22(r)-羥基膽固醇作為parp1抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及將22 (R)-羥基膽固醇作為PARP1抑制劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]22 (R)-羥基膽固醇，CAS號為17954-98-2，英文名稱為22 (R) -HYDR0XYCH0LESTER0L，簡寫為 22 (R) -HC ;分子式為 C27H4602，分子量為 402.65。
[0003]22 (R)-羥基膽固醇屬于羥化膽固醇類似物，有降低膽固醇的作用。在目前已有的研究中主要作為肝臟X受體(LXR)的激動劑，即激活LXR，例如激活基因LXR α (肝臟X受體α亞型)，因此上述藥物均被廣泛應(yīng)用于LXR相關(guān)的研究中。
[0004]1型多聚ADP核糖合成酶，簡寫為PARP1，PARP1是一種廣泛表達于真核細胞的核酶。當(dāng)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激引起DNA斷裂損傷時，PARP1通過結(jié)合斷裂DNA發(fā)生構(gòu)象改變而活化。活化的PARP1以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為底物，以其酶促作用通過轉(zhuǎn)移腺苷二磷酸核糖(ADP)飾目標蛋白和自身(即多聚ADP核糖化反應(yīng))，從而改變目標蛋白和自身的生物學(xué)活性。目前應(yīng)用于科研中的PARP1抑制劑有數(shù)種，其中最為常見的有:3_氨基苯甲酰胺(簡寫為3AB)，N-(6-氧代-5，6- 二氫菲啶_2_基)_2_(N，N- 二甲基氨基)乙酰胺鹽酸鹽(簡寫為PJ34)。而應(yīng)用于臨床藥物試驗的研究的PARP1抑制劑有BMN-673、CEP-9722、Rucaparib、KU-0059436、IN0-1001等，在腫瘤治療及主動脈夾層等疾病治療中有明確療效。已有的研究認為膽固醇升高與腫瘤的發(fā)病率明確相關(guān)，但目前尚無膽固醇相關(guān)藥物對此方面的證據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供22 (R)-羥基膽固醇的新用途，即作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑進行應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
[0007]22 (R)-羥基膽固醇(簡寫為22(R)_HC)作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑的用途，即22 (R) -HC具有抑制1型多聚ADP核糖合成酶的活性的作用。
[0008]一種抑制1型多聚ADP核糖合成酶活性的方法，在該方法中，選用22(R)_羥基膽固醇作為1型多聚ADP核糖合成酶抑制劑，通過無細胞1型多聚ADP核糖合成酶酶促反應(yīng)和/或利用離體細胞實驗分別檢測上述試劑對1型多聚ADP核糖合成酶的活性的抑制作用。
[0009]通過實驗驗證，當(dāng)所述22 (R)-羥基膽固醇的濃度為0.5 μ mol/L至3 μ mol/L時，22 (R)-羥基膽固醇對1型多聚ADP核糖合成酶的活性的具有抑制作用。
[0010]本發(fā)明還提出，22(R)_羥基膽固醇可以作為治療與1型多聚ADP核糖合成酶相關(guān)疾病的藥物進行廣泛應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明還提出，22(R)_羥基膽固醇可以作為治療與1型多聚ADP核糖合成酶相關(guān)的心血管疾病藥物的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明具有的有益效果:
[0013]本發(fā)明通過實驗首次證實了 22(R)_HC(屬于羥化膽固醇類似物)不僅可以作為LXR激動劑而且同時對PARP1有抑制作用，上述發(fā)現(xiàn)尚未有任何文獻報道。上述LXR激動劑作為膽固醇類似物并無通常腫瘤藥物或其他PARP1抑制劑的細胞毒作用，可以預(yù)期其安全性?？梢宰鳛橹委熌懝檀枷嚓P(guān)疾病如腫瘤等疾病的藥物而廣泛應(yīng)用。
【附圖說明】
[0014]圖1-圖4為本發(fā)明實驗檢測結(jié)果圖。
[0015]圖1和圖2，HepG2細胞分別給予22(R)_羥膽固醇(i，0.5，1，3 μ mol/L)或煙酸(iv, 1，5，10 μ mol/L)刺激 24 小時。
[0016]圖1包括圖1A和圖1B，分別利用PARP1活性檢測試劑盒檢測測定PARP1活性；3AB(10mmol/L)作為陽性對照，煙酸作為陰性對照。與對照組相比，##P < 0.01。其中圖1A為不同濃度的22 (R)-羥膽固醇對PARP1活性的影響；圖1B為不同濃度的煙酸對PARP1活性的影響。
[0017]圖2包括圖2A和圖2B ;圖2A中添加了不同濃度的22 (R)-羥膽固醇、利用蛋白印跡實驗檢測IfepG2細胞全蛋白抽提物中的多聚核糖化蛋白表達程度；圖28為分別給予不同濃度的22 (R)-羥固醇的刺激、檢測Η印G2細胞內(nèi)的PARP1蛋白表達水平的結(jié)果。
[0018]圖3和圖4中在無細胞蛋白體系中，將重組組蛋白Η1與PARP1，NAD+，DNA和22 (R)-羥固醇(0.5，1，3 μ mol/L)進行孵育。
[0019]圖3中PARP1活性檢測試劑盒檢測測定PARP1活性。與PARP1/NAD+/DNA組相比##P < 0.01。圖3包括圖3A和圖3B ;其中圖3A為不同濃度的22 (R)-羥膽固醇對PARP1活性的影響；其中圖3B為不同濃度的煙酸對PARP1活性的影響。
[0020]圖4蛋白印跡實驗檢測無細胞蛋白體系中孵育體系蛋白的多聚核糖化水平。
【具體實施方式】
[0021]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0022]本發(fā)明實施例所涉及的方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)的實驗方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的技術(shù)手段可以實現(xiàn)本發(fā)明實施例所述的實驗方法。
[0023]以下實施例分別應(yīng)用離體細胞實驗和無細胞PARP1酶促反應(yīng)體系研究22 (R)-羥基膽固醇對PARP1酶活性的抑制作用。
[0024]參考相關(guān)的文獻(HuangD, Yang C,ffang Y, Liao Y，&Huang K.PARP-1 suPPressesadiponectin express1n through poly(ADP-ribosyl)at1n of PPAR gamma in cardiacfibroblasts.Card1vascular research，2009，81 (1):98-107.)，分別構(gòu)建了體外無細胞PARP1酶促反應(yīng)體系及活性測定試驗體系，以進行此三種試劑對PARP1活性的作用效果檢測。
[0025]實施例中米用的22 (R)-輕基膽固醇(簡寫為22 (R)-HC)購自chemical book，型號 17954-98-2。
[0026]實施例1利用無細胞PARP1酶促反應(yīng)體系檢測
[0027]利用PARP1活性檢測試劑盒構(gòu)建無細胞PARP1酶促反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系能在體外環(huán)境中激活PARP1酶的活性。
[0028]實施例中使用的PARP1活性檢測試劑盒購自Trevigen公司，產(chǎn)地美國，型號為4676-096-Ko
[0029]PARP1活性檢測試劑盒包括緩沖液、PARP1重組蛋白、NAD+、單鏈斷裂DNA、重組組蛋白 1 (Histone HI)。
[0030]按照PARP1活性檢測試劑盒進行配置無細胞PARP1酶促反應(yīng)體系，具體操作步驟如下:在緩沖液中加入50ng PARP1重組蛋白(PARPlprotein)、終濃度為10mmol/L NAD\終濃度為20mg/mL單鏈斷裂DNA后。組成緩沖液的各組分在反應(yīng)體系中的終濃度分別為:Tris-HCl (pH 8.0)的終濃度為100mmol/L、MgCl2的終濃度為20mmol/L、二硫蘇糖醇的終濃度為lmmol/L。配置完成后，于37°C恒溫箱中共孵育25分鐘。
[0031]在上述無細胞PARP1酶促反應(yīng)體系中，選用重組組蛋白1 (Histone HI)作為目標蛋白(所述Histone HI為PARP1重組蛋白的目標蛋白，能被多聚ADP核糖化修飾)，選用3-氨基苯甲酰胺(3AB)作為PARP1抑制劑并同時作為陽性對照藥物，選用煙酸(nicotinica