總25-羥基維生素d檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)檢測試劑盒，具體講是一種總25-羥基維生素D檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 25-羥基維生素D (25羥基維生素D)是一種類固醇激素在促進(jìn)腸道中鈣的吸收及 維持其動態(tài)平衡具有重要的意義，對人體骨骼的生長，健康起到關(guān)鍵的作用。近年來研究表 明，維生素D除了具有骨骼效應(yīng)外，還與自身免疫性疾病，糖尿病，心血管病，細(xì)胞生長分化 等有關(guān)的非骨骼效應(yīng)。維生素D有維生素D2和D3兩種形式。人體中維生素D來源于飲 食，而維生素D3則可由暴露在紫外線下的皮膚組織合成。在肝臟中，維生素D經(jīng)過25-羥 化酶作用，可形成25-羥基維生素D。被運(yùn)送到腎臟后，經(jīng)過1-羥化酶作用，形成1，25-雙 羥基維生素D。1，25-雙羥基維生素D是活性最高的維生素D代謝物，但在人體血液中含量 很低。在血液中的維生素D主要以25-羥基維生素D形式存在，因此被認(rèn)為是個體中維生 素D狀態(tài)的準(zhǔn)確指標(biāo)。維生素D缺乏已被證實(shí)與許多疾病有關(guān)，包括骨質(zhì)疏松，佝僂病，骨 軟化癥和惡性腫瘤，而過量服食或者注射維生素D，會引起維生素D中毒。
[0003] 目前市場上，通過酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫法來檢測人體血清中總25-羥基維 生素D (總25-羥基維生素D包括25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3)，其中有代表 性的檢測產(chǎn)品由英國的IDS和德國的Roche Diagnostics公司推出。使用酶聯(lián)免疫法檢 測25-羥基維生素D反應(yīng)時間比較長、通常需要2-3個小時，還需要配套專用的儀器，因此 不能實(shí)現(xiàn)大批量的檢測。使用化學(xué)發(fā)光法檢測25-羥基維生素D，雖然檢測靈敏度高，但是 反應(yīng)速度相對較慢，檢測一般需要30分鐘，也需要配套價格昂貴的封閉式免疫發(fā)光儀來檢 測，而且進(jìn)口試劑盒價格高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度高、精密度好、 檢測線性寬、穩(wěn)定性好、檢測時間短且生產(chǎn)成本低的總25-羥基維生素D檢測試劑盒。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案為：一種總25-羥基維生素D 檢測試劑盒，包括試劑1、試劑2和試劑3,所述試劑1是含有表面活性劑的酸性解離液；所 述試劑2由含有抗人25-羥基維生素D2和D3抗體置于適當(dāng)?shù)木彌_液中構(gòu)成；所述試劑3 是表面標(biāo)記有25-羥基維生素D2和D3的聚苯乙烯膠乳顆粒置于適當(dāng)?shù)木彌_液中構(gòu)成。
[0006] 本發(fā)明試劑1中的表面活性劑選自TWeen-20(聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯，吐 溫20)，TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚），Bri j-35 (聚氧乙烯月桂醚，布里杰-35)中的 一種或幾種，優(yōu)選Tween-20。緩沖液選自HEPES緩沖液、PEPES緩沖液、MOPS緩沖液、磷酸 鹽緩沖液、檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中的一種或幾種，優(yōu)選檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。
[0007] 本發(fā)明所述的試劑1由以下組分組成：10-100mM (mmoL/L)、pH4. 0-6. 0的檸檬 酸-檸檬酸三鈉緩沖液，〇. 05-0. 5% (v/v) (Tween-20本身就是液體，V/V是指0. 05-0. 5ml Tween-20 對應(yīng) 99. 95-99. 5ml 試劑 1) Tween 20, lmg/mL Procl in-300 (Procl in-300 防腐劑， 構(gòu)成完整酸性解離液的試劑1的一個添加組分）。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的梓檬酸-梓檬酸三鈉緩沖液的濃度為20_50mM，pH為4. 5-5. 5， Tween-20 含量為 0· 1-0. 4 % (v/v) 〇
[0009] 本發(fā)明試劑2中所述的抗人25-羥基維生素D2和D3抗體為單克隆抗體或多克隆 抗體，其中多克隆抗體源自兔、羊或雞，單克隆抗體源自鼠或兔；作為優(yōu)選，所述抗人25-羥 基維生素D2和D3抗體為單克隆抗體；作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述抗人25-羥基維生素D2和D3 抗體為鼠源性單克隆抗體。
[0010] 本發(fā)明試劑2中所述的抗人25-羥基維生素D2和D3抗體在試劑2中的終濃度 為0. 1-lmg/ml ;作為優(yōu)選，所述抗人25-羥基維生素D2和D3抗體在試劑2中的終濃度為 0. 2-0. 8mg/ml ;作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述抗人25-羥基維生素D2和D3抗體在試劑2中的終濃 度為 0. 5mg/ml。
[0011] 本發(fā)明試劑2中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，Tris-HCl緩沖液，MOPS 緩沖液中的一種或者幾種，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液；緩沖液在試劑2中的含量為10-100mM，優(yōu)選 緩沖液的含量為20-60mM。
[0012] 本發(fā)明所述試劑3中的表面標(biāo)記有25-羥基維生素D2和D3的聚苯乙烯膠乳顆粒 的粒徑為50-150nm，在試劑3中的終濃度為2mg/ml-10mg/ml ;作為優(yōu)選，所述試劑3中的聚 苯乙稀膠乳顆粒的粒徑為100-150nm，終濃度為2mg/ml-8mg/ml ;作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述試 劑3中表面標(biāo)記有25-羥基維生素D2和D3的聚苯乙烯膠乳顆粒的粒徑為130nm，終濃度為 4mg/ml〇
[0013] 本發(fā)明所述試劑3中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液，MES緩沖液，HEPES緩沖液， Tris-HCl緩沖液，MOPS緩沖液中的一種或者幾種。
[0014] 本發(fā)明試劑3是將表面標(biāo)記有25-羥基維生素D2和D3的聚苯乙烯膠乳顆粒置于 適當(dāng)?shù)木彌_液中，通過化學(xué)交聯(lián)把25-羥基維生素D2和D3標(biāo)記在帶有羧基的聚苯乙烯膠 乳顆粒表面；具體為：（1)活化25-羥基維生素D2和D3分子；（2)活化表面帶有羧基的聚 苯乙烯膠乳顆粒；（3)通過化學(xué)交聯(lián)，把活化后的25-羥基維生素D2和D3標(biāo)記在活化后的 聚苯乙烯膠乳顆粒表面；25-羥基維生素D2和D3標(biāo)記量為2. 5 μ g-25 μ g/mg膠乳顆粒；作 為優(yōu)選，所述25-羥基維生素D2和D3標(biāo)記量為2. 5 μ g-15 μ g/mg膠乳顆粒。
[0015] 本發(fā)明所述活化帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒和活化25-羥基維生素D2和D3的 試劑選自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺、N-羥基丁二酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸 中，半胱胺、溴代乙酸酐中的一種或多種。
[0016] 本發(fā)明試劑盒中試劑1與試劑2和試劑3的容積比為1 :1 :1。
[0017] 作為試劑盒的一部分，本發(fā)明中總25-羥維生素D檢測試劑盒還包括校準(zhǔn)品和質(zhì) 控品。校準(zhǔn)品主要用于對本發(fā)明試劑盒的檢測進(jìn)行校準(zhǔn)，質(zhì)控品主要用于對本發(fā)明試劑盒 檢測準(zhǔn)確度的確認(rèn)。本發(fā)明試劑盒中包含的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品為已知濃度的總25-羥基維生 素D (包含25-羥基維生素D2和D3)，總25-羥基維生素D從人體中提取或化學(xué)合成。本領(lǐng) 域技術(shù)人員根據(jù)國際參考物對本試劑盒的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品進(jìn)行賦值，并且采用本領(lǐng)域常用 的方法自行制備適當(dāng)濃度的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
[0018] 本發(fā)明總25-羥基維生素D檢測試劑盒中包含的校準(zhǔn)品分為已知總25-羥基維 生素D濃度的緩沖液，總25-羥基維生素D的濃度分別為0ng/ml、8. 75ng/ml、17. 5ng/ml、 35ng/ml、70ng/ml和140ng/ml。質(zhì)控品為已知2個總25-羥基維生素D濃度的緩沖液，2個 濃度分別為高濃度105. Ong/ml和低濃度15. Ong/ml ;質(zhì)控品和校準(zhǔn)品可以為液體或者凍干 粉末。
[0019] 本發(fā)明試劑1為含有表面活性劑Tween-20的酸性緩沖液。由于25-羥基維生素 D在人體血液中以游離和結(jié)合兩種方式存在，那些結(jié)合在人體血液蛋白（如：白蛋白）上的 25-羥基維生素D2和D3，其抗體結(jié)合位點(diǎn)和白蛋白結(jié)合后，形成封閉作用，不能再和試劑盒 中的抗體結(jié)合，試劑盒檢測不到這部分結(jié)合的25-羥基維生素D2和D3。為了檢測的準(zhǔn)確 性，本發(fā)明試劑1提供了一種25-羥基維生素D2和D3與人體血液中蛋白的解離環(huán)境，通過 血清樣本以1 ;7比例稀釋到試劑1，在37°C環(huán)境中孵育5分鐘后，結(jié)合型25-羥基維生素D2 和D3從血清蛋白中解離，形成游離狀態(tài)，便于后續(xù)的檢測。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0021] 1.本發(fā)明中的總25-羥基維生素D檢測試劑盒采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁競爭法測 定血清中總25-羥基維生素D含量，其原理是：經(jīng)過試劑1解離作用后的血清樣本和試劑2 中的抗總25-羥基維生素D抗體反應(yīng)，試劑2中過量的抗總25-羥基維生素D的抗體再和 試劑3中表面標(biāo)記總25-羥基維生素D的膠乳微粒反應(yīng)，通過標(biāo)記在膠乳表面的總25-羥 基維生素D抗原和試劑2中過量抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過 測定聚集物形成所產(chǎn)生的濁度，即可測出標(biāo)本中被檢物的含量。
[0022] 2.進(jìn)一步的，所述本發(fā)明中，樣本中游離狀態(tài)的總25-羥基維生素D與抗總25-羥 基維生素D抗體結(jié)合，產(chǎn)生抗原抗體特異性反應(yīng)，試劑2中過量的抗總25-羥基維生素D抗 體再和表面標(biāo)記有總25-羥基維生素D的膠乳顆粒產(chǎn)生特異性反應(yīng)，促使膠乳顆粒形成聚 集，在546nm波長處測定反應(yīng)吸光度，對照校準(zhǔn)曲線可求出血清樣本中總25-羥基維生素D 的含量。更進(jìn)一步講，本發(fā)明中的檢測方法采用的是一種競爭法，區(qū)別與傳統(tǒng)膠乳增強(qiáng)免疫 比濁法。樣本中總25-羥基維生素D的濃度與反應(yīng)吸光度成反比。樣本濃度越高，反應(yīng)吸 光度約低。因此，反應(yīng)方向?yàn)橄蛳路磻?yīng)。
[0023] 3.本發(fā)明的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法具有檢測靈敏度高，穩(wěn)定性好，檢測速度快，試劑 價格適中，可以配套開放式的全自動生化分析儀使用，實(shí)現(xiàn)在大中型醫(yī)院或者基層醫(yī)院開 展批量檢測。本發(fā)明檢測試劑盒用來檢測人體血液中總25-羥基維生素D的含量，并以此 來輔助診斷由維生素D缺乏而引起的各種疾病，以及預(yù)防由于維生素D補(bǔ)充過量而可能引 起的毒害作用。
【附圖說明】
[0024] 圖1 :為本發(fā)明總25-羥基維生素D檢測試劑盒定標(biāo)曲線。
[0025] 圖2 :為本發(fā)明總25-羥基維生素D檢測試劑盒與進(jìn)口試劑盒檢測相關(guān)性數(shù)據(jù)圖。
[0026] 圖3 :為本發(fā)明總25-羥基維生素D檢測試劑盒實(shí)施例中開口穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
[0027] 圖4 :為本發(fā)明總25-羥基維生素D檢測試劑盒實(shí)施例中熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。
[0028] 圖5 :為本發(fā)明總25-羥基維生素D檢測試劑盒實(shí)施例中檢測線性范圍實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面用具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅局限于以下具體實(shí) 施例。
[0030] 實(shí)施例1 :試劑配制
[0031] 1.試劑3的配制：
[0032] (1)用10mM，pH 6. 0MES緩沖液稀釋粒徑為130nm的聚苯乙烯膠乳顆粒至在緩沖 液中的濃度為4mg/mL ;然后加入濃度為lmg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二 亞胺鹽酸鹽（EDAC)溶液，使EDAC在上述溶液體系中的終濃度達(dá)到100 μ g/mL，加入lmg/ml 的N-羥基丁二酰亞胺（NHS)溶液，使NHS在上述溶液體系中的終濃度達(dá)到60 μ g/mL，25°C 反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后15000rpm離心40min，去上清液后，超聲分散后再加入15mM、pH7. 4的 磷酸緩沖液，然后再加入濃度為lmg/ml的半胱胺溶液，使半胱胺在反應(yīng)體系中的終濃度達(dá) 到250ug/ml