專(zhuān)利名稱(chēng)：新的1α-羥基維生素D4的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性維生素D4化合物，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的1α-羥基維生素D4和在其合成中使用的新的中間體，新的1，25二羥基維生素D4和新的1，24二羥基D4。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，它含有藥物有效量的新1α-羥基維生素D4化合物，本發(fā)明還涉及施用藥物有效量的該新化合物來(lái)控制鈣代謝異常的方法。
維生素D在動(dòng)物和人體的鈣代謝調(diào)節(jié)中具有重要的作用是已知的(見(jiàn)Harrison的Principals of Internal MedicinePart Eleven“Disorders of Bone and Mineral Metabolism，Chapter 335”，E.Braunwald等人，(eds)，Mc Graw-Hill，New York，1987，pp.1860-1865)，最為普遍已知的維生素D的二種形式是維生素D3和維生素D2。維生素D3在動(dòng)物和人體的皮膚中內(nèi)源合成，而維生素D2是由植物提供的維生素D的形式。維生素D2不同于維生素D3之處在于它在C22和C23之間具有一個(gè)雙鍵并且還含有一個(gè)C24-甲基。在人和大鼠中，維生素D3和維生素D2具有相等的生物效力。
維生素D4(還被稱(chēng)為輻照的22，23-二氫麥角甾醇或22，23-二氫維生素D2或22，23-二氫麥角鈣化醇)與維生素D3不同之處在于它含有一個(gè)C24甲基。維生素D4于1936年第一次被報(bào)道，見(jiàn)Grab，W.，Z.Physiol.Chem.，24363(1936)；McDonald，F(xiàn).G.，J.Biol.Chem.，114IVX(1936).另見(jiàn)Windaus，A和Traut-mann，G.，Z.Physiol.Chem.，247185-188(1937)。這些參考文獻(xiàn)對(duì)該維生素生物活性水平的報(bào)導(dǎo)有一些不一致，提出在大鼠中，維生素D4是維生素D3的活性的三分之一或四分之三，而在雞中是維生素D3活性的十分之一或五分之一。
在1968年，Deluca等人對(duì)維生素D4生物活性作了比較確定的研究，Deluca等人在Arch. Biochem.Biophys.，124122-128(1968)中證實(shí)了維生素D4的活性比維生素D3較小。Deluca等人報(bào)道，根據(jù)他們所掌握的，維生素D4在大鼠中的活性是維生素D3或維生素D2的三分之二，在雞中是維生素D3的活性的五分之一。
Deluca等人提及了這樣的事實(shí)“自從維生素D4第一次被Windhaus和Trautmann描述以來(lái)，維生素D4的合成一直很少使用”并且評(píng)述”這可能是由于維生素D4僅具有學(xué)術(shù)意義”。
就申請(qǐng)人已知的，自Peluca等人的報(bào)道以來(lái)維生素D4仍然“僅具學(xué)術(shù)意義”，因?yàn)樯暾?qǐng)人未察覺(jué)有任何進(jìn)一步的研究。事實(shí)上，“The Merck Index”關(guān)于維生素D4的陳述是“它的生物學(xué)活性似乎值得懷疑”。Merck Index，S.Budavari(ed.)，第11版.，Merck& Co.，Rahway，N.J.，(1989)，第1579頁(yè)#9930。
自Deluca等人揭示了維生素D3的活性形式，1，25-二羥基維生素D3(美國(guó)專(zhuān)利3,697,559)，和它的合成前體，1α-羥基維生素D3(美國(guó)專(zhuān)利3,741,996)以來(lái)，大部份興趣集中到了開(kāi)發(fā)這些活性維生素D3代謝物的治療用途。遺憾的是作為治療劑有很大前途的組合物D3代謝物由于這些藥劑很大的毒性卻未能充份發(fā)揮它的作用。例如，毒性限制了維生素D3、它的活性形式及類(lèi)似物防止骨損失或使損失的骨再生的效力。很多研究指出，在該藥劑對(duì)骨損失的預(yù)防或再生有效時(shí)所需的劑量下，出現(xiàn)了高鈣血和高鈣尿的問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，1α-羥基維生素D3在每日劑量為2μg/天(在一些研究中表明該劑量對(duì)預(yù)防骨損失有效)時(shí)引起約67％的病人出現(xiàn)毒性反應(yīng)。因此需要一種低毒性的生物有效的維生素D代謝物使這種藥能實(shí)際上成為一種治療藥物。
本發(fā)明的新化合物1α-羥基維生素D4、1，25-二羥基維生素D4和1，24-二羥基維生素D4是維生素D4的生物活性形式。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)維生素D4的活性形式具有比以往報(bào)道的維生素D4的生物測(cè)定為基礎(chǔ)所預(yù)計(jì)的大得多的生物學(xué)效力。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)該生物活性新化合物的毒性比按它們的生物效力預(yù)計(jì)的要小。這種高活性與低毒性的結(jié)合使本發(fā)明的化合物在鈣代謝紊亂的治療中成為有用的治療劑。本發(fā)明的新化合物，可用作為由于鈣的異常代謝所導(dǎo)致的疾病的藥物組合物的活性化合物。
為了研究本發(fā)明的新化合物，必須研究它的生產(chǎn)方法。已合成了一種α-羥基維生素D4并且在合成過(guò)程中還產(chǎn)生了新的中間體。1，25-二羥基維生素D4和1，24-二羥基維生素D4已作1α-羥基維生素D4的代謝生物產(chǎn)物被分離出來(lái)。
在審視了下面本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明和附圖后，將會(huì)獲知本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)其特異的適應(yīng)性、組合物的種類(lèi)以及其物理和化學(xué)特性，更加充分的了解。
在下文中將結(jié)合附圖描述本發(fā)明，附圖中類(lèi)似的符號(hào)全部指類(lèi)似的成分。


圖1說(shuō)明維生素D4合成的制備步驟；圖2說(shuō)明以維生素D4為起始原料的1α-羥基維生素D4合成的制備步驟。
本發(fā)明提供了合成的1α-羥基維生素D4(1α-OH-D4)化合物以及維生素D4的甲苯磺酰化和環(huán)化衍生物。
在此所使用的術(shù)語(yǔ)“生物活性”意指化合物的生化性質(zhì)，例如影響代謝，如影響血清鈣濃度，或與適合的受體蛋白，如維生素D受體蛋白的結(jié)合。
一方面，本發(fā)明包含通式(I)的生物活性化合物及其鹽、水合物和溶劑化物。 其中R1是H或者OH，R2是H或者OH在通式(I)的那些化合物中優(yōu)選的是R1和R2均為H；R1＝OH和R2＝H；以及R1＝H和R2＝OH的那些化合物。
另一方面，本發(fā)明涉及式(I)化合物的制備。1α-羥基維生素D4即式(I)中R1和R2為H的化合物的合成是按照?qǐng)D1和2表示的方案完成的。正如在圖1中所看到的，使用麥角甾醇作為合成起始物質(zhì)。采用相似于Barton等人(JCS Perkin I 1976，821-826)的方法，使麥角甾醇在一個(gè)六步驟的方法中使側(cè)鏈發(fā)生飽和，產(chǎn)生22，23-二氫麥角甾醇(VII)，然后按照Windaus等人(Z，Phy-siol.Chem.1937，147185)的方法輻照該22，23-二氫麥角甾醇，產(chǎn)生維生素D4(22，23-二氫麥角鈣化醇)(IX)。正如在圖2中看到的，使用相似于Paaren等人，(J.Org.Chem.1980，453253)所描述的方法，使維生素D4在一個(gè)四步驟法中羥基化，生成1α-羥基維生素D4。
具體地說(shuō)，(a)將麥角甾醇乙?；?β-乙酸酯，(b)然后將該乙酸麥角醇酯的5，6雙鍵進(jìn)行羥基鹵化反應(yīng)，形成6α-氯-5α-羥基衍生物。(c)還原該氯代醇并再乙?；?α-羥基(即5α醇)衍生物，(d)將該5α醇?xì)浠允蛊鋫?cè)鏈飽和，(e)還原所得到的3β-乙酰氧麥角甾-7烯-5α-醇成為22，23乙酸脫氫麥角醇酯，(f)再還原生成22，23脫氫麥角甾醇，(g)輻照該22，23脫氫麥角甾醇形成維生素D4，(h)然后將維生素D4甲苯磺?；?β-甲苯磺?；S生素D4。(i)該甲苯磺酸酯通過(guò)溶劑分介反應(yīng)被置換產(chǎn)生6-甲氧基-3，5-環(huán)維生素D4。(j)將該環(huán)維生素D4進(jìn)行烯丙基氧化以形成1α-羥基環(huán)維生素衍生物。(k)該1α-羥基維生素隨后被溶劑分解并進(jìn)行Diels-Alder型反應(yīng)，除去5-甲氧基基團(tuán)并從5，6反式-1α-羥基維生素D4中分離出1α-羥基維生素D4(5，6-順式)。
1α-羥基維生素D4的代謝物1，24二羥基維生素D4和1，25二羥基維生素D4是通過(guò)與人肝細(xì)胞一起孵育該1α羥基衍生物，培養(yǎng)該細(xì)胞，并回收1，24二羥基或1，25二羥基維生素D4而合成的，采用維生素D受體蛋白結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定這些代謝物的生物活性。
已發(fā)現(xiàn)式(I)的化合物具有有價(jià)值的藥理學(xué)活性，即用作鈣代謝尤其是血清鈣濃度的控制劑。具體地說(shuō)，式(I)化合物在維生素D缺乏的大鼠體中增加血清鈣濃度。還發(fā)現(xiàn)式(I)的化合物具有低毒性，這增加了它們的藥理特性。當(dāng)用LD50試驗(yàn)測(cè)定時(shí)，式(I)化合物的毒性與相應(yīng)的維生素D2化合物相似而低于相應(yīng)的維生素D3化合物。因此，本發(fā)明的化合物可用于各種臨床和獸醫(yī)領(lǐng)域，特別是用于治療鈣和磷的異常代謝。
在另一方面，本發(fā)明帶來(lái)了一種控制鈣代謝的方法，例如用于治療由于肝衰竭、腎衰竭、胃腸道衰竭等引起的異常鈣代謝。式(I)的化合物可用于預(yù)防或治療維生素D缺乏疾病和相關(guān)疾病，例如腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、皮脂溢、抗驚厥劑致骨軟化、血磷酸鹽過(guò)少致抗維生素D佝僂病、骨質(zhì)疏松，包括絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松、老年骨質(zhì)疏松、類(lèi)固醇誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松、以及以骨質(zhì)損失為特征的其他疾病狀態(tài)、假缺乏性(維生素D有關(guān)的)佝僂病、營(yíng)養(yǎng)和吸收障礙佝僂病、甲狀旁腺機(jī)能減退、手術(shù)后甲狀旁腺機(jī)能減退、自發(fā)性甲狀腺機(jī)能減退、假甲狀旁腺癥以及酒精中毒所繼發(fā)的骨軟化和骨質(zhì)減少。式(I)的化合物中，最好是其中的R1或R2是OH，例如1α，24二羥基維生素D4，對(duì)于治療皮膚過(guò)度增生如牛皮癬很有價(jià)值。
式(I)的化合物可用作為藥物組合物的活性成份，在用于例如鈣的異常代謝所導(dǎo)致的疾病時(shí)，該組合物與已知的維生素D3的活性形式的類(lèi)似物相比具有較少的付作用和低毒性，這些藥物組合物組成了本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的藥理活性化合物可以按照藥學(xué)常規(guī)方法加工成為給患者例如包括人的哺乳動(dòng)物施用的成品藥劑。例如式(I)的化合物可用于與常規(guī)的賦形劑，例如不與該活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的、適合于內(nèi)服(口服)的、非腸道用、或局部用的藥用載體物質(zhì)混合。
適用的藥用載體包括(但不限于)水、鹽溶液、乙醇、阿拉伯膠、植物油(例如玉米油、棉籽油、花生油、橄欖油、椰子油)、魚(yú)肝油、油狀酯如多乙氧基醚、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(如乳糖、直鏈淀粉或淀粉)，硬脂酸鎂、滑石、硅酸、粘性石蠟、脂肪酸單甘油酯和二甘油酯、季戊四醇脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
這些藥物制劑可被滅菌并且如果需要的話與輔助劑如潤(rùn)滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)香劑和/或一種或幾種其他的活性物質(zhì)例如維生素D3或D2和它們的1α-羥基化代謝物、共軛雌激素或它們的等同物、抗雌激素、降鈣素、二磷酸鹽、鈣補(bǔ)充劑、維生素B12、百日咳毒素和硼。
特別適合于非腸胃道使用的制劑是可注射的滅菌溶液最好是油或水的溶液，以及懸浮劑、乳劑或植入劑包括栓劑，安瓿是合宜的單位劑型。
特別適合于內(nèi)服使用的是片劑、糖衣丸、液體、滴劑、栓劑、錠劑、粉劑或膠囊劑。如果需要甜賦形劑可使用糖漿、酏劑或類(lèi)似物。
也可例如通過(guò)微型膠囊、多層包衣等配備持續(xù)或直接釋放的組合物，例如脂質(zhì)體或者用不同的降解包衣保護(hù)該活性化合物的那些制劑。如微膠囊，多層包衣等。
于局部用時(shí)，可使用適當(dāng)?shù)姆菄婌F的粘性體、半固體或固體形式，它包含適用于局部用的和動(dòng)力學(xué)粘度最好大于水的可相容載體。適宜的配制物包括(但不限于)溶液劑、懸浮劑、乳劑、霜膏劑、油膏劑、粉劑、搽劑、藥膏、氣霧劑、透皮吸收貼敷膏等，如需要，可將它們滅菌或與輔助劑例如防腐劑、穩(wěn)定劑、及乳化劑、濕潤(rùn)劑等混合。
對(duì)于直腸給藥，將化合物制備成一種含有栓劑基質(zhì)如可可豆脂或其他的甘油三酯的藥物組合物。為了延長(zhǎng)貯存期，組合物中最好含有抗氧化劑例如抗壞血酸、丁基化羥基苯甲醚或氫醌。
本發(fā)明藥物組合物口服使用較好，一般將本發(fā)明的化合物調(diào)制成在每單位劑型的藥用載體中含有大約0.5μg至大約25μg的單位劑量形式。本發(fā)明化合物的劑量一般是0.01至0.5μg/Kg/天，優(yōu)選大約0.04至大約0.3μg/Kg/天。
應(yīng)當(dāng)理解，事實(shí)上在具體病例中活性化合物的優(yōu)選量是根據(jù)所使用的具體的化合物的效力、特定的組合物的配方、使用形式和被治療的特定的部位及器官而變化。例如，特定病人的具體劑量取決于年令、體重、健康的一般狀況、性別、飲食、給藥時(shí)限以及形式、排出速率和結(jié)合使用的藥物以及被治療對(duì)象特定疾病的嚴(yán)重程度。給定宿主的劑量可用常規(guī)的考慮因素確定，例如將主題化合物與已知藥劑的活性進(jìn)行常規(guī)對(duì)照，例如通過(guò)適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)的藥理學(xué)規(guī)范方法。
此外，本發(fā)明的化合物還可以有益地用于獸藥組合物中，例如用于治療或預(yù)防低血鈣的家畜的飼料組合物中。一般來(lái)說(shuō)，將本發(fā)明的化合物分散在飼料中，使得這樣的飼料的正常消耗提供給動(dòng)物大約0.01至大約0.5μg/Kg/天的本發(fā)明化合物。
下面的例子僅構(gòu)成說(shuō)明而不以任何方式限制說(shuō)明書(shū)的其他部份。在下面的例子中，所有的溫度均采用攝氏度(除非另有標(biāo)示)，所有的份數(shù)和百分?jǐn)?shù)均按重量計(jì)。質(zhì)子核磁光譜(1H NMR)是用帶有計(jì)算機(jī)3000的IBM Sy-200(200mHz)和BrukerAm 400(400mHz)在CDCl3溶液中用CHCl3作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行記錄的。紅外光譜是用該溴化鉀(KBr)片或液體樣品，用付立葉轉(zhuǎn)換(Fourier transform(FTIR))進(jìn)行記錄的。質(zhì)譜是用FinniganMAT-90質(zhì)譜儀在20eV/CI下進(jìn)行記錄的。溶點(diǎn)在Hoover-Thomas(毛細(xì)管)Uni-Melt和Fisher-Johns熔點(diǎn)儀(滑動(dòng)蓋型)中進(jìn)行。
例11α-羥基維生素D4的合成將100克(0.25摩爾)麥角甾醇溶解在600毫升無(wú)水吡啶和68毫升(0.7摩爾)乙酸酐中，使麥角甾醇(II)轉(zhuǎn)化成乙酸麥角甾醇酯(III)。在室溫?cái)嚢柙撊芤哼^(guò)夜，然后加入1.2升冰冷卻該溶液，促使產(chǎn)生沉淀。用每次400毫升的水洗沉淀五次，然后用400毫升CH3CN洗一次。將所得產(chǎn)品空氣中干燥，生成79克(71％)的乙酸麥角甾醇酯，呈白色晶體并且有如下特征熔點(diǎn)(m.p.)169-171℃；H1NMR(400MHz，CDCl3)，δppm2.05(3H，S，3β-CH3CO)，4.65-4.75(1H，m，3α-H)5.15-5.25(2H，m，22-H和23-H)，5.4(1H，α，6-H)，5.6(1H，d，7-H)；FTIR[KBr]1734cm-1(C＝O伸展)968cm-1(C-H彎曲)。
將乙酸麥角甾醇酯(III)(26gm，0.062M)溶解于2.5升新蒸餾過(guò)的脫氧甲苯中，在氮?dú)夥障拢?78℃將溶于240ml干CH2Cl2中的9ml(0.111mol)鉻酰氯在30分鐘內(nèi)加到該溶液中。在-78℃將該反應(yīng)系統(tǒng)再攪拌15分鐘，然后加入一份硼氫化鈉在乙醇中的飽和溶液62毫升，再于-78℃攪拌15分鐘后，將反應(yīng)液傾倒到3N鹽酸(3升)和苯(3升)所形成的兩相系統(tǒng)中，分離出有機(jī)層，并用水(2升)洗，再用鹽溶液(2×1升)洗兩次，用無(wú)水MgSO4脫水。過(guò)濾所得脫水的溶液并真空濃縮，用CH3CN(280毫升)處理所得到的粗結(jié)晶產(chǎn)品，并過(guò)濾這樣形成的漿體產(chǎn)生12.5克(41％)白色結(jié)晶3β-乙酰氧基-6α-氯化麥角甾-7，22-二烯-5α醇(IV)，具有如下特征m.p190-192℃；1H NMR(400NMz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-0Ac)，4.65(1H，d，6β-H)，5.1(1H，s，7-H)，5.1-5.3(2H，m，22-H和23-H)；FTIR[KBr]1732cm-1(C＝O伸展)968cm-1(C-H彎曲)，3437cm-1(O-H伸展)。
在室溫下氮?dú)庵袑?β-乙酰氧基-6α-氯代麥角甾-7，22-二烯-5α-醇(IV)(21.4克，0.044摩爾)的無(wú)水THF(900毫升)溶液緩慢地加到攪拌著的氫化鋰鋁(2.66克，0.07摩爾)在無(wú)水THF(750毫升)的懸浮液中，將該混合物回流三小時(shí)后冷卻至0℃。用飽和的Na2SO4溶液將過(guò)量的氫化物分解，通過(guò)無(wú)水Na2SO4過(guò)濾并蒸發(fā)所得濾液得到一固體，直接用乙酸酐(110毫升)和無(wú)水吡啶(220毫升)在0℃進(jìn)行處理。減壓除去溶劑生成乙酸鹽(12.75克61％)，3β-乙酰氧麥角甾-7，22-二烯-5α-醇(V)，它具有下列特征M.P.229-232℃，F(xiàn)TIR(KBr)1736cm-1(C＝O伸展)，3460cm-1(O-H伸展)，972cm-1(C-H彎曲)。
在H2氣(15psi)氛下，將3β-乙酰氧麥角甾-7，22-二烯-5α-醇(V)(2.5克，0.0055摩爾)與新制備的PtO2(0.5克)在乙酸乙酯(820毫升)中振搖16小時(shí)。過(guò)濾除去催化劑，蒸發(fā)濾液，將得到的粗制乙酸酯溶解在CH2Cl2中并在硅膠上進(jìn)行層析。用CH2Cl2洗脫，得到基本上純的3β-乙酰氧麥角甾-7-烯-5α-醇(VI)(2.15克，85％)，呈白色結(jié)晶物，并且具有如下特征m.p.228-232℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，5.05-5.20(2H，m，3α-H和7H)；FTIR(KBr)1736cm-1(C＝O伸展)，3462cm-1(O-H伸展)。
在0℃在氮?dú)夥罩?，將在無(wú)水吡啶(170毫升)中的重蒸亞硫酰氯(9.7毫升)加到在無(wú)水吡啶(800毫升)中的化合物3β-乙酰氧麥角甾-7-烯-5α-醇(VI)(12.0克，0.0262摩爾)中。2.5小時(shí)后，用冰冷的H2O(1.5升)稀釋該溶液并用二份乙醚(2.5升＋1.5升)提取，用NaHCO3溶液(1.0升×2)，然后用1N HCl(1.5升×2)和水(1升)洗滌合并的醚提取液。然后用MgSO4將該醚溶液脫水，過(guò)濾之后，減壓蒸干產(chǎn)生的粗制品，用CH3CN(100毫升)轉(zhuǎn)化成漿料，過(guò)濾收集該產(chǎn)品并用CH3CN重結(jié)晶，產(chǎn)生4.5克(39％)白色結(jié)晶乙酸22，23-二氫麥角甾酯(VII)，它具有如下特性m.p.144-147℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 2.05(3H，s，3β-OAc)，4.65-4.75(1H，m，3α-H)，5.4(1H，d，6-H)，5.6(1H，d.7-H)；FTIR(KBr)1734cm-1(C＝O伸展)。
乙酸22，23-二氫麥角甾酯(VII)(4.8克，0.011摩爾)一次加入室溫下攪拌著的氫化鋰鋁(2.5克，0.066摩爾)在無(wú)水乙醚1.1升的懸浮液中。在室溫下攪拌該反應(yīng)物二小時(shí)，加入5N NaOH使過(guò)量的氫化鋰鋁失效并加入H2O(500毫升)。用四份250毫升的乙醚提取該水溶液，合并乙醚提取液并用鹽水(1升)洗滌該合并的有機(jī)層。然后用Na2SO4干燥，減壓蒸去乙醚得到化合物22，23-二氫麥角甾酵(VIII)(4.1克，94％)，呈白色結(jié)晶體，并具有下列特性m.p.147-150℃；1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δppm 3.6-3.7(1H，m，3α-H)，5.4(1H，d，6H)，5.6(1H，d，7-H)；FTIR[KBr]3400cm-1(O-H伸展)。
將22，23-二氫麥角甾醇(VIII)(2.0克，5.0毫摩爾)溶解在乙醚和苯(4∶1，600毫升)的溶液中，在氬氣氛下在水冷卻的石英容器中隨著攪拌進(jìn)行輻照(Hannovia immersion燈，450瓦)三小時(shí)。真空濃縮該溶液，產(chǎn)生一種膠狀固體，將它再溶解在100毫升乙醇中并在氬氣氛下加熱回流八小時(shí)。然后，在真空中濃縮，將殘留物吸附到硅酸柱上并用30％乙酸乙酯在己烷中的溶液提洗，以1.2g(60％)的產(chǎn)量得到維生素D4(22，23-二氫麥角鈣化醇(IX)，它具有如下特征1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 0.55(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd，26-H3和27-H3)0.87(3H，d，21-H3)0.93(3H，d，28-H3)3.94(1H，m，3-H)4.82(1H，m(尖峰)，19-H)，5.04(1H，m(尖峰，19-H)6.04(1H，d，7-H)6.24(1H，d，6-H)。
在0℃，向攪拌著的維生素D4(IX)(3.0克，7.5毫摩爾)在10毫升的無(wú)水吡啶的溶液中加入新重結(jié)晶的對(duì)甲苯磺酰氯(3.6克，19毫摩爾)。在5℃攪拌反應(yīng)混合物24小時(shí)，然后將混合物傾到至冰和飽和NaHCO3(100毫升)中攪拌使之驟冷。用CH2Cl2(3×300毫升)提取該水懸浮液，合并所得到的有機(jī)提取液，用10％HCl(3×200毫升)、飽和的NaHCO3(3×200毫升)和飽和NaCl(2×200毫升)洗滌，用MgSO4干燥，真空濃縮得到3.5克(84％)新的中間化合物維生素D4甲苯磺酸酯(X)，它具有下列特性1H NMR400MHz，CDCl3)，δppm 0.54(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd.26-H3和27-H3)0.87(3H，d，21-H3)，0.96(3H，d.28-H3)2.45(3H，s.CH3(甲苯磺酸酯)4.68(3H，m，3-H)4.82(1H，m(尖峰)，19-H)5.04(1H m(尖峰)，19-H)，5.95(1H，d7-H)，6.09(1H，d，6-H)7.34和7.79(4H，d，芳香族的)。
將在無(wú)水CH2Cl2(10毫升)中的維生素D4甲苯磺酸酯(X)(3.5克，6.3毫摩爾)溶液滴加到攪拌著的NaHCO3(17.0克，202毫摩爾)在甲醇(200毫升)的懸浮液中。在氬氣氛下，將反應(yīng)混合物回流過(guò)夜，然后冷到室溫，并在真空中濃縮到大約50毫升，用乙醚(600毫升)烯釋該反應(yīng)濃縮物，用水(3×300毫升)洗滌，MgSO4干燥，并在真空中濃縮。將殘留物通過(guò)硅膠柱并用10％乙酸乙酯的己烷溶液提洗，得到新的中間化合物3，5環(huán)維生素D4(XI)(重油)，產(chǎn)量1.5克(58％)，具有下列特征1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm0.56(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd26-H3和27-H3)，0.87(3H，d.21-H3)，0.94(3H，d，28-H3)，3.28(3H，s，OCH3)4.2(1H，d，6-H)，4.91(1H，m(尖峰)19-H)，4.98(1H，d，7-H)，5.08(1H，m(尖峰)，19-H)。
將無(wú)水叔丁基氫過(guò)氧化物在甲苯(3M)(2.6毫升，7.8毫摩爾)中加至在三頸燒瓶中攪拌著的二氧化硒(0.22克，2毫摩爾)在無(wú)水CH2Cl2(150毫升)的懸浮液中?；旌衔镌跉鍤庵袛嚢枞r(shí)。然后加入吡啶(0.3毫升，3.7毫摩爾)，然后加入環(huán)維生素D4(X1)(1.5克，3.6毫摩爾)在CH2Cl2(50毫升)中的溶液，攪拌30分鐘后，加入10％NaOH水溶液(200毫升)，然后用乙醚(500ml)稀釋反應(yīng)混合物，分離兩相。有機(jī)相用10％NaOH(3×200毫升)、水(2×200毫升)和飽和NaCl溶液(2×200毫升)洗滌、在MgSO4中干燥并真空濃縮。將殘留物吸收到硅膠柱上，用30％乙酸乙酯的己烷溶液提洗，得到0.45克(29％)新的中間化合物1α-羥基3，5-環(huán)維生素D4(XII)(油)，并具有下列特征1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm0.54(3H，s，18-H3)0.78(6H，dd.26-H3和27-H3)0.86(3H，d，21-H3)0.95(3H，d，28-H3)3.26(3H，s，OCH3)4.2(1-H，d.6-H)，4.22(1H，m，1-H)，4.95(1H，d，7-H)，5.18(1-H，α，19-H)5.25(1H，d，19-H)。
在氬氣中，將1α-羥基3，5-環(huán)維生素D4(XII)(0.45克，1.05毫摩爾)在二甲基亞砜(4.5毫升)與冰醋酸(3.6毫升)形成的溶液中加熱到50℃持續(xù)1小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物傾入冰和飽和的NaHCO3溶液(100毫升)中，用乙醚(3×200毫升)提取，合并醚提取液，用飽和的NaHCO3溶液(3×200毫升)，水(3×200毫升)和飽和NaCl溶液(3×200毫升)洗滌，用MgSO4干燥，真空濃縮，得到含有5，6-順式和5，6-反式1α-羥基維生素D4(根據(jù)1H NMR大約為4∶1)的混合物，產(chǎn)量為0.4克(92％)。將5，6-順式和5，6-反式1α-羥基維生素D4的混合物(0.4克，0.97毫摩爾)溶解在醋酸乙酯(25毫升)中，用新重結(jié)晶的馬來(lái)酐(0.08克，0.8毫摩爾)處理。在氬氣中，將反應(yīng)混合物加熱到35℃，保持24小時(shí)。真空中蒸發(fā)該溶劑，將粗制混合物在硅膠柱上進(jìn)行層析，使用醋酸乙酯和己烷(1∶1)作為提洗液，得到維生素D4的新的活性形式，5，6-順式1α-羥基維生素D4(XIII)，產(chǎn)量90毫克(23％)，具有下列特征m.p.128-130℃；IR ν max(Neat)3400cm-1(OH伸展)；1H NMR(400MHz，CDCl3)，δppm 0.55(3H，s，18-H)0.79(6H，dd.26-H3和27-H3)0.87(3H，d，21-H3)0.94(3H，d，28-H3)，4.24(1H，m，3-H)，4.44(1H，m，1-H)，5.02(1H，m(尖峰)，19-H)，5.34(1H，m(尖峰)，19-H)，6.02(1H，d7-H)，6.4(1H，d，6-H)；質(zhì)譜[CI]m/e(相對(duì)強(qiáng)度)415(M＋1，41％)397，(M＋1-OH 100％)，379(27％)，135(22％)。
例21α-羥基維生素D4的生物試驗(yàn)給雄性斷奶的大鼠(HOltzman株，Holtzman公司，Madison，Wisconsin)飼喂含有充份的鈣(0.47％)和磷(0.3％)但缺乏維生素D的食料三至四周，這樣的食料導(dǎo)致以低血清鈣和不良生長(zhǎng)為特征的極度維生素D缺乏。在這樣的飲食四周后，鼠的血清鈣值低于7毫克/分升。然后將鼠分成四組，在14天內(nèi)每一天均給予在載體如椰子油中的1α-羥基維生素D4或者僅給載體(對(duì)照)，在最后給藥的24小時(shí)后，處死鼠并用通常實(shí)驗(yàn)室技術(shù)測(cè)定血鈣，所得結(jié)果在表1中給出。
表1血清鈣濃度的增加化合物 劑量大鼠數(shù)量血清鈣濃度(mg/dl)(μg/Kg/天) ±標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)照 - 10 6.1±0.481α-OH-D40.042 8 7.1±0.801α-OH-D4O.250 7 11.6±0.451α-OH-D41.500 9 12.7±0.37表1的數(shù)據(jù)顯示出1α-羥基維生素D4對(duì)于缺乏維生素D鼠能有效增加其血清鈣，并且該應(yīng)答顯示出劑量依賴性。令人驚奇的是，這樣的應(yīng)答水平，可以與Wientroub等人所報(bào)導(dǎo)的，在相似于以上所描述的實(shí)驗(yàn)條件下，將1，25二羥基維生素D3施用于缺乏維生素D的鼠得到的結(jié)果相比擬。(見(jiàn)Wientroub，S.，Prid，P.A.，Reddi，A.H，“The Dichotomy in the Effects of 1，25 dihydroxy vitamin D3and 24，25 dihydroxy vitamin D3on Bone Gamma-Carboxygluta-mic Acid-containing Protein in Serum and Bone in Vitamin D-Deficient Rats.”Calcif Tissue Int(1987)40166-172。
例3毒性試驗(yàn)采用已知方法測(cè)定平均致死劑量(LD50)來(lái)評(píng)價(jià)1α-OH-D4的急性口服毒性。用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飲食飼養(yǎng)大鼠8-10周。每種性別的五只動(dòng)物給于-次口服劑量的1α-OH-D4。觀察這些動(dòng)物14天，記錄死亡數(shù)。測(cè)得的LD50值在雄性中大約為1.0毫克/公斤在雌性中為3.0毫克/公斤。
為了進(jìn)行比較，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在同樣條件下1α-羥基維生素D2的LD50在雄性和雌性大鼠中分別為1.7和1.8毫克/公斤。1α-羥基維生素D2的毒性據(jù)報(bào)道比1α-羥基維生素D3小。Sjoden，G.，Smith，C.，Lindgren，U.，和Deluca，H.F.，Proc.Soc.Experi mental Biol.Med.，178432-436(1985)。
例41，25-二羥基維生素D4的產(chǎn)生和分離本發(fā)明的1α-羥基維生素D4與培養(yǎng)的人肝細(xì)胞-起保溫，人肝細(xì)胞將該化合物代謝成為幾種產(chǎn)物，其中包括代謝物1，25二羥基維生素D4。通過(guò)高壓液相色譜分離和純化該1，25代謝物，用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別。鍵合研究證明1，25二羥基維生素D4對(duì)于哺乳動(dòng)物維生素D受體蛋白具有很好的結(jié)合親和力，表明它是具生物活性的。所使用的方法相似于Strugnell等人描述的方法(Biochem.Pharm.vol 40333-341(1990))。
例51，24-二羥基維生素D4的產(chǎn)生和分離如例4所描述的方法完成1，24-二羥基維生素D4的產(chǎn)生和分離。將本發(fā)明的1α-羥基維生素D4與培養(yǎng)的人肝細(xì)胞一起保溫，人肝細(xì)胞將該化合物代謝成為幾種產(chǎn)物，其中包括代謝物1，24二羥基維生素D4。通過(guò)高壓液相色譜分離和純化該1，24代謝物，用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別。該新的代謝物的結(jié)合研究證明該代謝產(chǎn)物對(duì)于哺乳動(dòng)物維生素D受體蛋白具有很好的親和力，表明了該藥物是具生物活性的。
例6高鈣血試驗(yàn)給雌性大鼠喂食含有0.8％鈣和0.6％磷的商品飼料。將鼠分成四組，各組每日或給予口服在如椰子油這樣的載體劑中的1α-OH-D4或僅給予載體(對(duì)照)13星期。在最后-次給藥后24小時(shí)后處死鼠，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定它們的血清鈣。
該方法證明在1α-OH-D4劑量高至2.5μg/Kg/天時(shí)，血清鈣濃度未受影響或僅有輕微上升。
例7進(jìn)一步的生物學(xué)試驗(yàn)給雄性斷乳的大鼠喂食缺乏維生素D和低鈣(0.02％)飼料。在四個(gè)星期過(guò)去后，將鼠分成四組，或靜脈給予在如乙醇之類(lèi)的載體中的1α-OH D4或者僅給予載體(對(duì)照)。給藥后16小時(shí)處死鼠，按照Martin和Deluca，Am. J.Physiol.2161352-1359的方法，使用外翻十二指腸囊測(cè)量腸內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移。
下面的方法證明腸內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移的刺激是劑量依賴性的。
例8對(duì)患經(jīng)絕后骨質(zhì)疏松的，年令為55至75歲的門(mén)診病人進(jìn)行了臨床研究。該研究包括將達(dá)120個(gè)之多的病人隨機(jī)分為三個(gè)治療組，研究持續(xù)12至24個(gè)月。二個(gè)治療組接受1α-維生素D4的恒定的劑量(u.i.d；3.0μg/天以上的兩個(gè)不同的劑量水平)，另一個(gè)組接受配合的安慰劑。所有病人保持飲食鈣的正常攝入(500至800毫克/天)并且不使用補(bǔ)鈣劑。通過(guò)比較各組病人治療前后的下列方面來(lái)評(píng)估其效果(a)通過(guò)X射線吸收比色計(jì)(DEXA)測(cè)量全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨礦物質(zhì)密度，(b)髂骨嵴的骨活體組織檢查以及(c)血清骨鈣的檢測(cè)。安全性是通過(guò)比較尿羥基脯氨酸排泄、血清和尿鈣水平、肌酐酸清除率、血脲氮和其他常規(guī)檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估的。
該研究證明了用1α-維生素D4治療的病人比用安慰劑處理的病人顯示明顯高的全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨密度，被治療的病人的血清骨鈣還顯示明顯的升高。進(jìn)行治療的病人的骨活組織檢查顯示1α-維生素D4刺激正常骨形成。所檢測(cè)的安全參數(shù)證明，隨著用1α-維生素D4治療，高鈣血或高鈣尿或其他的代謝障礙的發(fā)生率微不足道。
例9對(duì)經(jīng)絕后的年令為55至60歲的健康婦女進(jìn)行了臨床研究。該研究包括將達(dá)80個(gè)之多病人隨機(jī)分為兩個(gè)治療組進(jìn)行持續(xù)12至24個(gè)月的研究。一個(gè)治療組接受1α-維生素D4的恒定劑量(u.i.d.；3.0μg/天以上的劑量水平)而另一組接受相應(yīng)的安慰劑，該試驗(yàn)如上面例2所描述的進(jìn)行。
該試驗(yàn)證明，用1α-維生素D4治療的病人與基準(zhǔn)值相比，全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨密度損失降低。相比之下，用安慰劑處理的病人的這些參考與基準(zhǔn)值相比有明顯骨損失。所檢測(cè)的安全參數(shù)證明該劑量水平長(zhǎng)期服用1α-維生素D4是安全的。
例10用患有腎病的發(fā)生長(zhǎng)期血流滲析的30個(gè)男人/或女人進(jìn)行12個(gè)月的雙盲安慰對(duì)照臨床試驗(yàn)。所有的病人先進(jìn)入八周的對(duì)照期，在這期間，它們接受維生素D3的維持劑量(400IU/天)。在對(duì)照期后，將病人隨機(jī)分為兩個(gè)治療組，一組接受1α-維生素D4恒定劑量(u.i.d.，大于3.0μg/天的劑量)而另一組接受相應(yīng)的安慰劑。該兩個(gè)治療組均給予維生素D3維持劑量，保持飲食鈣的正常攝入量并均使用補(bǔ)鈣劑。通過(guò)比較該兩組病人治療前后的下列方面來(lái)評(píng)估其效果(a)直接測(cè)量腸內(nèi)鈣吸收，(b)全身的、橈骨的、股骨的和/或脊柱的骨礦物質(zhì)密度和(c)血清鈣和血清骨鈣的檢測(cè)，通過(guò)血清鈣的定期監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)其安全性。
正如通過(guò)使用單同位素法或雙同位素法測(cè)定所確定的那樣，臨床數(shù)據(jù)分析表明了1α-維生素D4明顯地增加血清骨鈣水平和腸的鈣吸收。用該化合物治療的病人表現(xiàn)出血清鈣水平被正?；c基準(zhǔn)值相比，全身的、撓骨的、膠骨的和/或脊柱的骨密度值穩(wěn)定。對(duì)照之下，用安慰劑治療的病人經(jīng)常出現(xiàn)低鈣血，全身的、撓骨的、股骨的和/或脊柱的骨密度明顯降低，在該治療組觀察到高鈣血發(fā)生率很小。
本發(fā)明現(xiàn)已以某種具體的方式描述并舉例，該領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員會(huì)知道在上面所描述的內(nèi)容中可以作出各種改進(jìn)，包括改變、增加和省略。因此，本發(fā)明也企圖包括這些改進(jìn)內(nèi)容，并且本發(fā)明的范圍僅僅受到法律能夠賦予所附權(quán)利要求的最寬解釋的限制。
權(quán)利要求
1.如下所示的式(I)化合物作為制備用于治療骨質(zhì)疏松癥藥物的應(yīng)用 式中R1是H或OH，以及R2是H或OH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說(shuō)的化合物是1α-羥基維生素D4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說(shuō)的化合物是1，24-二羥基維生素D4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說(shuō)的化合物是1，25-二羥基維生素D4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說(shuō)的應(yīng)用包括應(yīng)用于制備施用于患骨質(zhì)疏松癥患者的藥物的式(I)化合物的量是治療該骨質(zhì)疏松癥的有效量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中該藥物包含治療有效量的式(I)化合物和生理上可接受的賦形劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中當(dāng)該藥物是口服施用的藥物時(shí)式(I)化合物的量是0.01至0.5μg/kg/天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中當(dāng)該藥物是口服施用的藥物時(shí)，式(I)化合物的優(yōu)選量是0.04至0.3μg/kg/天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所說(shuō)的該式(I)化合物的量是3.0μg/天。
全文摘要
新的1α-羥基維生素D
文檔編號(hào)C07C35/21GK1130507SQ95119400
公開(kāi)日1996年9月11日 申請(qǐng)日期1995年11月8日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月21日
發(fā)明者J·C·克努森, C·W·畢曉普, R·M·莫里亞蒂 申請(qǐng)人:倫納公司