專利名稱：結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白β亞基類熒光蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測(cè)可溶性抗原或抗體的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變?cè)逅{(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ;PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ;PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ;CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。 可以從藻類中提取得到藻藍(lán)蛋白，并分離出其alpha和beta亞基，alpha亞基的80位半胱氨酸殘基通過硫醚健共價(jià)結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB， beta亞基82位和153位半胱氨酸殘基分別通過硫醚健共價(jià)結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB ;也可以通過基因工程利用大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)。CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ， Cai YA， GlazerAN.Biosynthesis ofa fluorescent cyanobacterial C-phycocy肌iri holo-alpha sub皿it ina heterologous host[J].Proc NatlAcad Sci USA，2001，98(19) : 10560 10565) 。 CPC的beta亞基也可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，利用基因工程，不僅可以得到藻藍(lán)蛋白beta亞基82位結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB的熒光蛋白(其光譜圖如圖1所示)，同時(shí)還可以對(duì)其肽鏈氨基酸進(jìn)行突變、進(jìn)行有益的標(biāo)記，更重要的是，我們可以得到一種結(jié)合藻紅膽素PEB而不是結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB的熒光藻藍(lán)蛋白beta亞基(如圖2、圖3所示)。這種結(jié)合了 PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白，由于結(jié)合了新的色素PEB，其熒光特性與天然的結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白有明顯區(qū)別。 鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大作用，提高檢測(cè)靈敏度。目前鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測(cè)和醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對(duì)目標(biāo)的標(biāo)記。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達(dá)載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白beta裂合酶能催化藻紅膽素與藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)(其光譜如圖4、圖5所示)。此蛋白可直接應(yīng)用于免疫熒光檢測(cè)等領(lǐng)域。 免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍夭坏芘c抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測(cè)或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測(cè)或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是非特異性染色問題尚未完全解決，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。同時(shí)，由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。 藻膽蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，其熒光性質(zhì)受到環(huán)境影響較小，適合作為熒光探針使用。本發(fā)明中的藻膽蛋白已經(jīng)直接標(biāo)記有鏈霉親和素，利用間接檢測(cè)法，通過生物素_鏈霉親和素系統(tǒng)，利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白與生物素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的檢測(cè)。生物素-鏈霉親和素提高了檢測(cè)的靈敏度，同時(shí)由于抗抗體的通用性，使本檢測(cè)方法可以方便的用于各種抗原的檢測(cè)；熒光藻膽蛋白具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，較高的熒光效率、較大波長的熒光發(fā)射峰，可以提高檢測(cè)靈敏度，減少本底熒光的影響。本方法有利于熒光藻膽蛋白在免疫檢測(cè)中應(yīng)用的推廣。 藻膽蛋白目前正逐漸在各種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，特別是在免疫熒光檢測(cè)方面有很大的開發(fā)利用前景。通過改造后具有較高熒光效率、帶有可利用標(biāo)記的藻膽蛋白，會(huì)大大提升其在免疫熒光檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，這為藻膽蛋白在醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體的氨基酸序列，并標(biāo)明其色素結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)提供利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測(cè)可溶性抗原或抗體的免疫檢測(cè)方法。這類鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基具有與天然藻類中存在的藻藍(lán)蛋白beta亞基不同的結(jié)構(gòu)，并且其熒光光譜性質(zhì)也有極大區(qū)別，同時(shí)，提供了此類帶有鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基用于檢測(cè)可溶性抗原的方法它是利用抗體與抗原特異性反應(yīng)、鏈霉親和素可以與生物素特異結(jié)合的原理，利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測(cè)可溶性抗原或抗體。 為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用藻藍(lán)蛋白beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，并且標(biāo)明了其色素結(jié)合位點(diǎn)，該類蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標(biāo)記，但是His-tag標(biāo)記不限于N端。
所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列1 : 序列1 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn)) 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基的82位。 —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基突變體，對(duì)除結(jié)合色素的130外的所有位點(diǎn)進(jìn)行突變一般不會(huì)對(duì)蛋白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對(duì)此蛋白進(jìn)行部分缺失，對(duì)蛋白性質(zhì)無較大影響，也屬于同類蛋白。
將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法把其第201位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，可表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基突變體。 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白的突變體序列為序列2 : 序列2 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn)，第201位異亮氨酸I由C突變而來) 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基的82位。
—種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白beta亞基的融合蛋白。 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列3 : 序列3 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))SSVAVGIQKMKEAAINIANDPNGITKGDCSALISEVASYFDRAAAAVA 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，鏈 霉親和素在CpcB的N端，但是不限于在N端。 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，結(jié) 合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞 基的82位。 —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變 體，將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基 因工程方法把其第329位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變 為異亮氨酸殘基，表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白beta亞基的融合蛋白的突變體。
所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突 變體的序列為序列4 : 序列4 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn)，第329位異亮氨酸I 由C突變而來)
SSVAVGIQKMKEAAINIANDPNGITKGDISALISEVASYFDRAAAAVA 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突 變體，結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白 beta亞基的82位。 結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白的應(yīng)用，利用鏈霉親和素標(biāo)記 的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白檢測(cè)可溶性抗原或抗體的免疫檢測(cè)。
所述的免疫檢測(cè)包括以下步驟 (1)將可與固相結(jié)合并能識(shí)別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗 體部分，備用； (2)將待測(cè)抗原、識(shí)別抗原的第二抗體、識(shí)別第二抗體的標(biāo)記生物素的抗抗體、標(biāo)
記鏈霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應(yīng)； (3)利用微孔板熒光檢測(cè)儀或其它相應(yīng)的儀器檢測(cè)熒光，分析結(jié)果。 本發(fā)明的有益效果是結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基由于具有His-tag標(biāo)記，便于
提純，且由于此蛋白是單一亞基構(gòu)成，比具多個(gè)亞基的天然藻藍(lán)蛋白更具均一性；相比具有
與結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白beta亞基完全不同的光譜性質(zhì)，其熒光效率高，用于免疫檢測(cè)中有
更好的靈敏度；與鏈霉親和素形成融合蛋白后，實(shí)現(xiàn)了鏈霉親和素直接標(biāo)記，可以直接用于
免疫檢測(cè)中，不需要利用化學(xué)方法等進(jìn)行鏈霉親和素標(biāo)記。


圖1 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光光
7譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖2 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光光 譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖3 :第153位半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼岷螅?2位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻 藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜；
圖4 :鏈霉親和素標(biāo)記的82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光 蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖5 :第153位半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼岷?，鏈霉親和素標(biāo)記的82位半胱氨
酸殘基結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光
譜，虛線為熒光光譜。 蛋白質(zhì)氨基酸序列附件 序列1 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
SSVAVGIQKMKEAAINIANDPNGITKGDISALISEVASYFDRAAAAVA
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，但這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)
明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列1所示，將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對(duì)其進(jìn)行提純， 還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第130位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta 亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖2所示，吸收峰為556nm，熒光發(fā)射峰為572nm。
實(shí)施例2 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列2所示，將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì) 粒，利用基因工程方法對(duì)其進(jìn)行突變，可表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基突變體，其N端帶有 His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對(duì)其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健 結(jié)合在第130位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖 3所示，吸收峰為556nm，熒光發(fā)射峰為572nm。
實(shí)施例3 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列3所示，將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白beta亞基編 碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白beta亞基的融合蛋白， 直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對(duì)藻藍(lán)蛋白beta亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利 于對(duì)其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第258位(相當(dāng)于 原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖4所示，吸收峰為556nm， 熒光發(fā)射峰為572nm。
實(shí)施例4 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列4所示，將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白beta亞基編 碼基因突變體拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法對(duì)其進(jìn)行突變，表達(dá)得到的鏈霉 親和素和藻藍(lán)蛋白beta亞基突變體的融合蛋白突變體，直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對(duì)藻藍(lán)蛋白 beta亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對(duì)其進(jìn)行提純，還有助于提高其 溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第258位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第82位) 半胱氨酸殘基上。其光譜如圖5所示，吸收峰為556nm，熒光發(fā)射峰為572nm。
實(shí)施例5 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% T獄n-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做九個(gè)平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對(duì)照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每三個(gè)平行樣為一組，分以下三種步驟完成 第一種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟①準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用；③取標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白，用pH7. 2的0. 05M磷 酸鉀、0. 5MNaCl緩沖液稀釋至10 y g/mL，取150 P L加入到步驟②準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照 孔中，37"C孵育0. 5小時(shí); 第二種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋 白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟 (2)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用 洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液 體，備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別都是10 g/mL，取上述溶液150 y L加 入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)； 第三種取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含 0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，癌胚抗原CEA的兔多克 隆抗體終濃度為2 g/mL，另外兩個(gè)組分的終濃度分別都是10 g/mL ;取上述溶液150 y L 加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值。
實(shí)施例6 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，兩組平行樣分別fC和37。C包被12 至20小時(shí)；倒去包被用的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖 液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)300 y L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液 (含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做六個(gè)平行樣，另取兩孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對(duì)照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別都是10 g/mL，取上述溶液150 y L加 入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值。
實(shí)施例7 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中， 做二十七個(gè)平行樣，另取九孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對(duì)照，37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別為5 ii g/mL、5 ii g/mL， 5 y g/mL、 10 y g/ mL， 5 li g/mL、20 u g/mL，10 u g/mL、5 u g/mL，10 u g/mL、10 u g/mL，10 u g/mL、20 u g/mL， 20u g/mL、5u g/mL，20u g/mL、10u g/mL，20u g/mL、20u g/mL，取上述溶液150u L分另U力口 入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照孔中，每一種濃度對(duì)應(yīng)一組平行樣，37t:孵育1. 5小 時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值。
實(shí)施例8
11
(1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做六個(gè)平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對(duì)照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液或pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃 度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體20 g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的 藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白10 g/mL，取上述溶液150 y L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行 樣及空白對(duì)照孔中，每一種溶液對(duì)應(yīng)一組平行樣，37t:孵育1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值。
實(shí)施例9 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做九個(gè)平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對(duì)照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成
①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7.2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體20ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白10y g/mL，取上述 溶液150iiL分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照孔中，三組平行樣分別37t:孵育
0. 5小時(shí)、1小時(shí)、1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值。
實(shí)施例10 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL、
1. 562ng/mL、0. 781ng/mL、0. 390ng/mL，分別取150y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，每個(gè)濃度做二個(gè)平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對(duì)照，37t:孵育1. 5小 時(shí)，倒去液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗 滌4次，甩干液體，備用； (3)按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對(duì)照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán) 蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7.2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體20ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白10y g/mL，取上述 溶液150 ii L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對(duì)照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)；
(4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl 緩沖液，置于微孔板熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)熒光值。 上述蛋白中，His-tag標(biāo)記和鏈霉親和素標(biāo)記所處的位置不限定位于蛋白N端，位 于別的位置只要不影響藻藍(lán)蛋白beta亞基蛋白的活性也可以同樣實(shí)施本發(fā)明。同時(shí)，除了 82位和153位半胱氨酸外，對(duì)藻藍(lán)蛋白beta亞基氨基酸序列進(jìn)行的其余突變，若對(duì)藻藍(lán)蛋 白beta亞基蛋白熒光性質(zhì)無較大影B向，也可同樣實(shí)施本發(fā)明；對(duì)藻藍(lán)蛋白beta亞基氨基 酸序列的N端或C端進(jìn)行部分缺失，也不會(huì)對(duì)藻藍(lán)蛋白beta亞基蛋白熒光性質(zhì)產(chǎn)生較大影 響，也可同樣實(shí)施本發(fā)明。 上述檢測(cè)方法適用于利用各種不同抗體或抗原、不同固相載體、熒光檢測(cè)儀器來 檢測(cè)可溶性抗原或抗體。但由于可能涉及的抗體種類及其繁多，藻膽蛋白種類也較多，本 發(fā)明只選取癌胚抗原及其一種鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合 PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基(153位半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?為例，在以96孔板為固相載 體，利用微孔板熒光檢測(cè)儀，對(duì)本發(fā)明加以說明。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的 內(nèi)容，材料其他材料和儀器，實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標(biāo)記，但是His-tag標(biāo)記不限于N端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 、2或3所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基的82位。
5. —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基突變體，對(duì)除結(jié)合色素的130外的所有位點(diǎn)進(jìn)行突變一般不會(huì)對(duì)蛋白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對(duì)此蛋白進(jìn)行部分缺失，對(duì)蛋白性質(zhì)無較大影響，也屬于同類蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法把其第201位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，可表達(dá)得到藻藍(lán)蛋白beta亞基突變體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白的突變體，其特征在于所述的突變體的序列為序列2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基的82位。
9. 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白beta亞基的融合蛋白。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列3。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于鏈霉親和素在CpcB的N端，但是不限于在N端。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9、10或11所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基的82位。
13. —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，將鏈霉親和素編碼基因和藻藍(lán)蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法把其第329位(相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白beta亞基的融合蛋白的突變體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列4。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當(dāng)于原始藻藍(lán)蛋白beta亞基的82位。
16. 結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白的應(yīng)用，其特征在于利用鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白檢測(cè)可溶性抗原或抗體的免疫檢測(cè)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白beta亞基類熒光蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述的免疫檢測(cè)包括以下步驟(1) 將可與固相結(jié)合并能識(shí)別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗體部分，備用；(2) 將待測(cè)抗原、識(shí)別抗原的第二抗體、識(shí)別第二抗體的標(biāo)記生物素的抗抗體、標(biāo)記鏈霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應(yīng)；(3) 利用微孔板熒光檢測(cè)儀或其它相應(yīng)的儀器檢測(cè)熒光，分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻藍(lán)蛋白β亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，其序列為序列1、序列2、序列3和序列4；并公開了融合鏈霉親和素的熒光蛋白直接用于熒光免疫檢測(cè)的方法；藻藍(lán)蛋白beta亞基保守的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵不僅可以結(jié)合藻藍(lán)膽素PCB，通過基因工程發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白beta亞基保守的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵也可以結(jié)合藻紅膽素PEB，得到一類新型的熒光藻藍(lán)蛋白，這類蛋白的光譜性質(zhì)與結(jié)合PCB的藻藍(lán)蛋白beta亞基熒光蛋白完全不同，有較高的熒光效率，同時(shí)由于帶有His-tag標(biāo)記，便于提純，還有助于改善其溶解性，與鏈霉親和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫熒光檢測(cè)，有利于其在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101759797SQ20081021967
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者佟順剛, 周明, 夏坤, 趙開弘 申請(qǐng)人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學(xué)