專利名稱：通過質(zhì)譜法檢測二羥基維生素d代謝物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二羥基維生素D代謝物的檢測。在具體的方面，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜 法檢測維生素D代謝物的方法。
背景技術(shù)：
維生素D是在鈣(Ca2+)動態(tài)平衡的正調(diào)節(jié)中具有重要生理學(xué)作用的基本營養(yǎng)物。 維生素D可在皮膚中通過暴露于陽光從頭合成或者它可從飲食中得以吸收。有兩種形式的 維生素D 維生素D2 (麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)。維生素D3是由動物從頭合成的 形式。它還是在美國被添加到生產(chǎn)的牛奶產(chǎn)品和某些食品中的常用添加劑。飲食和內(nèi)在合 成的維生素D3都必須經(jīng)過代謝活化以產(chǎn)生生物活性代謝物。在人中，維生素D3活化的初始 步驟主要發(fā)生在肝臟中并且包括羥基化作用以形成中間代謝物25-羥基維生素D3 (25-羥 基膽鈣化醇；鈣化醇；250HD3)。鈣化醇是循環(huán)中維生素D3的主要形式。循環(huán)250HD3然后由 腎轉(zhuǎn)化成1，25_ 二羥基維生素D3(鈣化醇；1，25(0H)2D3)，其一般被認(rèn)為是具有最高生物學(xué) 活性的維生素D3的代謝物。維生素D2源自真菌和植物來源。一些非處方(over-the-counter)飲食添加劑包 含麥角鈣化醇(維生素D2),而不是膽鈣化醇(維生素03)。Drisdol-美國可購得的唯一高 效的處方形式的維生素D——是用麥角鈣化醇配制的。在人中維生素D2經(jīng)歷與維生素D3 類似的代謝活化途徑，形成代謝物25-羥基維生素D2 (250HD2)和1，25-二羥基維生素D3 (1， 25 (OH)2D2)。在人中維生素D2和維生素D3長期被認(rèn)為是生物學(xué)等價的，然而最近的報道表 明這兩種形式的維生素D在生物活性和生物利用率上可能具有差異(Armas等人，(2004) J. Clin. Endocrinol. Metab. 89 :5387_5391)。維生素D——無活性的維生素D前體——的測量在臨床環(huán)境下是很少的并且具有 很小的診斷價值。相反，25-羥基維生素D3和25-羥基維生素D2 (統(tǒng)稱為25-羥基維生素 D;“250HD”)的血清水平是維生素D營養(yǎng)狀況和某種維生素D類似物效力的有用指標(biāo)。因 此，250HD的測量通常用于診斷和處理鈣代謝疾病。在這方面，250HD的低水平指示與疾病 相關(guān)的維生素D缺乏，所述疾病諸如低血鈣、低血磷酸鹽、二級甲狀旁腺功能亢進(jìn)、堿性磷 酸酶升高、成人骨軟化和兒童軟骨病。在維生素D中毒疑似患者中，250HD水平升高使該疾 病區(qū)別于引起高血鈣的其它疾病。1,25 (OH)2D的測量也被用于臨床環(huán)境。例如，某些疾病狀態(tài)諸如腎衰竭可通過循 環(huán)1，25 (OH) 2D水平的降低進(jìn)行診斷，并且1，25 (OH) 2D水平的升高可指示副甲狀腺激素過多 或者可能指示某些疾病諸如肉樣瘤病或某些類型的淋巴瘤。維生素D代謝物的檢測可用對25-羥基維生素D3和25-羥基維生素D2共特異性 抗體通過放射性免疫測定完成。因為目前基于免疫學(xué)的測定無法獨立地分辨25-羥基維 生素D3和25-羥基維生素D2,所以維生素D營養(yǎng)缺乏的原因在沒有訴諸于其它測試的情 況下不能確定。最近已經(jīng)有報道公開了采用質(zhì)譜法檢測特定維生素D代謝物的方法。例 如，Yeung B 等人，J Chromatogr. 1993，645(1) :115_23 ；Higashi T 等人，Steroids. 2000，65(5) 281-94 ；Higashi T等人，Biol Pharm Bull. 2001,24(7) :738_43和Higashi T等人， J Pharm Biomed Anal. 2002,29 (5) :947_55公開了采用液相層析和質(zhì)譜法檢測各種維生素 D代謝物的方法。這些方法需要代謝物在通過質(zhì)譜法檢測前進(jìn)行衍生。通過液相層析/質(zhì)譜 法檢測未衍生的1，25 (OH)2D3的方法被公開在Kissmeyer和Sonne，J Chromatogr Α. 2001， 935(1-2) 93-103 中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過包括在串聯(lián)質(zhì)譜法內(nèi)的質(zhì)譜法檢測樣品中二羥基維生素D代謝 物的存在或量的方法。一方面，提供了通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定一種或多種二羥基維生素D代謝物的存在 或量的方法，其包括(a)從樣品中免疫純化一種或多種二羥基維生素D代謝物；(b)通過 HPLC進(jìn)一步純化免疫純化的二羥基維生素D代謝物(或多種)；(c)通過下列步驟通過串聯(lián) 質(zhì)譜法測定從步驟(b)獲得的維生素D代謝物的量(i)產(chǎn)生二羥基維生素D代謝物(或 多種)的前體離子；(ii)產(chǎn)生前體離子的一種或多種碎片離子；和(iii)檢測步驟(c)或 (d)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種離子的存在或量并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到樣品中的二羥基 維生素D代謝物(或多種)的存在或量。在某些優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝 物采用與固體載體連接的抗二羥基維生素D抗體從樣品中免疫純化；優(yōu)選地二羥基維生素 D代謝物采用免疫顆粒進(jìn)行免疫純化；優(yōu)選地免疫顆粒在其表面上具有抗二羥基維生素D 抗體。在某些實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)包括la，25(0H)2D2 ；在某些 實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)包括la，25(0H)2D3 ；在某些特別優(yōu)選的實 施方式中，提供了在單一檢測中測定la，25 (OH)2D2和1 a，25 (OH) 2D3的方法。在上述方面的某些優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)在質(zhì) 譜法之前進(jìn)行衍生；在某些特別優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)用 Cookson型試劑(例如4-取代的1，2，4_三唑啉-3，5- 二酮；TAD)進(jìn)行衍生；在某些特別 優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二 酮(PTAD)進(jìn)行衍生；以及在另外其它特別優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或 多種)用4’ -羧苯基-TAD進(jìn)行衍生。在某些優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物 (或多種)包括la，25(0H)2D2 ；Ia，25 (OH)2D2在質(zhì)譜法之前用4_苯基_1，2，4_三唑啉_3， 5- 二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；以及更優(yōu)選地1 a，25 (OH)2D2的前體離子具有586. 37 士 0. 5的質(zhì) /荷比。在某些優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)包括1 a，25 (OH)2D3 ； la，25(0H)2D3在質(zhì)譜法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；以及 更優(yōu)選地1 α，25 (OH)2D3的前體離子具有574. 37士0. 5的質(zhì)/荷比。在某些優(yōu)選的實施方 式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)在質(zhì)譜法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二 酮(PTAD)進(jìn)行衍生，并且碎片離子包括至少一個質(zhì)/荷比為314. 12士0.5的離子在某些優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)在質(zhì)譜法之前沒有 進(jìn)行衍生。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)包括la， 25 (OH) 2D2，1 a，25 (OH) 2D2在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍生，并且更優(yōu)選地未衍生的1，25 (OH) 2D2 的前體離子具有411. 35士0. 5的質(zhì)/荷比。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素 D代謝物(或多種)包括la，25(0H)2D3，la，25(0H)2D3在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍生，并且更優(yōu)選地未衍生的1 α ,25 (OH)2D3的前體離子具有399. 35士0. 5的質(zhì)/荷比。在某些特別 優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種)沒有進(jìn)行衍生，并且碎片離子包括一 種或多種的離子，其選自質(zhì)/荷比151. 12士0.5和135. 12士0. 5的離子。在特別優(yōu)選的實施方式中，提供了在單一檢測中通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體樣品中 Ia ,25 (OH) 2D2和1 a，25 (OH) 2D3的量的方法，其包括(a)從樣品中免疫純化1 α，25 (OH) 2D2 和 Ia，25 (OH)2D3 ;(b)用 4_ 苯基-1，2，4_ 三唑啉 _3，5-二酮(PTAD)衍生 Ia ,25 (OH)2D2 禾口 1 a，25 (OH) 2D3 ； (C)通過 HPLC 純化從步驟(b)衍生的 1 a，25 (OH) 2D2 和 1 a，25 (OH) 2D3 ； (d)通過下列步驟通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定從步驟(c)獲得的1 a ,25 (OH)2D2和1 a ,25 (OH)2D3 的量(i)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為586. 37士0. 5的衍生化1 α，25 (OH)2D2的前體離子以及質(zhì)/荷比 為574. 37士0.5的衍生化la，25(0H)2D3的前體離子；(ii)產(chǎn)生來自步驟(i)的前體離子 的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子具有314. 12士0. 5的質(zhì)/荷比；和(iii)檢 測步驟(i)或(ii)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種離子的存在或量并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到 樣品中的1 a，25 (OH) 2D2和1 α , 25 (OH) 2D3的存在或量。如本文所用，術(shù)語“二羥基維生素D代謝物”是指可在動物循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的任何二羥 基化的維生素D種類，其通過維生素D或合成維生素D類似物的生物合成或代謝途徑形成。 優(yōu)選地，二羥基維生素D代謝物在1和25位置被羥基化。在特別優(yōu)選的實施方式中，維生 素D代謝物是1 a，25- 二羥基維生素D3 (1 a，25 (OH) 2D3)或1 a，25- 二羥基維生素D2 (1 a， 25 (OH)2D2)。在某些優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物自然存在于動物體液中，更 優(yōu)選地存在于人的體液中。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，如本文所述的方法檢測Ia， 25- 二羥基維生素 D3 (la ,25 (OH) 2D3)和 / 或 1 a，25- 二羥基維生素 D2 (la ,25 (OH) 2D2)并 且不檢測一種或多種選自24，25-二羥基維生素D、25，26-二羥基維生素D和1，3_ 二羥基 維生素D的二羥基維生素D代謝物。如本文所用，術(shù)語“純化(purification) ”或“純化(purify) ”是指相對于樣品的 一種或多種其它組分富集感興趣分析物的量的方法。如本文所用，純化不需要將分析物從 所有其它組分中分離。在優(yōu)選的實施方式中，純化步驟或方法可用于去除一種或多種干擾 物質(zhì)，例如一種或多種干擾方法中使用儀器的操作的物質(zhì)或者可干擾通過質(zhì)譜法對分析物 檢測的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“免疫純化(immunopurification) ”或“免疫純化 (immimopurify)”是指利用抗體——包括多克隆或單克隆抗體在內(nèi)——富集一種或多種感 興趣分析物的純化方法。免疫純化可采用本領(lǐng)域中熟知的任何免疫純化方法進(jìn)行。免疫純 化程序通常利用與固體載體例如柱、孔、管、凝膠、膠囊、顆?；蝾愃莆锝Y(jié)合、偶聯(lián)或另外方 式連接的抗體。如本文所用，免疫純化非限制性地包括本領(lǐng)域中通常稱為免疫沉淀的方法 以及本領(lǐng)域中通常稱為親和層析的方法。如本文所用，術(shù)語“免疫顆?！笔侵高@樣的膠囊、珠、凝膠顆?；蝾愃莆?，其具有結(jié) 合、偶聯(lián)或另外方式連接到其表面(在顆粒之上和/或之內(nèi))的抗體。在某些優(yōu)選的實施 方式中，免疫顆粒為瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠。在可選的優(yōu)選實施方式中，免疫顆粒是玻璃、 塑料或硅珠或硅膠。如本文所用，術(shù)語“抗二羥基維生素D抗體”是指對一種或多種二羥基維生素D代 謝物具有親和力的任何多克隆或單克隆抗體。在某些優(yōu)選的實施方式中，抗二羥基維生素D抗體結(jié)合1 α，25 (OH)2D3和1 α，25 (OH)2D20在某些優(yōu)選的實施方式中，抗二羥基維生素D 抗體以相等或相似的親和力結(jié)合1 α，25(0H)2D3和1 α ,25 (OH)2D20在其它優(yōu)選的實施方式 中，抗二羥基維生素D抗體以顯著高于1 α，25 (OH) 2D2的親和力結(jié)合1 α，25 (OH) 2D3 ；在可選 的優(yōu)選實施方式中，抗二羥基維生素D抗體以顯著高于1 α，25 (OH)2D3的親和力結(jié)合1 α， 25 (OH)2D20在各種實施方式中，抗二羥基維生素D抗體對除了二羥基維生素D代謝物之外 的化學(xué)物種類的特異性可以不同；例如在某些優(yōu)選的實施方式中，抗二羥基維生素D抗體 對二羥基維生素D代謝物具有特異性，并且因此對除了二羥基維生素D代謝物之外的化學(xué) 物種類(例如其它維生素D代謝物諸如維生素D或25-羥基維生素D)具有很小的親和力 或無親和力；相反，在其它優(yōu)選的實施方式中，抗二羥基維生素D抗體是非特異性的，并且 因此結(jié)合除了二羥基維生素D代謝物之外的某些化學(xué)物種類(例如，非特異性的抗二羥基 維生素D抗體可結(jié)合其它維生素D代謝物諸如維生素D或25-羥基維生素D)。在本文所公開的方法的某些優(yōu)選實施方式中，二羥基維生素D代謝物(或多種) 在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍生。在其它優(yōu)選的實施方式中，維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前進(jìn) 行衍生。如本文所用，“生物學(xué)樣品”是指來自生物學(xué)來源的任何樣品。如本文所用，“體液” 是指可從個體的身體上分離的任何液體。例如，“體液”可包括血液、血漿、血清、膽汁、唾液、 尿液、淚液、汗液等。如本文所用，“衍生”是指使兩個分子反應(yīng)以形成一個新分子。衍生化試劑可包 括Cookson型試劑(例如，4-取代的1，2，4-三唑啉-3，5-二酮；TAD)；異硫氰酸鹽基團(tuán)、 二硝基_氟代苯基基團(tuán)、硝基苯氧基羰基基團(tuán)和/或苯二醛基團(tuán)。在某些優(yōu)選的實施方 式中，衍生采用諸如在例如Vreeken等人，Biol. Mass Spec. 22 :621_632 ；Yeung B等人， J Chromatogr. 1993,645(1) 115-23 ；Higashi T 等人，Biol Pharm Bull.2001,24(7) 738-43 ；或Higashi T 等人，J Pharm Biomed Anal. 2002,29(5) :947_55 中所公開的那些方 法進(jìn)行。在優(yōu)選的實施方式中，衍生化試劑是Cookson型試劑。特別優(yōu)選的衍生化試劑包 括4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD) ；4，-羧基苯基-TAD ;4_[4-(6-甲氧基-2-苯 并噁唑基)苯基]-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(MBOTAD) ；4-[2-(6，7-二甲氧基-4-甲 基-3-氧-3，4-二氫喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(DMEQTAD) ；4-硝基苯 基-TAD ；4-五氟苯基-TAD ；4- 二茂鐵乙基-TAD ；4-四胺-TAD等。在某些優(yōu)選的實施方式 中，衍生在層析之前進(jìn)行；然而在其它優(yōu)選的實施方式中，衍生例如采用類似于Vreeken等 人，Biol. Mass Spec. 22 =621-632中所述的那些方法在層析之后進(jìn)行。如本文所用，“層析”是指這樣的方法，其中由液體或氣體攜帶的化學(xué)混合物當(dāng)它 們在固定液相或固相周圍或之上流動時由于化學(xué)實體的微分分布而被分成組分。如本文所用，“液相層析” (LC)是指當(dāng)流體均一地通過細(xì)微分開的物質(zhì)的柱或者通 過毛細(xì)管道過濾時流體溶液的一種或多種組分選擇性延遲的方法。延遲是由于當(dāng)該流體相 對于固定相(或多個)移動時混合物的組分在一個或多個固定相和本體流體(bulk fluid) (即流動相)之間的分布?！耙合鄬游觥卑ǚ聪嘁合鄬游?RPLC)、高效液相層析(HPLC)和 高湍流液相層析(HTLC)。如本文所用，術(shù)語“HPLC”或“高效液相層析”是指這樣的液相層析，其中分離程度 是通過使流動相在壓力下穿過固定相通常為緊密填充柱而增加的。
如本文所用，術(shù)語“氣相層析”是指這樣的層析，其中樣品混合物被蒸汽化并且被 注射到穿過包含由液體或顆粒固體組成的固定相的柱而移動的載體氣體流(如氮氣或氦 氣)中，并且根據(jù)化合物對固定相的親和力被分離成其組分化合物。如本文所用，“質(zhì)譜法”(MS)是指通過它們的質(zhì)量鑒定化合物的分析技術(shù)。MS 技術(shù)一般包括(1)使化合物電離以形成帶電化合物；和(2)檢測帶電化合物的分子量并 計算質(zhì)荷比(m/z)?；衔锟赏ㄟ^任何合適的方式電離并檢測?！百|(zhì)譜儀”一般包括電 離器和離子檢測器。參見例如美國專利號6，204，500，發(fā)明名稱為“Mass Spectrometry From Surfaces ；，，6，107，623,發(fā)明名禾爾為“Methods and Apparatus for Transerm Mass Spectrometry ； ” 6，268，144，發(fā)明名稱為 “DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry ；，，6，124，137,發(fā)明名稱為 “Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes ；，，Wright 等人，Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2 264-76(1999)；以及 Merchant 禾口 Weinberger， Electrophoresis 21 1164-67(2000)。術(shù)語“電子電離”如本文所用是指這樣的方法，其中氣態(tài)或蒸汽相中的感興趣分析 物與電子流相互作用。電子與分析物的相互作用產(chǎn)生分析物離子，其然后可用于質(zhì)譜法技 術(shù)。術(shù)語“化學(xué)電離”如本文所用是指這樣的方法，其中試劑氣體(例如氨)用于電子 碰撞，并且分析物離子通過試劑氣體離子與分析物分子相互作用而形成。術(shù)語“快速原子轟擊”如本文所用是指這樣的方法，其中高能原子束(通常為Xe 或Ar)碰撞非揮發(fā)性樣品，使樣品中包含的分子解吸并電離。測試樣品被溶解在粘性液體 基質(zhì)諸如甘油、硫代甘油、間硝基芐醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、環(huán)丁砜、二乙醇胺和 三乙醇胺。術(shù)語“場致解吸”如本文所用是指這樣的方法，其中非揮發(fā)性測試樣品被置于電離 表面上，并且強(qiáng)電場被用于產(chǎn)生分析物離子。術(shù)語“電離”如本文所用是指產(chǎn)生具有等于一個或多個電子單位的凈電荷的分析 物離子的過程。負(fù)離子是具有一個或多個電子單位的凈負(fù)電荷的離子，而正離子是具有一 個或多個電子單位的凈正電荷的離子。術(shù)語“負(fù)離子模式運行”是指檢測到負(fù)離子的質(zhì)譜法。類似地，“正離子模式運行” 是指檢測到正離子的質(zhì)譜法。術(shù)語“解吸”如本文所用是指將分析物從表面和/或分析物進(jìn)入氣相的入口去除。在第二方面，提供了通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中l(wèi)a，25(0H)2D2的存在或量的方 法，其包括(a)在樣品中用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生1，25 (OH)2D2 ； (b)通過HPLC純化衍生的1，25 (OH)2D2 ； (c)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為586. 37士0. 5的衍生的1 α， 25 (OH)2D2的前體離子；(d)產(chǎn)生前體離子的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子 包括質(zhì)/荷比為314. 12士0.5的離子；和(e)檢測步驟(c)或(d)或兩者中產(chǎn)生的一種 或多種離子的存在或量并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到樣品中的1 α ,25 (OH)2D2的存在或量。在 某些優(yōu)選的實施方式中，樣品中的1，25(0H)2D2在步驟(a)之前通過免疫純化進(jìn)行純化； 優(yōu)選地免疫純化包括用免疫顆粒進(jìn)行的免疫純化；優(yōu)選地免疫顆粒具有結(jié)合到表面的抗 二羥維生素D代謝物抗體。在該方面的某些優(yōu)選的實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括測定樣品中l(wèi)a，25(0H)2D3的存在或量；優(yōu)選地la，25(0H)2D3在質(zhì)譜法之前用4_苯基_1，2， 4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；更優(yōu)選地la，25(0H)2D3的前體離子質(zhì)/荷比為 574. 37 士 0. 5。在第三方面，提供了通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中l(wèi)a，25(0H)2D3的存在或量的方 法，其包括(a)在樣品中用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生1 α，25 (OH) 2D3 ；
(b)通過HPLC純化衍生的1α，25 (OH)2D3 ； (C)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為574. 37 士0. 5的衍生的1 α， 25 (OH)2D3的前體離子；(d)產(chǎn)生前體離子的一種或多種碎片離子，其中至少一種碎片離子 包括質(zhì)/荷比為314. 12士0.5的離子；和(e)檢測步驟(c)或(d)或兩者中產(chǎn)生的一種或 多種離子的存在或量，并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到樣品中的la，25(0H)2D3的存在或量。在 某些優(yōu)選的實施方式中，樣品中的la，25(0H)2D2在步驟(a)之前通過免疫純化進(jìn)行純化； 優(yōu)選地免疫純化包括用免疫顆粒進(jìn)行的免疫純化；優(yōu)選地免疫顆粒具有結(jié)合到表面的抗 二羥維生素D代謝物抗體。在該方面的某些優(yōu)選的實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括測定 樣品中1 α，25 (OH)2D2的存在或量；優(yōu)選地1 α，25 (OH)2D2在質(zhì)譜法之前用4_苯基_1，2， 4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；更優(yōu)選地la，25(0H)2D2的前體離子質(zhì)/荷比為 586. 37 士 0. 5。在第四方面，提供了通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中l(wèi)a，25(0H)2D2的存在或量的方 法，其包括(a)通過HPLC純化Ια，25(0H)2D2 ； (b)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為411. 35 士 0. 5的Ia， 25 (OH)2D2的前體離子；(c)產(chǎn)生前體離子的一種或多種碎片離子，其中碎片離子包括選自 質(zhì)/荷比為151. 12士0. 5和135. 12士0. 5的離子的一種或多種離子；和(d)檢測步驟(b)或
(c)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種離子的存在或量，并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到樣品中的Ia， 25 (OH)2D2的存在或量。在該方面的優(yōu)選實施方式中，1 α，25 (OH) 2D2在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行 衍生。在某些優(yōu)選的實施方式中，樣品中的la，25(0H)2D2在步驟(a)之前通過免疫純化進(jìn) 行純化；優(yōu)選地免疫純化包括用免疫顆粒進(jìn)行的免疫純化；優(yōu)選地免疫顆粒具有結(jié)合到表 面的抗二羥維生素D代謝物抗體。在該方面的某些優(yōu)選的實施方式中，所述方法進(jìn)一步包 括測定樣品中1 α ,25 (OH)2D3的存在或量；優(yōu)選地1 α，25 (OH)2D3在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍 生；更優(yōu)選地1 α，25 (OH)2D3的前體離子質(zhì)/荷比為399. 35 士0. 5。在第五方面，提供了通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中l(wèi)a，25(0H)2D3的存在或量的方 法，其包括(a)通過HPLC純化Ια，25(0H)2D3 ;(b)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為399. 35 士 0.5的Ια， 25 (OH)2D3的前體離子；(c)產(chǎn)生前體離子的一種或多種碎片離子，其中碎片離子包括選自 質(zhì)/荷比為151. 12士0. 5和135. 12士0. 5的離子的一種或多種離子；和(d)檢測步驟(b)或 (c)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種離子的存在或量，并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到樣品中的Ia， 25 (OH)2D3的存在或量。在該方面的優(yōu)選實施方式中，1 α，25 (OH) 2D3在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行 衍生。在某些優(yōu)選的實施方式中，樣品中的la，25(0H)2D3在步驟(a)之前通過免疫純化進(jìn) 行純化；優(yōu)選地免疫純化包括用免疫顆粒進(jìn)行的免疫純化；優(yōu)選地免疫顆粒具有結(jié)合到表 面的抗二羥維生素D代謝物抗體。在該方面的某些優(yōu)選的實施方式中，所述方法進(jìn)一步包 括測定樣品中1 α，25 (OH)2D2的存在或量；優(yōu)選地1 α，25 (OH)2D2在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍 生；更優(yōu)選地1 α，25 (OH)2D2的前體離子質(zhì)/荷比為411. 35 士0. 5。術(shù)語“大約”如本文所用在提及定量測量時是指所示值加上或減去10%。
具體實施例方式檢測和量化測試樣品中二羥基維生素D代謝物的方法被描述。本文公開的一些優(yōu) 選方法采用液相層析(LC)——最優(yōu)選為HPLC——來純化所選的分析物，并且將該純化與質(zhì) 譜法(MS)的獨特方法組合，由此提供高通量測試系統(tǒng)用于檢測并量化測試樣品中的二羥 基維生素D代謝物。在某些特別優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前 進(jìn)行免疫純化。優(yōu)選的實施方式特別適于大的臨床實驗室應(yīng)用。檢測和量化二羥基維生素 D代謝物的方法被提供，其具有提高的特異性并且以比其它二羥基維生素D代謝物測試所 需的更少的時間和更少的樣品制備物實現(xiàn)。合適的測試樣品包括任何可包含感興趣分析物的測試樣品。例如，在分析物制備 期間獲得的樣品可以進(jìn)行分析以測定制備方法的組成和產(chǎn)率。在某些優(yōu)選的實施方式中， 樣品是生物學(xué)樣品；即，從任何生物來源諸如動物、細(xì)胞培養(yǎng)物、器官培養(yǎng)物等獲得的樣品。 在某些優(yōu)選的實施方式中，樣品從哺乳動物諸如狗、貓、馬等獲得。特別優(yōu)選的哺乳動物是 靈長類，最優(yōu)選地是人。特別優(yōu)選的樣品包括血液、血漿、血清、頭發(fā)、肌肉、尿液、唾液、淚 液、腦脊髓液或其它組織樣品。這樣的樣品可從例如患者——即將自己置于臨床環(huán)境中以 診斷、預(yù)測或治療疾病或病癥的有生命的個人——中得到。測試樣品優(yōu)選地從患者例如血 清中得到。質(zhì)譜法的樣品制備在質(zhì)譜法之前可采用方法以相對于樣品中的其它組分富集二羥基維生素D代謝 物或者增加樣品中二羥基維生素D代謝物的濃度。這樣的方法包括例如過濾、離心、薄層層 析(TLC)、包括毛細(xì)管電泳在內(nèi)的電泳、包括免疫親和分離在內(nèi)的親和分離、包括乙酸乙酯 提取和甲醇提取在內(nèi)的提取法以及離液劑的應(yīng)用或上述或類似方法的任何組合。樣品可進(jìn)行加工或純化以獲得適于通過質(zhì)譜法分析的制備物。這樣的純化應(yīng)通常 包括層析，諸如液相層析，并且還可通常包括在層析之前進(jìn)行的另外的純化方法。根據(jù)樣品 的類型或?qū)游龅念愋停鞣N方法可被用于該目的。實例包括過濾、提取、沉淀、離心、脫脂、稀 釋及其組合等。對于層析來說，蛋白質(zhì)沉淀是制備液體生物學(xué)樣品諸如血清或血漿的一種 優(yōu)選方法。這樣的蛋白質(zhì)純化方法在本領(lǐng)域中是熟知的，例如，Poison等人，Journal of Chromatography B785 =263-275(2003)描述了適合用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)沉淀方法。蛋 白質(zhì)沉淀可被用于從樣品中去除大部分蛋白質(zhì)，留下在上清液中可溶的二羥基維生素D代 謝物。樣品可被離心以將液態(tài)上清液與沉淀的蛋白質(zhì)分開。所得上清液然后可應(yīng)用于液相 層析和后來的質(zhì)譜法分析。在本發(fā)明的一個實施方式中，蛋白質(zhì)沉淀涉及將一份體積的液 體樣品(例如血漿)加入到大約四份體積的甲醇中。在某些實施方式中，蛋白質(zhì)沉淀的應(yīng) 用消除了在HPLC和質(zhì)譜法之前對高湍流液相層析(“HTLC”)或在線提取的需要。因此，在 這樣的實施方式中，所述方法涉及(1)進(jìn)行感興趣樣品的蛋白質(zhì)沉淀；和(2)在沒有使用 在線提取或高湍流液相層析(“HTLC”)的情況下將上清液直接加樣到HPLC-質(zhì)譜儀上。免疫純化在特別優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括在質(zhì)譜法分析之前免疫純化二羥基維生 素D代謝物。免疫純化步驟可采用本領(lǐng)域熟知的任何免疫純化方法進(jìn)行。通常免疫純化方 法采用與固體載體諸如柱、孔、管、膠囊、顆?；蝾愃莆锝Y(jié)合、偶聯(lián)、固定或另外方式連接的 抗體。一般地，免疫純化方法包括(1)將包含感興趣分析物的樣品與抗體溫育，以至于分析物結(jié)合于抗體，(2)進(jìn)行一個或多個洗滌步驟，和(3)從抗體中洗脫分析物。在某些實施方式中，免疫純化的溫育步驟與溶液中游離的抗體一起進(jìn)行，并且抗 體隨后在洗滌步驟之前結(jié)合或者連接到固體表面。在某些實施方式中，這可采用第一抗體 和第二抗體完成，其中第一抗體為抗二羥基維生素D抗體，第二抗體連接到對第一抗二羥 基維生素D抗體具有親和力的固體表面。在可選實施方式中，第一抗體在溫育步驟前結(jié)合 到固體表面。合適的固體載體非限制性地包括管、載玻片、柱、珠、膠囊、顆粒、凝膠和類似物。在 某些優(yōu)選的實施方式中，固體載體是多孔板，諸如，例如96孔板、384孔板或類似物。在某些 優(yōu)選的實施方式中，固體載體是瓊脂糖凝膠或瓊脂糖珠或凝膠。本領(lǐng)域中有許多熟知的可 將抗體(例如抗二羥基維生素D抗體或第二抗體)結(jié)合、連接、固定或偶聯(lián)到固體載體的方 法，例如共價或非共價鍵吸附、親和結(jié)合、離子鍵等。在某些優(yōu)選的實施方式中，抗體用CNBr 偶聯(lián)，例如抗體可被偶聯(lián)到CNBr活化的瓊脂糖凝膠。在其它實施方式中，抗體通過抗體結(jié) 合蛋白諸如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L連接到固體載體。免疫純化方法的洗滌步驟一般包括洗滌固體載體，以致于二羥基維生素D代謝物 保持結(jié)合到固體載體上的抗二羥基維生素D抗體。免疫純化的洗脫步驟一般包括加入干擾 二羥基維生素D代謝物結(jié)合到抗二羥基維生素D抗體的溶液。示例性的洗脫溶液包括有機(jī) 溶液(優(yōu)選地乙醇)、鹽溶液和高或低PH溶液。在某些優(yōu)選的實施方式中，免疫純化采用具有抗二羥基維生素D抗體的免疫顆粒 進(jìn)行。在某些優(yōu)選的實施方式中，可能包含二羥基維生素D代謝物的測試樣品和免疫顆粒 在試管中混合進(jìn)行溫育并且二羥基維生素D代謝物結(jié)合到連接免疫顆粒的抗二羥基維生 素D抗體上；試管進(jìn)行離心，在沉淀中留下免疫顆粒；去除上清液；通過向沉淀加入溶液將 免疫顆粒洗滌一次或多次并且再離心；以及通過將洗脫溶液加入免疫顆粒對二羥基維生素 D代謝物進(jìn)行洗脫，試管進(jìn)行離心，在沉淀中留下免疫顆粒；并且收集包含二羥基維生素D 代謝物的上清液。在相關(guān)的優(yōu)選實施方式中，免疫純化采用包含具有抗二羥基維生素D抗 體的免疫顆粒的柱或筒(cartridge)進(jìn)行。優(yōu)選地，這樣的柱或筒以這樣的方式被配置和 安排以使溶液流過而使免疫顆粒包含在其中。在某些優(yōu)選的實施方式中，溶液由于重力、 離心或壓力迫使通過柱或筒。柱的應(yīng)用可使進(jìn)行溫育、洗滌和洗脫步驟變得容易。在某 些優(yōu)選的實施方式中，免疫純化通過親和層析；優(yōu)選地通過自動親和層析；優(yōu)選地通過親 和-HPLC ；或優(yōu)選地采用自動化系統(tǒng)諸如由GE Healthcare (前稱Amersham biosciences) 商業(yè)銷售的AKTA FPLC層析系統(tǒng)進(jìn)行的親和層析來進(jìn)行。在某些實施方式中，樣品制備和免疫純化可采用商業(yè)可購得試劑盒的方法和試劑 進(jìn)行。例如，IDS Inc (Fountain Hills, AZ)提供1，25-二羥基維生素D125I放射性免疫測定 試劑盒(目錄號AA-54F1)，其包括放射性免疫測定(RIA)之前用于提取和免疫提取二羥基 維生素D的說明書和試劑。參見IDS，Inc.目錄號AA-54F1的試劑盒的“Product Support" 文件，其以其全部內(nèi)容通過引用并入本文。具體地，IDS 二羥基維生素D RIA試劑盒包括硫 酸葡萄糖/氯化鎂脫脂步驟和采用包含連接有對1，25 二羥基維生素D特異性的單克隆抗 體的顆粒懸浮液的免疫膠囊裝置進(jìn)行的免疫提取步驟。因此，在本文所述方法的某些實施 方式中，樣品經(jīng)歷采用IDS試劑盒或者類似于IDS試劑盒中提供的那些的方法、試劑和二羥 基維生素D免疫純化設(shè)備進(jìn)行維生素D免疫純化?？贵w和二羥基純化免疫純化設(shè)備也與由ALPODiagnostics (Salem, NH)商業(yè)提供的 1，25-(OH) 2-維生素 D ImmunoTube ELISA 試劑 盒(目錄號30-2113) —起提供。該試劑盒包括抗1，25-(OH)2維生素-D檢測抗體(目錄號 K2113A1)、用于Ia，25_ 二羥基維生素D的免疫純化的ImmunoTube柱(目錄號K2113. Si) 以及可用于免疫純化1，25-二羥基維生素D的緩沖液和其它試劑。在本文所述方法的某些 實施方式中，ALPO診斷試劑盒的一種或多種組分被用于免疫純化1，25- 二羥基維生素D。液相層析一般地，層析在質(zhì)譜法之前進(jìn)行，優(yōu)選地層析是液相層析，更優(yōu)選地是高效液相層 析(HPLC)。在某些優(yōu)選的實施方式中，層析不是氣相層析。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法在沒有使 樣品或感興趣二羥基維生素D代謝物在質(zhì)譜分析之前經(jīng)歷氣相層析的情況下進(jìn)行。包括高效液相層析(HPLC)在內(nèi)的液相層析(LC)依賴于相對慢的層流技術(shù)。傳統(tǒng) 的HPLC分析依賴于柱填充，其中樣品穿過柱的層流是將感興趣分析物從樣品中分離的基 礎(chǔ)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解這種柱中的分離是擴(kuò)散過程。HPLC已經(jīng)成功地用于生物學(xué) 樣品中化合物的分離。但是，在分離之前需要大量的樣品制備并且隨后用質(zhì)譜儀(MS)進(jìn)行 分析，使得該技術(shù)需密集勞動。此外，大部分HPLC系統(tǒng)沒有盡其最大可能地利用質(zhì)譜儀，使 得僅僅一個HPLC系統(tǒng)連接到單一的MS儀器，導(dǎo)致進(jìn)行大量測定需要過長的時間。已經(jīng)描述了各種方法，其包括將HPLC用于質(zhì)譜法分析之前的樣品清理 (clean-up)。參見例如 Taylor 等人，Therapeutic Drug Monitoring 22 :608_12 (2000)(血 液樣品的人工沉淀，接著人工C18固相提取，注射到HPLC用于在C18分析柱上的層析和MS/ MS 分析)；和 Salm 等人，Clin. Therapeutics 22Supl. B :B71_B85 (2000)(血液樣品的人工 沉淀，接著人工C18固相提取，注射到HPLC用于在C18分析柱上的層析和MS/MS分析)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可選擇適合用于本發(fā)明的HPLC儀器和柱。層析柱通常包括 便于分離化學(xué)物部分(即分餾)的介質(zhì)(即填充物質(zhì))。介質(zhì)可包括微小顆粒。顆粒包括 結(jié)合表面，其與各種化學(xué)物部分(chemical moieties)相互作用以促進(jìn)化學(xué)物部分的分離。 一個合適的結(jié)合表面是疏水性結(jié)合表面諸如烷基結(jié)合表面。烷基結(jié)合表面可包括C-4、C-8 或C-18結(jié)合烷基基團(tuán)，優(yōu)選地C-18結(jié)合基團(tuán)。層析柱包括接收樣品的入口和排出包括分 餾的樣品的流出物的出口。在一實施方式中，樣品(或預(yù)先純化的樣品)在入口處被施加 到柱，用溶劑或溶劑混合物進(jìn)行洗脫，并且在出口處排出?？蛇x擇不同的溶劑模式用于洗脫 感興趣分析物。例如，液相層析可采用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式。在層析 期間，物質(zhì)的分離受到變量諸如洗脫液(也稱為“流動相”)的選擇、梯度洗脫和梯度條件的 選擇、溫度等的影響。在某些實施方式中，分析物可在感興趣分析物被柱填充物質(zhì)可逆地保留而一種或 多種其它物質(zhì)沒有被保留的條件下通過將樣品施加到柱中進(jìn)行純化。在這些實施方式中， 可應(yīng)用第一流動相條件，其中感興趣分析物被柱保留，并且一旦未保留的物質(zhì)被洗滌穿過， 隨后可應(yīng)用第二流動相條件以從柱中去除保留的物質(zhì)?？蛇x地，分析物可在相比一種或多 種其它物質(zhì)感興趣分析物以不同的速度洗脫的流動相條件下通過將樣品施加到柱中進(jìn)行 純化。這種方法可相對于樣品的一種或多種其它組分富集一種或多種感興趣分析物的量。最近，高湍流液相層析(“HTLC” )，也被稱為高通量液相層析，已經(jīng)被用于在通過 質(zhì)譜法分析之前的樣品制備。參見例如Zimmer等人，J. Chromatogr. A854 =23-35(1999)； 也可參見美國專利號5，968，367,5, 919，368,5, 795，469和5，772，874。傳統(tǒng)HPLC分析依賴于柱填充，其中樣品穿過柱的層流是將感興趣分析物從樣品中分離的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員會理解這種柱中的分離是擴(kuò)散過程。相反，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，湍流諸如HTLC柱和方法所 提供的湍流可提高傳質(zhì)速度，改進(jìn)所提供的分離特性。在一些實施方式中，高湍流液相層析 (HTLC)，單獨地或與一種或多種純化方法一起，可被用于在質(zhì)譜法之前純化感興趣的二羥 基維生素D代謝物。在這樣的實施方式中，樣品可采用捕獲分析物的HTLC提取筒進(jìn)行提取， 然后在離子化之前在第二 HTLC柱或分析用HPLC柱上洗脫并層析。因為包含在這些層析方 法中的步驟可以自動方式連接，所以對分析物純化期間操作者參與的需求可最小化。在該 方法的某些實施方式中，樣品在加載到HTLC柱之前經(jīng)歷上述的蛋白質(zhì)沉淀；在可選實施方 式中，樣品可直接加載到HTLC上，而不經(jīng)歷蛋白質(zhì)沉淀。最近，研究已經(jīng)表明維生素D3代謝物的A環(huán)的羥基的差向異構(gòu)是維生素D3代謝和 生物活化的重要方面，并且取決于所參與的細(xì)胞類型，維生素D3代謝物的3-C差向異構(gòu)體 (例如3-表-25 (OH) D3、3-表-24，25 (OH) 2D3和3-表-1，25 (OH) 2D3)通常是主要的代謝產(chǎn) 物。參見 Kamao 等人，J. Biol. Chem.，279 15897-15907 (2004)。Kamao 等人進(jìn)一步提供采 用手性HPLC分離包括3-C差向異構(gòu)體在內(nèi)的各種維生素D代謝物的方法。因此，本發(fā)明還 提供通過下列步驟檢測樣品中一種或多種維生素D代謝物優(yōu)選地維生素D3代謝物的具體 差向異構(gòu)體的存在、不存在和/或量的方法(1)通過手性層析優(yōu)選地手性HPLC分離一種 或多種特定維生素D代謝物；和(2)采用如本文所述的質(zhì)譜法檢測一種或多種維生素D代 謝物的存在和/或量。Kamao等人中描述的手性層析方法適用于本發(fā)明的方法，然而本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員理解存在許多其它也將適合的手性層析方法。在優(yōu)選的實施方式中，所述方 法包括采用手性層析將25 (OH) D3與3-表-25 (OH) D3分開，如果樣品中存在的話；和采用質(zhì) 譜法檢測樣品中25 (OH) D3和3-表-25 (OH) D3的存在和/或量。在相關(guān)的實施方式中，所述 方法包括采用手性層析將1 α，25 (OH) D3與3_表-25 (OH) D3分開，如果樣品中存在的話；和 采用質(zhì)譜法檢測樣品中1 α，25 (OH) D3和3_表-25 (OH) D3的存在和/或量。在本發(fā)明的某 些實施方式中，手性層析與上述的HTLC方法聯(lián)合使用。通過質(zhì)譜法的檢測和定量公開的是檢測樣品中一種或多種二羥基維生素D代謝物的存在或量的方法。在某 些方面，所述方法包括電離二羥基維生素D代謝物(或多種)，通過質(zhì)譜法檢測離子(或多 種)，和將離子(或多種)的存在或量與樣品中二羥基維生素D代謝物(或多種)的存在 或量關(guān)聯(lián)。所述方法可包括(a)純化二羥基維生素D代謝物，如果樣品中存在的話，(b)電 離純化的二羥基維生素D代謝物，和(c)檢測離子的存在或量，其中將離子的存在或量與樣 品中二羥基維生素D代謝物的存在或量關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實施方式中，電離步驟(b)可包括 (i)電離二羥基維生素D代謝物，如果樣品中存在的話，以產(chǎn)生離子；(ii)通過質(zhì)譜法分離 二羥基維生素D代謝物粒子以提供前體離子；和(iii)在分離的前體和惰性碰撞氣體之間 實施碰撞以產(chǎn)生至少一個在質(zhì)譜儀中可檢測的碎片離子。在某些優(yōu)選的實施方式中，前體 離子是二羥基維生素D代謝物的質(zhì)子化和脫水離子。進(jìn)一步提供了通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定測試樣品中二羥基維生素D代謝物的存在或 量的方法。所述方法可包括(a)產(chǎn)生二羥基維生素D代謝物的質(zhì)子化和脫水前體離子；(b) 產(chǎn)生前體離子的一種或多種碎片離子；和(c)檢測步驟(a)或(b)或兩者中產(chǎn)生的一種或 多種離子的存在或量并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到樣品中的二羥基維生素D代謝物的存在或量。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方式中，至少一種碎片被檢測到，其中將前體和/或 至少一個片段的存在或量關(guān)聯(lián)到樣品中的二羥基維生素D代謝物的存在或量。優(yōu)選地，至 少一種碎片離子對感興趣二羥基維生素D代謝物具有特異性。在一些實施方式中，本發(fā)明 的方法可用于檢測或定量單一測試中的兩種或多種二羥基維生素D代謝物。采用包括離子源的質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜法，所述離子源用于電離分餾的樣品并產(chǎn)生 帶電分子用于進(jìn)一步分析。例如樣品的電離可通過電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離 (APCI)、光致電離、電子電離、快原子轟擊(FAB)/液體二次電離(LSIMS)、基質(zhì)輔助激光解 吸電離(MALDI)、場致電離、場致解吸、熱噴霧/等離子噴霧電離和粒子束電離進(jìn)行。技術(shù)人 員應(yīng)理解電離方法的選擇可根據(jù)要測量的分析物、樣品類型、檢測器類型、正-負(fù)模式的選 擇等進(jìn)行確定。樣品已經(jīng)電離后，由此產(chǎn)生的帶正電或帶負(fù)電的離子可進(jìn)行分析以測定質(zhì)荷比 (即m/z)。用于測定質(zhì)荷比的合適分析器包括四極分析器、離子阱分析器和飛行時間分析 器。離子可采用幾種檢測模式進(jìn)行檢測。例如，所選離子可以進(jìn)行檢測(即采用選擇離子 檢測模式(SIM))，或者可選地，離子可采用掃描模式例如多反應(yīng)檢測(MRM)或選擇反應(yīng)檢 測(SRM)進(jìn)行檢測。優(yōu)選地，質(zhì)/荷比采用四極分析器進(jìn)行測定。例如，在“四極”或“四極 離子阱”儀器中，振蕩射頻場中的離子經(jīng)歷與電極之間施加的DC電壓、RF信號的振幅和m/ ζ成比例的力?？梢赃x擇電壓和振幅，以致于只有特定m/z的離子傳播四極的長度，而所有 其它離子是偏離的。因此，四極儀器可對注入到儀器的離子起到“質(zhì)量過濾器”和“質(zhì)量檢 測器”的作用。技術(shù)人員可通過利用“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“MS/MS”提高M(jìn)S技術(shù)的分辨率。在該技術(shù) 中，從感興趣分子中產(chǎn)生的前體離子(也稱為母體離子)可在MS儀器中進(jìn)行過濾，并且前 體離子隨后成碎片以產(chǎn)生一種或多種碎片離子(也稱為子離子或產(chǎn)物離子)，其然后在第 二 MS程序中進(jìn)行分析。通過仔細(xì)選擇前體離子，僅僅由某些分析物產(chǎn)生的離子通過至碎裂 室，在其中與惰性氣體原子碰撞以產(chǎn)生子離子(daughter ions)。因為前體和碎片離子都是 在給定系列的電離/破碎條件下以可再生方式產(chǎn)生的，所以MS/MS技術(shù)可提供極其強(qiáng)大的 分析工具。例如，過濾/破裂組合可被用于消除干擾物質(zhì)，并且可特別用于復(fù)雜樣品諸如生 物學(xué)樣品。此外，技術(shù)上的最新進(jìn)展諸如與飛行時間分析器連接的基質(zhì)輔助激光吸附電離 (“MALDI-T0F”)允許分析物在非常短的離子脈沖下在飛摩爾(femtomole)水平上的分析。 將飛行時間分析器與串聯(lián)MS組合的質(zhì)譜儀對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也是熟知的。此外，多個 質(zhì)譜法步驟可在被稱為“MS/MSn”的方法中進(jìn)行組合?？刹捎酶鞣N其它組合，諸如MS/MS/ TOF、MALDI/MS/MS/T0F 或 SELDI/MS/MS/T0F 質(zhì)譜法。質(zhì)譜儀一般給用戶提供離子掃描；即，在給定范圍(例如100至IOOOamu)內(nèi)具有 特定m/z的各個離子的相對豐度。分析物測試的結(jié)果，即質(zhì)譜，可通過本領(lǐng)域已知的許多方 法關(guān)聯(lián)到原始樣品中分析物的量。例如，假定取樣和分析參數(shù)進(jìn)行仔細(xì)控制，可將給定離子 的相對豐度與將相對豐度轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對量的表進(jìn)行比較?？蛇x地，分子標(biāo)準(zhǔn)可用 樣品運行，并且基于從那些標(biāo)準(zhǔn)中產(chǎn)生的離子構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用這種標(biāo)準(zhǔn)曲線，給定離子 的相對豐度可被轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對量。在某些優(yōu)選的實施方式中，內(nèi)標(biāo)被用于產(chǎn)生計算二羥基維生素D代謝物的數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。產(chǎn)生和利用這種標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法在本領(lǐng)域 中是熟知的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能選擇合適的內(nèi)標(biāo)。例如，二羥基維生素D代謝物 的同位素可被用作內(nèi)標(biāo)，在優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物是含重氫的二羥基 維生素 D 代謝物，例如 Ia，25 (OH)2D2-[26，26，26，27，27，27]-2H 或 Ia，25 (OH)2D3-[6，19， 19’ ]-2H或兩者。將離子的存在或量與原始分子的存在或量關(guān)聯(lián)的許多其它方法對本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員應(yīng)是熟知的。本發(fā)明方法的一種或多種步驟可采用自動儀器進(jìn)行。在某些實施方式中，一種或 多種純化步驟在線進(jìn)行，并且更優(yōu)選地所有純化和質(zhì)譜法步驟可以在線的方式進(jìn)行。在某些實施方式中，諸如MS/MS，其中前體離子被分離以進(jìn)一步破裂，碰撞活化分 裂通常被用于產(chǎn)生碎片離子以進(jìn)一步檢測。在CAD中，前體離子通過與惰性氣體碰撞獲得 能量，并且隨后通過被稱為“單分子分解”的過程產(chǎn)生碎片。足夠的能量必須儲蓄在前體離 子中以致于離子內(nèi)的某些鍵可由于增加的振動能而斷開。在特別優(yōu)選的實施方式中，二羥基維生素D代謝物如下采用LC-MS/MS進(jìn)行檢測和 /或定量。樣品經(jīng)歷液相層析，優(yōu)選地HPLC，來自層析柱的液體溶劑流進(jìn)入LC-MS/MS分析 儀的加熱噴霧器界面，并且溶劑/分析物混合物在界面的加熱管中被轉(zhuǎn)化為蒸汽。包含在 霧狀溶劑中的分析物(即二羥基維生素D代謝物)被界面的冠狀放電針電離，其將大的電 壓施加到霧狀溶劑/分析物混合物。離子即前體離子穿過儀器的孔并且進(jìn)入第一個四極。 四極1和3 (QI和Q3)是質(zhì)量過濾器，允許根據(jù)它們的質(zhì)荷比(m/z)選擇離子(即“前體”和 “碎片”離子)。四極2(Q2)為碰撞單元，其中離子被破裂。質(zhì)譜儀的第一個四極(Ql)選擇 具有要分析的特定二羥基維生素D代謝物的質(zhì)荷比的分子。具有特定二羥基維生素D代謝 物的前體離子的正確m/z比的前體離子被允許穿到碰撞室(Q2)中，而具有任何其它m/z的 多余離子與四極的側(cè)面碰撞并且被除去。進(jìn)入Q2的前體離子與中性氬氣分子和碎片碰撞。 該過程被稱為碰撞活化分裂(CAD)。所產(chǎn)生的碎片離子穿到四極3(Q3)，其中想得到的二羥 基維生素D代謝物的碎片離子被選擇而其它離子被除去。本發(fā)明的方法可包括在正或負(fù)離子模式下進(jìn)行的MS/MS。采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn) 方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能鑒別可用于在四極3 (Q3)中選擇的二羥基維生素D代謝物的 特定前體離子的一種或多種碎片離子。如果感興趣二羥基維生素D代謝物的前體離子包括醇或胺基團(tuán)，通常形成分別代 表前體離子的脫水或去氨基的碎片離子。在包括醇基團(tuán)的前體離子的情況下，通過脫水形 成的這些碎片離子通過從前體離子中失去一個或多個水分子而形成(即，其中前體離子與 碎片離子之間的m/z差對于失去一個水分子來說是大約18，或者對于失去兩個水分子來說 大約36等)。在包括胺基團(tuán)的前體離子的情況下，通過去氨基形成的這些碎片離子通過失 去一個或多個氨分子而形成(即，其中前體離子與碎片離子之間的m/z差對于失去一個氨 分子來說是大約17，或者對于失去兩個氨分子來說大約34等)。同樣，包括一個或多個醇 和氨基的前體離子常常形成代表失去一個或多個水分子和/或一個或多個氨分子的碎片 離子(例如，其中前體離子與碎片離子之間的m/z差對于失去一個水分和失去一個氨分子 來說是大約35)。一般地，代表脫水或去氨基的碎片離子不是對特定分析物的特定碎片離 子。隨著離子與檢測器碰撞，它們產(chǎn)生轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被傳遞到計算機(jī)，其將所收集的離子數(shù)對時間作圖。所產(chǎn)生的質(zhì)量層析圖類似于在傳統(tǒng)HPLC 方法中產(chǎn)生的層析圖。測量對應(yīng)于特定離子的峰下面的面積或這些峰的振幅，并且面積或 振幅被關(guān)聯(lián)到感興趣分析物(維生素D代謝物)的量。在某些實施方式中，對碎片離子(或 多種)和/或前體離子來說的曲線下面積或峰的振幅進(jìn)行測量以測定二羥基維生素D代謝 物的量。如上所述，給定離子的相對豐度可基于內(nèi)部分子標(biāo)準(zhǔn)諸如6D_250HD3的一種或多種 離子的峰采用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化成原始分析物即二羥基維生素D代謝物的絕對量。在本發(fā)明的某些方面，各種離子的數(shù)量通過測量曲線下面積或峰的振幅進(jìn)行測 定，并且計算并檢測離子的數(shù)量比(即“子離子比檢測”)。在該方法的某些實施方式中，可 以計算二羥基維生素D代謝物的前體離子的數(shù)量和一種或多種碎片離子的數(shù)量之比并且 與類似測量的二羥基維生素D代謝物的分子標(biāo)準(zhǔn)的比(或多種)進(jìn)行比較。在檢測到二羥 基維生素D代謝物的一種以上碎片離子的實施方式中，而不是碎片離子(或多種)相比前 體離子的比，或者除了碎片離子(或多種)相比前體離子的比之外，可以測定不同碎片離子 的比(或多種)。在檢測這種比值的實施方式中，如果樣品中的離子比相比分子標(biāo)準(zhǔn)存在 大的差別，很可能樣品中的分子對結(jié)果產(chǎn)生干擾。相反，如果樣品和分子標(biāo)準(zhǔn)中的離子比類 似，那么可信度增加，沒有干擾。因此，檢測樣品中的這些比值已經(jīng)將這些比值與可信分子 標(biāo)準(zhǔn)的那些比值比較可用于增加方法的精確性。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，樣品中兩個或多種二羥基維生素D代謝物的存 在或不存在或量采用上述MS/MS方法在單一測試中進(jìn)行檢測。下列實施例起到闡明本發(fā)明的作用。這些實施例絕對沒有意圖限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1 通過LC-MS/MS測定1 α . 25- 二羥基維生素隊和1 α，25- 二羥基維生素 D2 將 50 μ 1 內(nèi)標(biāo)混合物(摻有 50pg/50 微升的 1 α，25 (OH) 2D3_[6，19，19]_2H 和 200pg/50 微升的Ια ,25 (OH) 2D2-[26，26，26，27，27，27] -2H的處理的血清)加入到試管中，然后添加 500 μ 1的校準(zhǔn)溶液、質(zhì)量控制試液或血清標(biāo)準(zhǔn)，接著添加內(nèi)標(biāo)混合物。溶液通過加入50μ 1 MgCl2/硫酸葡萄糖溶液并且完全混合進(jìn)行脫脂。然后離心試管20分鐘，并且將500 μ 1上 清液轉(zhuǎn)移到來自ALPCO Diagnostics的包含抗二羥基維生素D免疫膠囊的ImmunoTube筒 (目錄號K2113.SI)。筒在室溫下在振蕩器上溫育兩個小時。然后用750 μ 1去離子水將珠 子洗滌三次。珠子在通過將筒離心而進(jìn)行的洗滌之間被排水。與珠子結(jié)合的二羥基維生素 D用250 μ 1乙醇直接洗脫進(jìn)入玻璃HPLC插件中，然后在氮氣下完全干燥。然后樣品通過加 入50 μ 1的4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)溶液(0. 8mg/mL，在乙腈中)進(jìn)行衍 生。衍生反應(yīng)通過加入50ul去離子水而停止。然后，HPLC插件被轉(zhuǎn)移到HPLC自動取樣器以加載到LC-MS/MS分析器。LC-MS/ MS采用具有大氣壓化學(xué)電離(APCI)源的Thermo Finnigan LC-MS/MS分析儀(Thermo Finnigan Quantum TSQ (S/N :TQU00655))作為檢測器進(jìn)行。自動取樣器被用于將90 μ L提 取的樣品上清液注射到HPLC柱。液相層析采用以0.8mL/分鐘運行的Synergi Max-RP C-12Phenomenex柱進(jìn)行。兩種流動相溶液被用于HPLC 流動相A是HPLC等級水中的0. 1 % 甲酸并且流動相B為100%乙腈?？偟倪\行時間為5. OOmin，其中收集窗在1 :31-2 :31之間 (60秒)。初始條件(20秒)為50%流動相A和50%流動相B ；梯度(160秒)從50%流動相A和50%流動相B至2%流動相A和98%流動相B ；洗滌步驟為(60秒)為2%流動相A 和98%流動相B ；以及再調(diào)整步驟為50%流動相A和50%流動相B。流出HPLC柱的液體溶劑流進(jìn)入Thermo Finnigan LC-MS/MS分析儀的加熱噴霧器 表面，并且二羥基維生素D代謝物采用正模式的APCI進(jìn)行測量。溶劑/分析物混合物首先 在界面的加熱管中被轉(zhuǎn)化為蒸汽。包含在霧狀溶劑中的分析物被界面的冠狀放電針電離 (正電荷被加入)，其將大的電壓施加到霧狀溶劑/分析物混合物。離子穿過儀器的孔并且 進(jìn)入第一個四極。四極1和3 (Ql和Q3)是質(zhì)量過濾器，允許根據(jù)它們的質(zhì)荷比(m/z)選擇 離子(即“前體”和“碎片”離子)。四極2(Q2)為碰撞單元，在其中離子被破裂。質(zhì)譜儀的第一個四極(Ql)選擇具有1 α，25 (OH) 2D2、1 α，25 (OH) 2D3、6D_1 α， 25 (OH)2D2 (內(nèi)標(biāo))和-Ια，25 (OH)2D3 (內(nèi)標(biāo))的質(zhì)/荷比的分子。具有這些m/z比(參見 下表)的離子被允許通過至碰撞室(Q2)，而具有任何其它m/z的多余離子與四極的側(cè)面碰 撞并且被除去。進(jìn)入Q2的離子與中性氬氣分子和碎片碰撞。所產(chǎn)生的碎片離子穿到四極 3(Q3)，其中 Ia，25 (OH)2D2U α，25 (OH) 2D3、6D_1 α，25 (OH) 2D2 (內(nèi)標(biāo))禾口 _1 α，25 (OH)2D3 (內(nèi) 標(biāo))的碎片離子被選擇(參見下表)而其它離子被除去。下列質(zhì)量轉(zhuǎn)變被用于在確認(rèn)期間 的檢測和定量表1.所選二羥基維生素D代謝物的質(zhì)量轉(zhuǎn)變
分析物前體離子產(chǎn)物離子1 a ,25 (OH) 2D3574. 37314. 121 α，25 (OH)2D3-[6，19，19，] -2H (內(nèi)標(biāo))577. 37317. 121 a ,25 (OH) 2D2586.37314. 121 α，25 (OH)2D2-[26，26，26， 27，27，27]-2H (內(nèi)標(biāo))592. 37314. 12 隨著離子與檢測器碰撞，它們產(chǎn)生轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號的電子脈沖。所獲得的數(shù)據(jù)被 傳遞到計算機(jī)，其將所收集的離子數(shù)對時間作圖。所得的質(zhì)量層析譜類似于在傳統(tǒng)HPLC方 法中產(chǎn)生的層析譜。分析物和內(nèi)標(biāo)(1α，25(0H)2D3_[6，19，19，]_2H 禾口 1 α，25 (OH)2D2-[26，26，26，27， 27, 27]-2H)峰的面積比被用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其然后被用于計算分析物濃度。采用標(biāo)準(zhǔn)曲 線，患者樣品中1 a，25 (OH)2D2和1 a，25 (OH)2D3的濃度在患者樣品中被定量。實施例2 實驗內(nèi)和實驗間的精度Ia ,25 (OH)2D2和1 a，25 (OH)2D3的儲備液被加入到合并的血清(pooled serum)中 以產(chǎn)生低區(qū)(Low Pool) (10-15ng/mL各代謝物)、中低區(qū)(25-35ng/mL各代謝物)、中高區(qū)(55-65ng/mL各代謝物)和高區(qū)(115-130ng/mL)。來自各個低、中低、中高和高區(qū)的四等分 采用實施例1中描述的LC-MS/MS方法在單一實驗中進(jìn)行分析。測得下列精度值表2.實驗內(nèi)變化1α，25-二羥基維生素D2 (Ια，25 (OH)2D2) 表3.實驗內(nèi)變化1α，25-二羥基維生素D3 (Ια，25 (OH)2D3) 本文提到或引用的文章、專利和專利申請以及所有其它文件或電子可得到的信息 的內(nèi)容以其全部內(nèi)容通過引用并入本文至這樣的程度，如同每一單獨的出版物被具體且單 獨地顯示通過引用并入。申請人保留將任何和所有的來自任何這些文章、專利、專利申請或 其它物理和電子文件的物質(zhì)和信息物理上并入本申請的權(quán)利。本文例證性描述的本發(fā)明可在本文沒有具體公開的任何元素或多個元素、限制 或多個限制不存在的情況下合適地實施。因此，例如術(shù)語“包括(comprising)”、“包括 (including) ”、“包含(containing) ”等應(yīng)當(dāng)廣義且非限制性地理解。此外，本文所用的術(shù) 語和表達(dá)已經(jīng)作為描述性術(shù)語而不是限制性術(shù)語使用，并且沒有意圖使用這種將所示和所 述特征的等價形式或其部分排除的術(shù)語和表達(dá)，但是應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到在所請求保護(hù)的發(fā)明范圍 內(nèi)各種改變是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明通過優(yōu)選的實施方式和可選特征具體地 公開，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可訴諸于本文公開的其中實施的本發(fā)明的改變和變化，并 且這種改變和變化被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明在本文中已經(jīng)作了廣泛且一般性的描述。落入上位公開內(nèi)容中的每一個較 窄類別和亞組也構(gòu)成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般描述，條件是或者否定性的限制 是從種類中去除了任何主題內(nèi)容，無論排除的物質(zhì)是否在本文中具體描述。其它實施方式在下列權(quán)利要求之內(nèi)。此外，在本發(fā)明的特征或方面按照馬庫什組 進(jìn)行描述的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明也因此按照馬庫什組的任何單個成員或成員的亞組進(jìn)行描述。
權(quán)利要求
通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中一種或多種二羥基維生素D代謝物的量的方法，其包括(a)從所述樣品中免疫純化所述二羥基維生素D代謝物；(b)通過HPLC進(jìn)一步純化來自步驟(a)的免疫純化的二羥基維生素D代謝物；(c)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定從步驟(b)獲得的維生素D代謝物的量，其包括(i)產(chǎn)生所述一種或多種二羥基維生素D代謝物的前體離子；(ii)產(chǎn)生所述前體離子的一個或多個碎片離子；和(iii)檢測步驟(i)或(ii)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量并且將檢測的離子關(guān)聯(lián)到所述樣品中的所述一種或多種二羥基維生素D代謝物的量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫純化步驟利用免疫顆粒。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述免疫顆粒包括抗二羥基維生素D抗體。
4.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物沒有經(jīng) 歷衍生。
5.權(quán)利要求1-3的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物在質(zhì)譜 法之前進(jìn)行衍生。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前用 4-取代的1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(TAD)進(jìn)行衍生。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前用 4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前用 4’ -羧苯基-TAD進(jìn)行衍生。
9.權(quán)利要求1-8的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物包括 1 α，25 (OH)2D2。
10.權(quán)利要求1-8的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物包括 1 α，25 (OH)2D3。
11.權(quán)利要求1-10的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物包括 1 α ,25 (OH)2D2和1 α ,25 (OH)2D3并且其中所述代謝物的所述量在單一測試中進(jìn)行測定。
12.權(quán)利要求1-3、5、6和9-11的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D 代謝物包括la，25(0H)2D2 ；其中所述Ια，25(0H)2D2在質(zhì)譜法之前用4_苯基-1，2，4_三唑 啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；并且其中所述la，25(0H)2D2的所述前體離子的質(zhì)/荷比 為 586. 37 士 0. 5。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括質(zhì)/荷比314.12士0. 5的罔子。
14.權(quán)利要求1-3、5、6和9-13的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D 代謝物包括Ia ,25 (OH) 2D3 ；其中所述1 a，25 (OH) 2D3在質(zhì)譜法之前用4_苯基-1，2，4_三唑 啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；并且其中所述la，25(0H)2D3的所述前體離子的質(zhì)/荷比 為 574. 37 士 0. 5。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括質(zhì)/荷比314.12士0. 5的離子。
16.權(quán)利要求1-4和9-11的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代 謝物包括1 α ,25 (OH)2D2 ；其中所述1 α ,25 (OH)2D2在質(zhì)譜法之前進(jìn)行衍生；并且其中所述 la，25(0H)2D2的所述前體離子的質(zhì)/荷比為411. 35 士 0. 5。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括選自質(zhì)/荷比為 151. 12士0. 5和135. 12士0. 5的離子的一種或多種離子。
18.權(quán)利要求1-4、9-11、16和17的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素 D代謝物包括1 α，25 (OH)2D3 ；其中所述1 α，25 (OH)2D3沒有進(jìn)行衍生；并且其中所述1 α， 25 (OH)2D3的所述前體離子的質(zhì)/荷比為399. 35士0. 5。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述一種或多種碎片離子包括選自質(zhì)/荷比為 151. 12士0. 5和135. 12士0. 5的離子的一種或多種離子。
20.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中1a ,25 (OH)2D2的量的方法，其包括(a)在所述樣品中用4-苯基-1，2，4_三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生所述Ia， 25 (OH) 2D2 ；(b)通過HPLC純化來自步驟(a)的衍生的Ia,25 (OH) 2D2 ；(c)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為586.37士0.5的從步驟(b)中得到的衍生的1 a，25 (OH)2D2的前 體離子；(d)產(chǎn)生所述前體離子的一種或多種碎片離子，其中所述一種或多種碎片離子中的至 少一種包括質(zhì)/荷比為314. 12士0. 5的離子；和(e)檢測步驟(c)或(d)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量并且將檢測的離子 關(guān)聯(lián)到所述樣品中的所述1 a ,25 (OH)2D2的量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述樣品中的所述la，25(0H)2D2在步驟(a)之前通過 免疫純化進(jìn)行純化。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述免疫純化利用免疫顆粒。
23.權(quán)利要求20-22的任一項的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括測定所述樣品中的所 述 Ia，25 (OH)2D3 的量。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述1a，25 (OH) 2D3在質(zhì)譜法之前用4-苯基-1，2，4-三 唑啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；并且其中所述la，25(0H)2D3的所述前體離子的質(zhì)/荷 比為 574. 37士0. 5。
25.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中1a ,25 (OH)2D3的量的方法，其包括(a)在所述樣品中用4-苯基-1，2，4_三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生所述Ia， 25 (OH) 2D3 ；(b)通過HPLC純化步驟(a)的衍生Ia,25 (OH)2D3 ；(c)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為574.37 士0. 5的衍生的1 α，25 (OH)2D3的前體離子；(d)產(chǎn)生所述前體離子的一種或多種碎片離子，其中所述一種或多種碎片離子中的至 少一種包括質(zhì)/荷比為314. 12士0. 5的離子；和(e)檢測步驟(c)或(d)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量并且將檢測的離子 關(guān)聯(lián)到所述樣品中的所述1 a ,25 (OH)2D3的量。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述樣品中的所述la，25(0H)2D3在步驟(a)之前通過 免疫純化進(jìn)行純化。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述免疫純化利用免疫顆粒。
28.權(quán)利要求25-27的任一項的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括測定所述樣品中1α， 25 (OH)2D2 的量。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述1α，25 (OH) 2D2在質(zhì)譜法之前用4-苯基-1，2，4-三 唑啉-3，5-二酮(PTAD)進(jìn)行衍生；并且其中所述la，25(0H)2D2的所述前體離子的質(zhì)/荷 比為 586. 37士0. 5。
30.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中1a ,25 (OH)2D2的量的方法，其包括(a)通過HPLC 純化所述 Ia ,25 (OH) 2D2 ；(b)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為411.35士0.5的從步驟(a)中得到的所述1 α，25 (OH)2D2的前體 離子；(c)產(chǎn)生所述前體離子的一種或多種碎片離子，其中所述一種或多種碎片離子包括選 自質(zhì)/荷比為151. 12士0. 5和135. 12士0. 5的離子的一種或多種離子；和(d)檢測步驟(b)或(c)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量并且將檢測的離子 關(guān)聯(lián)到所述樣品中的所述1 α ,25 (OH)2D2的量；其中所述1 α，25 (OH)2D2沒有進(jìn)行衍生。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述樣品中的所述la，25(0H)2D2在步驟(a)之前通過 免疫純化進(jìn)行純化。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫純化利用免疫顆粒。
33.權(quán)利要求30-32的任一項的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括測定所述樣品中的所 述 Ia，25 (OH)2D3 的量。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述1a，25 (OH) 2D3在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍生；并且其 中所述1 α，25 (OH)2D3的所述前體離子的質(zhì)/荷比為399. 35 士0. 5。
35.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中1a ,25 (OH)2D3的存在或量的方法，其包括(a)通過HPLC 純化衍生 Ia ,25 (OH) 2D3 ；(b)產(chǎn)生質(zhì)/荷比為399.35士0. 5的從步驟(a)中得到的所述1 α，25 (OH)2D3的前體 離子；(c)產(chǎn)生所述前體離子的一種或多種碎片離子，其中所述一種或多種碎片離子包括選 自質(zhì)/荷比為151. 12士0. 5和135. 12士0. 5的離子的一種或多種離子；和(d)檢測步驟(b)或(c)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量并且將檢測的離子 關(guān)聯(lián)到所述樣品中的所述1 α ,25 (OH)2D3的量；其中所述la，25(0H)2D3在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍生。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述樣品中的所述la，25(0H)2D3在步驟(a)之前通過 免疫純化進(jìn)行純化。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述免疫純化利用免疫顆粒。
38.權(quán)利要求35-37的任一項的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括測定所述樣品中的所 述 Ia，25 (OH)2D2 的量。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述1a，25 (OH) 2D2在質(zhì)譜法之前沒有進(jìn)行衍生；并且其 中所述1 α，25 (OH)2D2的所述前體離子的質(zhì)/荷比為411. 35士0. 5。
40.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中一種或多種二羥基維生素D代謝物的量的方法，其包4括(a)從所述樣品中免疫純化所述二羥基維生素D代謝物；(b)通過串聯(lián)質(zhì)譜法測定從步驟(a)獲得的維生素D代謝物的量，其包括 (i)產(chǎn)生所述一種或多種二羥基維生素D代謝物的前體離子；( )產(chǎn)生所述前體離子的一種或多種碎片離子；和(iii)檢測步驟(i)或(ii)或兩者中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量并且將檢測的離 子關(guān)聯(lián)到所述樣品中的所述一種或多種二羥基維生素D代謝物的量。
41.權(quán)利要求40的方法，其中來自步驟(a)的所述免疫純化的二羥基維生素D代謝物 在質(zhì)譜法之前進(jìn)一步通過液相層析進(jìn)行純化。
42.權(quán)利要求40-41的任一項的方法，其中所述一種或多種二羥基維生素D代謝物在質(zhì) 譜法之前用4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(PTAD)進(jìn)行衍生。
43.權(quán)利要求40-42的任一項的方法，其中所述樣品在所述免疫純化之前經(jīng)歷蛋白質(zhì) 沉淀。
44.權(quán)利要求40-43的任一項的方法，其中6D-250HD3被用作內(nèi)標(biāo)。
45.權(quán)利要求40-44的任一項的方法，其進(jìn)一步包括C18固相提取。
全文摘要
提供的是采用質(zhì)譜法檢測樣品中二羥基維生素D代謝物的存在或量的方法。所述方法一般包括電離樣品中的二羥基維生素D代謝物并且檢測離子的量以確定樣品中維生素D代謝物的存在或量。在某些優(yōu)選的實施方式中，所述方法包括在質(zhì)譜法之前免疫純化二羥基維生素D代謝物。還提供了在單一測試中檢測兩種或多種二羥基維生素D代謝物的存在或量的方法。
文檔編號G01N1/18GK101910819SQ200880124794
公開日2010年12月8日 申請日期2008年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月28日
發(fā)明者A·凱斯通-巴爾德拉瑪, B·霍爾奎斯特, N·J·克拉克, R·E·賴茨 申請人:奎斯特診斷投資公司