單克隆(白色菌落)，加入5mL LB (含50mg/L Amp)液體培養(yǎng)基， 37 0C，250rpm 震蕩培養(yǎng)至 0D_ 為 0. 4-0. 5 (12_16h)。(2)取3_5mL菌液，參照U-gene公司質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。-20°C保存?zhèn)溆谩?3)用BamHI、XhoI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMD19_T/Tril01，按下表加入各試劑， 37°〇，溫浴211。_BamHI1 μ L
XhoIIOXT buffer(MH2O重組質(zhì)粒_
1 μ L 1 μ L 3μ L 4μ LTotal_將目的片段與pMD19-T載體連接，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含有 Ampicilin、X-gal、IPTG的LB平板上根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性重組子，然后用BamHI和XhoI雙酶切鑒定重組克隆，酶切結(jié)果見(jiàn)圖2，質(zhì)粒被切為約2. 7kb的載體片段和1. 4kb左右的插入片段。酶切結(jié)果表明，已得到插入目的片段的陽(yáng)性克隆。實(shí)施例二禾谷鐮刀菌降解毒素基因TrilOl的序列分析經(jīng)酶切鑒定成功的陽(yáng)性克隆樣品送Sangon公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定。利用DNAclub 軟件并通過(guò)NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對(duì)所測(cè)定序列進(jìn)行比較分析。基因序列測(cè)定結(jié)果表明，F(xiàn)g0623 TrilOl基因含有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，閱讀框架全長(zhǎng)1356bp。該基因已在GenBank中登陸，登陸號(hào)為GQ907236。它與Kimura報(bào)道的禾谷鐮刀菌iTrilOl基因核苷酸序列(Kimura M, Shingu Y, Yoneyama K,
et al. Features of TrilOl, the trichothecene 3-0-acetyltransferase gene, related to the self-defense mechanism in Fusarium graminearum[J] · Biosci Biotechnol
Biochem, 1998，62 (5) 1033-1036.)同源性最高，為99. 78 %，堿基序列只在444位由A變異為G，在1 173位由T變異為C，從而引起TrilOl基因推導(dǎo)的氨基酸序列中第148位氨基酸由異亮氨酸(Ile)變異為纈氨酸(Val)，第391位氨基酸由苯丙氨酸(Wie)變異為亮氨酸 (Leu)，雖然核苷酸序列的830位也由T變異為C，但該變化沒(méi)有引起氨基酸的變化。該基因編碼451個(gè)氨基酸殘基，有其起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。TrilOl基因的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示。實(shí)施例三TrilOl基因編碼氨基酸序列分析由 http//www. expasy. org/tools/#translate 網(wǎng)站提供的蛋白分析軟件對(duì) TrilOl基因編碼氨基酸序列的基本特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為49. 45kDa，等電點(diǎn)為5. 14，氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(Arg、Lys)47個(gè)，占10. 42%, 帶負(fù)電荷氨基酸(Asp、Glu) 57個(gè)，占12. 64%，疏水性氨基酸217個(gè)，占48. 12%，親水性氨基酸184個(gè)，占40. 80%，見(jiàn)表1和圖3。表1 TrilOl蛋白氨基酸含量
權(quán)利要求
1.一種降解赤霉病菌毒素的TrilOl基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)方法，其特征在于，以兔抗 GST-TrilOl抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有TrilOl蛋白的待檢測(cè)物進(jìn)行 Western blot分析；所述兔抗GST-TrilOl抗體的制備，是將純化的GST-TrilOl融合蛋白作為抗原，注射健康新西蘭大白兔制備出兔抗GST-TrilOl抗體，其中，(1)GST-TrilOl融合蛋白抗血清的制備包括以下步驟①選取14-16周齡的健康新西蘭大白兔，每次注射ISOyg左右純化的GST-TrilOl融合蛋白抗原，在免疫前，從兔耳抽取血樣，作為陰性對(duì)照；②GST-TrilOl融合蛋白抗原500μ L，加500 μ L福氏完全佐劑乳化，皮下多點(diǎn)注射免疫；③3周后，GST-TrilOl融合蛋白抗原500μ L，加500 μ L福氏不完全佐劑乳化，腿部肌肉多點(diǎn)注射免疫；④2周后，500μ L GST-1TrilOl融合蛋白抗原免疫；⑤1周后，再次用ImLGST-TrilOl融合蛋白抗原加強(qiáng)免疫，同時(shí)，從兔耳抽血樣，采用間接ELISA進(jìn)行多抗血清效價(jià)測(cè)定；⑥1周后，殺兔收集血液，收集的血液置室溫下凝固；⑦將凝固的血液放入37°C溫箱內(nèi)半小時(shí)，再置4°C冰箱過(guò)夜，使血塊收縮，抗血清析出；⑧吸出抗血清，3000rpm離心lOmin，吸上清液分裝，_70°C保存?zhèn)溆茫?2)GST-Tril01融合蛋白抗血清的純化包括以下步驟①用PH值為7.4的PBS溶液將血清稀釋2倍；②攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，其PH值為7.4，使其飽和度達(dá)到50%，4°C靜置2 小時(shí)以上；③在4°C條件下，以12000rpm離心20min，將其沉淀溶于2倍的PBS溶液中；④加入飽和硫酸銨溶液，其PH值為7.4至溶液飽和度達(dá)到33%，4°C靜置2小時(shí)以上；⑤在4°C條件下，以12000rpm離心20min，沉淀用少量的PBS溶液溶解；⑥在4°C條件下，在大于20倍體積的PBS溶液中透析M小時(shí)，中間更換透析液3次；⑦收集透析液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，GST-TrilOl融合蛋白的制備過(guò)程中，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白是否表達(dá)，待SDS-PAGE結(jié)束后，用250mM KCl染膠，就可見(jiàn)白色的蛋白條帶；割取含目的條帶的凝膠，回收GST-TrilOl融合蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，用于檢測(cè)感赤霉病小麥中TrilOl基因的表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，兔抗GST-TrilOl抗體為多克隆抗體。
5.如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，兔抗GST-TrilOl抗體經(jīng)ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)為1 256000，制備的抗體與原核細(xì)胞體外表達(dá)的TrilOl蛋白可以特異性結(jié)I=I O
6.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，TrilOl蛋白是pGEX-4T2/Tril01轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的約75. 45kD的蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，羊抗兔IgG-HRP為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，首先將蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到 PVDF膜上，然后用封閉液封閉2小時(shí)，接著用PBST+5%脫脂奶粉+純化后抗體2 μ L，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用PBST洗3 6次，IOmin/次，加入PBST和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用PBS洗膜3次，IOmin/次；最后將PVDF膜置于含有DAB的顯色液中至條帶清晰，將膜放入蒸餾水終止顯色反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)方法在含有或可能含有TrilOl蛋白的小麥、玉米等待檢測(cè)糧食作物和或其加工的產(chǎn)品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種降解赤霉病菌毒素基因產(chǎn)物檢測(cè)。以兔抗GST-Tri101抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，與含有Tri101蛋白的待檢測(cè)物進(jìn)行Western blot分析。本發(fā)明的Tri101基因編碼單端孢霉烯3-O-乙酰轉(zhuǎn)化酶，在大腸桿菌中對(duì)其進(jìn)行了高效表達(dá)，將純化的蛋白免疫新西蘭白兔，得到特異性較好的抗體，并能與在BL21(DE3)中分泌表達(dá)的Tri101蛋白發(fā)生免疫印跡反應(yīng)，為轉(zhuǎn)入小麥和玉米中的Tri101基因提供一種新的檢測(cè)方法，降低了檢測(cè)成本，并為進(jìn)一步研究Tri101蛋白的生物學(xué)功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/531GK102156192SQ20101059322
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者何文蘭, 全鑫, 劉明源, 劉紅彥, 吳坤, 吳政卿, 孫虎, 宋玉立, 曹岳恩, 楊麗榮, 武超, 王亞南, 王恒亮, 王愛(ài)平, 薛保國(guó), 趙獻(xiàn)林, 郭松景, 閆海霞, 雷振生, 馬雪皎, 魯傳濤 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院