專利名稱：結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白β亞基類熒光蛋白及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白及其應用，屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領域，具體涉及結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測可溶性抗原或抗體的檢測方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ;PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ;PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ;CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。 可以從藻類中提取得到藻紅藍蛋白，并分離出其alpha和beta亞基，alpha亞基的80位半胱氨酸殘基通過硫醚健共價結(jié)合藻藍膽素PCB， beta亞基82位和153位半胱氨酸殘基分別通過硫醚健共價結(jié)合藻藍膽素PCB;也可以通過基因工程利用大腸桿菌進行生產(chǎn)。PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ，GlazerAN. Biosynthesis ofthecyanobacterial light—harvesting polypeptidephycoerythrocyanin holo-alpha sub皿it in ^heterologous host. J Bacteriol. 2002 j184(17) :4666 4671)。 PEC的beta亞基也可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，利用基因工程，不僅可以得到藻紅藍蛋白beta亞基82位結(jié)合藻藍膽素PCB的熒光蛋白(其光譜圖如圖1所示)，同時還可以對其肽鏈氨基酸進行突變、進行有益的標記，更重要的是，我們可以得到一種結(jié)合藻紅膽素PEB而不是結(jié)合藻藍膽素PCB的熒光藻紅藍蛋白beta亞基(如圖2、圖3所示)。這種結(jié)合了 PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白，由于結(jié)合了新的色素PEB，其熒光特性與天然的結(jié)合PCB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白有明顯區(qū)別。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)，可以實現(xiàn)信號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應用于生物學檢測和醫(yī)療檢測等領域。目前主要是通過化學交聯(lián)實現(xiàn)鏈霉親和素對目標的標記。本發(fā)明通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達得到鏈霉親和素和別藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實現(xiàn)鏈霉親和素和別藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白beta裂合酶能催化藻紅膽素與藻紅藍蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的鏈霉親和素標記的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)(其光譜如圖4、圖5所示)。此蛋白可直接應用于免疫熒光檢測等領域。 免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標記而獲得成功。 用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應用，所以人們習慣稱為熒光抗體技術(shù)，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。 該技術(shù)的主要特點是特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是非特異性染色問題尚未完全解決，技術(shù)程序也還比較復雜。同時，由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。 藻膽蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，其熒光性質(zhì)受到環(huán)境影響較小，適合作為熒光探針使用。本發(fā)明中的藻膽蛋白已經(jīng)直接標記有鏈霉親和素，利用間接檢測法，通過生物素_鏈霉親和素系統(tǒng)，利用鏈霉親和素標記的熒光藻膽蛋白與生物素標記的抗抗體結(jié)合，從而實現(xiàn)對抗原的檢測。生物素-鏈霉親和素提高了檢測的靈敏度，同時由于抗抗體的通用性，使本檢測方法可以方便的用于各種抗原的檢測；熒光藻膽蛋白具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，較高的熒光效率、較大波長的熒光發(fā)射峰，可以提高檢測靈敏度，減少本底熒光的影響。本方法有利于熒光藻膽蛋白在免疫檢測中應用的推廣。 藻膽蛋白目前正逐漸在各種領域得到廣泛應用，特別是在免疫熒光檢測方面有很大的開發(fā)利用前景。通過改造后具有較高熒光效率、帶有可利用標記的藻膽蛋白，會大大提升其在免疫熒光檢測中的應用價值，這為藻膽蛋白在醫(yī)藥和生物工程領域的應用奠定了基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體的氨基酸序列，并標明其色素結(jié)合位點，同時提供利用鏈霉親和素標記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測方法。這類鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基具有與天然藻類中存在的藻紅藍蛋白beta亞基不同的結(jié)構(gòu)，并且其熒光光譜性質(zhì)也有極大區(qū)別，同時，提供了此類帶有鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基用于檢測可溶性抗原的方法它是利用抗體與抗原特異性反應、鏈霉親和素可以與生物素特異結(jié)合的原理，利用鏈霉親和素標記
的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體。 為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，利用藻紅藍蛋白beta裂合酶表達質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，并且標明了其色素結(jié)合位點，該類蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標記，但是His-tag標記不限于N端。
結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的蛋白質(zhì)序列為序列1 :
序列1 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點) 結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基的82位。 —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表達得到藻紅藍蛋白beta亞基突變體，對除結(jié)合色素的130外的所有位點進行突變一般不會對蛋白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對此蛋白進行部分缺失，對蛋白性質(zhì)無較大影響，也屬于同類蛋白。
將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表達得到藻紅藍蛋白beta亞基的突變體，利用藻紅藍蛋白beta裂合酶表達質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，并且標明了其色素結(jié)合位點。 將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法把其第201位(相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，可表達得到藻紅藍蛋白beta亞基突變體。 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的突變體的序列為序列2 : 序列2 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點，第201位異亮氨酸I由C突變而來) 上述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基的82位。 —種鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將鏈霉親和素編碼基因和藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達質(zhì)粒，表達得到鏈霉親和素和藻紅藍蛋白beta亞基的融合蛋白。
上述的蛋白質(zhì)的序列為序列3 : 序列3 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點)
6
DAVASGIKKMKEAALKIANDPNGITKGDCSQLMSELASYFDRAAAAVA 所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白， 鏈霉親和素在PecB的N端，但是不限于在N端。 所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白， 結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當于原始藻紅藍蛋白 beta亞基的82位。 —種鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突 變體，將鏈霉親和素編碼基因和藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達質(zhì)粒，利 用基因工程方法把其第329位(相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基 突變?yōu)楫惲涟彼釟埢磉_得到鏈霉親和素和藻紅藍蛋白beta亞基的融合蛋白的突變體。
所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白 突變體的蛋白質(zhì)序列為序列4 : 序列4 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點，第329位異亮氨酸I 由C突變而來)
DAVASGIKKMKEAALKIANDPNGITKGDISQLMSELASYFDRAAAAVA 鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體， 結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當于原始藻紅藍蛋白 beta亞基的82位。 結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的應用，利用鏈霉親和素標 記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫 檢測。 所述的免疫檢測包括以下步驟 (1)將可與固相結(jié)合并能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗 體部分，備用； (2)將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標記生物素的抗抗體、標
記鏈霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應； (3)利用微孔板熒光檢測儀或其它相應的儀器檢測熒光，分析結(jié)果。 本發(fā)明的有益效果結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基由于具有His-tag標記，便
于提純，且由于此蛋白是單一亞基構(gòu)成，比具多個亞基的天然藻紅藍蛋白更具均一性；相比
具有與結(jié)合PCB的藻紅藍蛋白beta亞基完全不同的光譜性質(zhì)，其熒光效率高，用于免疫檢
測中有更好的靈敏度；與鏈霉親和素形成融合蛋白后，實現(xiàn)了鏈霉親和素直接標記，可以直接用于免疫檢測中，不需要利用化學方法等進行鏈霉親和素標記。


圖1 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PCB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光 光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖2 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光 光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖3 :第153位半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼岷螅?2位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的 藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光 譜； 圖4 :鏈霉親和素標記的82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒 光蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖5 :第153位半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼岷?，鏈霉親和素標記的82位半胱氨
酸殘基結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實線為吸收光
譜，虛線為熒光光譜。 蛋白質(zhì)氨基酸序列附件 序列1 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點) 序列2 由C突變而來)
(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點，第201位異亮氨酸I
序列3 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點)
DAVASGIKKMKEAALKIANDPNGITKGDCSQLMSELASYFDRAAAAVA 序列4 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點，第329位異亮氨酸I 由C突變而來)
DAVASGIKKMKEAALKIANDPNGITKGDISQLMSELASYFDRAAAAVA
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳述，但這些實施例僅用于說明本發(fā)
明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列l(wèi)所示，將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì) 粒，表達得到藻紅藍蛋白beta亞基，其N端帶有His-tag標記，這不僅有利于對其進行提 純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第130位(相當于原始藻紅藍蛋 白beta亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖2所示，吸收峰為546nm，熒光發(fā)射峰 為566nm。
實施例2 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列2所示，將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì) 粒，利用基因工程方法對其進行突變，可表達得到藻紅藍蛋白beta亞基突變體，其N端帶有 Hi s-tag標記，這不僅有利于對其進行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健 結(jié)合在第130位(相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如 圖3所示，吸收峰為546nm，熒光發(fā)射峰為566nm。
實施例3 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列3所示，將鏈霉親和素編碼基因和藻紅藍蛋白beta亞基 編碼基因拼接后克隆于表達質(zhì)粒，表達得到的鏈霉親和素和藻紅藍蛋白beta亞基的融合 蛋白，直接實現(xiàn)鏈霉親和素對藻紅藍蛋白beta亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不 僅有利于對其進行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第258位(相 當于原始藻紅藍蛋白beta亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖4所示，吸收峰為 546nm，熒光發(fā)射峰為566nm。
實施例4 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列4所示，將鏈霉親和素編碼基因和藻紅藍蛋白beta亞基 編碼基因突變體拼接后克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法對其進行突變，表達得到的鏈 霉親和素和藻紅藍蛋白beta亞基突變體的融合蛋白突變體，直接實現(xiàn)鏈霉親和素對藻紅 藍蛋白beta亞基的標記；且N端帶有His-tag標記，這不僅有利于對其進行提純，還有助于 提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第258位(相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基 第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖5所示，吸收峰為546nm，熒光發(fā)射峰為566nm。
實施例5 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做九個平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每三個平行樣為一組，分以下三種步驟完成 第一種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準備好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗 滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟①準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備 用；③取標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白，用pH7. 2的0. 05M 磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟②準備的平行樣及空白 對照孔中，37t:孵育0. 5小時； 第二種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準備好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗 滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋 白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別都是10 g/mL，取上述溶液150 y L加入 到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； 第三種取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體、生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含 0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，癌胚抗原CEA的兔多克 隆抗體終濃度為2 g/mL，另外兩個組分的終濃度分別都是10 g/mL ;取上述溶液150 y L 加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例6 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，兩組平行樣分別fC和37。C包被12 至20小時；倒去包被用的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖 液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)300 y L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液 (含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05 % Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔
10中，做六個平行樣，另取兩孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻 紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別都是10 y g/mL，取上述溶液 150iiL加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1.5小時；
(4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例7 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔中， 做二十七個平行樣，另取九孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1. 5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻 紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別為5 y g/mL、5 y g/mL， 5 ii g/mL、 10 ii g/mL， 5 u g/mL、20 u g/mL， 10 u g/mL、5 u g/mL， 10 u g/mL、 10 u g/mL， 10 u g/ mL、20ii g/mL，20ii g/mL、5ii g/mL，20ii g/mL、10ii g/mL，20ii g/mUOii g/mL，取上述溶液
11150i!L分別加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，每一種濃度對應一組平行樣， 37t:孵育1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例8 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做六個平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻 紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液或pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液)中，兩個組 分的終濃度分別為生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體20ii g/mL、標記鏈霉親和素的結(jié) 合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白10 y g/mL，取上述溶液150 y L分別加入到步驟① 準備的平行樣及空白對照孔中，每一種溶液對應一組平行樣，37t:孵育1. 5小時；
(4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例9 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備用；
12
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1 %牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，做九個平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含
0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準備 好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻 紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別為生物素標記的羊抗兔 免疫球蛋白抗體20ii g/mL、標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白 10 g/mL，取上述溶液150 L分別加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，三組平行 樣分別37t:孵育0. 5小時、1小時、1. 5小時； (4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實施例10 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標板，4t:包被12至20小時；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL、
1. 562ng/mL、0. 781ng/mL、0. 390ng/mL，分別取150y L加入到步驟(1)準備好的酶標板微孔 中，每個濃度做二個平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1. 5小 時，倒去液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗 滌4次，甩干液體，備用； (3)按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準 備好的酶標板微孔中，做三個平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時，倒去液體，用洗滌 緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋
13白beta亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個組分的終濃度分別為生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 20 ii g/mL、標記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白10 y g/mL，取上述 溶液150 L分別加入到步驟①準備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時；
(4)把步驟(3)所得酶標板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl 緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。 上述蛋白中，His-tag標記和鏈霉親和素標記所處的位置不限定位于蛋白N端，位 于別的位置只要不影響藻紅藍蛋白beta亞基蛋白的活性也可以同樣實施本發(fā)明。同時，除 了 82位和153位半胱氨酸外，對藻紅藍蛋白beta亞基氨基酸序列進行的其余突變，若對藻 紅藍蛋白beta亞基蛋白熒光性質(zhì)無較大影B向，也可同樣實施本發(fā)明；對藻紅藍蛋白beta亞 基氨基酸序列的N端或C端進行部分缺失，也不會對藻紅藍蛋白beta亞基蛋白熒光性質(zhì)產(chǎn) 生較大影響，也可同樣實施本發(fā)明。 上述檢測方法適用于利用各種不同抗體或抗原、不同固相載體、熒光檢測儀器來 檢測可溶性抗原或抗體。但由于可能涉及的抗體種類及其繁多，藻膽蛋白種類也較多，本 發(fā)明只選取癌胚抗原及其一種鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體、鏈霉親和素標記的結(jié)合 PEB的藻紅藍蛋白beta亞基(153位半胱氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?為例，在以96孔板為固相 載體，利用微孔板熒光檢測儀，對本發(fā)明加以說明。本領域內(nèi)的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開 的內(nèi)容，材料其他材料和儀器，實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，表達得到藻紅藍蛋白beta亞基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標記，但是His-tag標記不限于N端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基的82位。
5. —種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表達得到藻紅藍蛋白beta亞基突變體，對除結(jié)合色素的130外的所有位點進行突變一般不會對蛋白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對此蛋白進行部分缺失，對蛋白性質(zhì)無較大影響，也屬于同類蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法把其第201位(相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢?，可表達得到藻紅藍蛋白beta亞基突變體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的突變體，其特征在于所述的突變體的序列為序列2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在130位，相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基的82位。
9. 一種鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于將鏈霉親和素編碼基因和藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達質(zhì)粒，表達得到鏈霉親和素和藻紅藍蛋白beta亞基的融合蛋白。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列3。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的一種鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于鏈霉親和素在PecB的N端，但是不限于在N端。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9、10或11所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基的82位。
13. —種鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，將鏈霉親和素編碼基因和藻紅藍蛋白beta亞基編碼基因拼接后克隆于表達質(zhì)粒，利用基因工程方法把其第329位(相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基第153位)半胱氨酸殘基突變?yōu)楫惲涟彼釟埢磉_得到鏈霉親和素和藻紅藍蛋白beta亞基的融合蛋白的突變體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為序列4。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白突變體，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在258位，相當于原始藻紅藍蛋白beta亞基的82位。
16. 結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的應用，其特征在于利用鏈霉親和素標記的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白beta亞基類熒光蛋白的應用，其特征在于所述的免疫檢測包括以下步驟(1) 將可與固相結(jié)合并能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗體部分，備用；(2) 將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標記生物素的抗抗體、標記鏈霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應；(3) 利用微孔板熒光檢測儀或其它相應的儀器檢測熒光，分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的藻紅藍蛋白β亞基類熒光蛋白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，其序列為序列1、序列2、序列3和序列4；并公開了融合鏈霉親和素的熒光蛋白直接用于熒光免疫檢測的方法；藻紅藍蛋白beta亞基保守的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵不僅可以結(jié)合藻藍膽素PCB，通過基因工程發(fā)現(xiàn)，藻紅藍蛋白beta亞基保守的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵也可以結(jié)合藻紅膽素PEB，得到一類新型的熒光藻紅藍蛋白，這類蛋白的光譜性質(zhì)與結(jié)合PCB的藻紅藍蛋白beta亞基熒光蛋白完全不同，有較高的熒光效率，同時由于帶有His-tag標記，便于提純，還有助于改善其溶解性，與鏈霉親和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫熒光檢測，有利于其在各個領域中的應用。
文檔編號C12N15/63GK101759791SQ200810219668
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者佟順剛, 夏坤 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司