專利名稱：結(jié)合藻紅膽素peb的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白及其應(yīng)用，屬于 生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋 白、其與鏈霉親和素形成的融合蛋白及其突變體，以及利用此融合蛋白檢測可溶性抗原或 抗體的檢測方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。 根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻 藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC) 。 CPE、PEC、CPC和APC含alpha和beta亞基，每個(gè)亞 基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein) 半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜 性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可 見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約 620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB) ;PEC的 alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB) ;PEC的beta亞基結(jié) 合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB) ;CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為 藻藍(lán)膽素PCB。 利用裂合酶催化脫輔基蛋白與藻藍(lán)膽素PCB偶聯(lián)可制備別藻藍(lán)蛋白的各個(gè)亞基。 (Kai_hong Zhao，Ping Su. Phycobilin :cystein-84 biliprotein lyase, a near皿iversal lyase forcysteine_84_binding sites in cyanobacterial phycobiliproteins[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104 (36) : 14300 14305)。我們發(fā)現(xiàn)，別藻藍(lán)蛋白的各個(gè)亞基 的保守半胱氨酸殘基不僅可以偶聯(lián)藻藍(lán)膽素PCB，還可以跟藻紅膽素PEB偶聯(lián)，生成一類新 型的別藻藍(lán)蛋白亞基。我們利用大腸桿菌為宿主，利用裂合酶催化脫輔基蛋白與藻紅膽素 PEB，得到別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白質(zhì)。其光譜性質(zhì)如圖1、圖2、圖3、圖4、圖5所示，同 時(shí)還可以對其肽鏈氨基酸進(jìn)行突變、進(jìn)行有益的標(biāo)記。 鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信 號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素_生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測 和醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對目標(biāo)的標(biāo)記。本發(fā)明通過 基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達(dá)載 體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直 接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連接；通過藻膽蛋白裂合酶能催化藻紅 膽素與別藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì) 的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)(其光譜如圖6、圖7、圖8、圖9、圖10所示)。此類蛋白可直接應(yīng)用于免疫熒光檢測等領(lǐng)域。 免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫 技術(shù)中發(fā)展最早的一種免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技 術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建 立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗 原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo) 記而獲得成功。 用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物 示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，因?yàn)闊晒馍?不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測 或定位抗體，但是在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù)， 或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。 該技術(shù)的主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是非特異性染色 問題尚未完全解決，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。同時(shí)，由于一般熒光測定中的本底較高等問 題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。 藻膽蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，其熒光性質(zhì)受到環(huán)境影響較小，適合作為熒光探針使用。本發(fā) 明中的藻膽蛋白已經(jīng)直接標(biāo)記有鏈霉親和素，利用間接檢測法，通過生物素_鏈霉親和素 系統(tǒng)，利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白與生物素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對抗原 的檢測。生物素-鏈霉親和素提高了檢測的靈敏度，同時(shí)由于抗抗體的通用性，使本檢測方 法可以方便的用于各種抗原的檢測；熒光藻膽蛋白具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，較高的熒光效率、 較大波長的熒光發(fā)射峰，可以提高檢測靈敏度，減少本底熒光的影響。本方法有利于熒光藻 膽蛋白在免疫檢測中應(yīng)用的推廣。 藻膽蛋白目前正逐漸在各種領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，特別是在免疫熒光檢測方面有很 大的開發(fā)利用前景。通過改造后具有較高熒光效率、帶有可利用標(biāo)記的藻膽蛋白，會大大提 升其在免疫熒光檢測中的應(yīng)用價(jià)值，這為藻膽蛋白在醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基 礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基及其與鏈霉親 和素形成的融合蛋白的氨基酸序列，并標(biāo)明其色素結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)提供利用鏈霉親和素標(biāo) 記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測方法。這類鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻 紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基具有良好的熒光性質(zhì)，提供了此類帶有鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié) 合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基用于檢測可溶性抗原的方法它是利用抗體與抗原特異 性反應(yīng)、鏈霉親和素可以與生物素特異結(jié)合的原理，利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白 檢測可溶性抗原或抗體。 為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 將別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用別藻藍(lán)蛋白裂合酶表達(dá)質(zhì)粒以 及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋 白，并且標(biāo)明了其色素結(jié)合位點(diǎn)，該類蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標(biāo)記，但是His-tag標(biāo)記不限于N端。 將別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表 達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白亞基突變體，對除結(jié)合色素的130(或129)位外的所有位點(diǎn)進(jìn)行突變一 般不會對蛋白性質(zhì)有較大的影響，屬于同類蛋白，對此蛋白進(jìn)行部分缺失，對蛋白性質(zhì)無較 大影響，也屬于同類蛋白。 將別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用基因工程方法將其突變，可表 達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白亞基的突變體，利用別藻藍(lán)蛋白裂合酶表達(dá)質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成 酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，并且標(biāo)明了其色 素結(jié)合位點(diǎn)。 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白的蛋白質(zhì)氨基酸序列為 ApcA為序列1、ApcA2為序列2、 ApcB為序列3、ApcD為序列4、ApcF為序列5 :
序列1 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
序列2 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
GDSTPIQEIGVIGVREMYRSLGTPIEAVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ
序列3 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
TAALEKLKAYFSTGELRVRAATTISANAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRYATYAML 序列4 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))

序列5 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn)) 所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在ApcA的129位，相
當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A亞基的81位，ApcA2的129位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A2亞基的81
位，ApcB的130位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白B亞基的82位，ApcD的129位，相當(dāng)于原始別藻
藍(lán)蛋白D亞基的81位，ApcF的130位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白F亞基的82位。 將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用
別藻藍(lán)蛋白裂合酶表達(dá)質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成結(jié)合
PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，并且標(biāo)明了其色素結(jié)合位點(diǎn)。 將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，利用
5基因工程方法將其突變，可表達(dá)得到鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基的融合蛋白的突變體， 利用別藻藍(lán)蛋白裂合酶表達(dá)質(zhì)粒以及藻紅膽素PEB合成酶質(zhì)粒，可以在大腸桿菌中合成鏈 霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白突變體，并且標(biāo)明了其色素結(jié)合位 點(diǎn)。 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白的氨基酸序列為 鏈霉親和素標(biāo)記的ApcA為序列6、鏈霉親和素標(biāo)記的ApcA2為序列7、鏈霉親和素 標(biāo)記的ApcB為序列8、鏈霉親和素標(biāo)記的ApcD為序列9、鏈霉親和素標(biāo)記的ApcF為序列 10 : 序列6 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
AVGEGVRALKNAASTLLSAEDAAEAGSYFDYVVGALQ 序列7 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
AVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ 序列8 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
NAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRYATYAMLAGDPSILDERVLNGLKETYNSLGVPV GATVQAIQAIKEVTASLVGADAGKEMGIYLDYISSGLS 序列9 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
GMVEAINSLKKASLDLLSSEDAAAAAPYFDYIIQAMS 序列10 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
GPTVRGVQILKDLVKEQVAGAGIANTTFVEEPFDHITRELSERDV —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，鏈霉親
6和素在別藻藍(lán)蛋白的N端，但是不限于在N端。 鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB藻紅膽素PEB通過硫醚鍵 結(jié)合在鏈霉親和素標(biāo)記的ApcA的257位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A亞基的81位，鏈霉親 和素標(biāo)記的ApcA2的257位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A2亞基的81位，鏈霉親和素標(biāo)記的 ApcB的258位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白B亞基的82位，鏈霉親和素標(biāo)記的ApcD的257位， 相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白D亞基的81位，鏈霉親和素標(biāo)記的ApcF的258位，相當(dāng)于原始別藻 藍(lán)蛋白F亞基的82位。 結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白的應(yīng)用 利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免疫檢測。 所述的鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白為鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB
的別藻藍(lán)蛋白亞基類蛋白。 本發(fā)明提供的利用鏈霉親和素標(biāo)記的熒光藻膽蛋白檢測可溶性抗原或抗體的方 法，其步驟如下 (1)將可與固相結(jié)合并能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗 體部分，備用； (2)將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標(biāo)記生物素的抗抗體、標(biāo)
記鏈霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應(yīng)； (3)利用微孔板熒光檢測儀或其它相應(yīng)的儀器檢測熒光，分析結(jié)果。 本發(fā)明的有益效果結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基由于具有His-tag標(biāo)記，便于提
純，且由于此蛋白是單一亞基構(gòu)成，比具多個(gè)亞基的天然別藻藍(lán)蛋白更具均一性，用于免疫
檢測中有更好的靈敏度；與鏈霉親和素形成融合蛋白后，實(shí)現(xiàn)了鏈霉親和素直接標(biāo)記，可以
直接用于免疫檢測中，不需要利用化學(xué)方法等進(jìn)行鏈霉親和素標(biāo)記。


圖1 :81位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白的吸收和熒光光 譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖2 :81位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白A2亞基熒光蛋白的吸收和熒光光 譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖3 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白B亞基熒光蛋白的吸收和熒光光 譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖4 :81位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白D亞基熒光蛋白的吸收和熒光光 譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖5 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白F亞基熒光蛋白的吸收和熒光光 譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖6 :81位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋 白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖7 :81位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白A2亞基熒光蛋 白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖8 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白B亞基熒光蛋白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖9 :81位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白D亞基熒光蛋 白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜； 圖10 :82位半胱氨酸殘基結(jié)合PEB的鏈霉親和素標(biāo)記的別藻藍(lán)蛋白F亞基熒光蛋
白的吸收和熒光光譜圖，其中實(shí)線為吸收光譜，虛線為熒光光譜。 蛋白質(zhì)氨基酸序列附件 序列1 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
序列2 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
GDSTPIQEIGVIGVREMYRSLGTPIEAVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ序列3 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))MHHHHHHSSGLVPRGSGM
NAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGGNMYTTRRYAACIRDLDYYLRYATYAMLAGDPSILDERVLNGLKETYNSLGVPV GATVQAIQAIKEVTASLVGADAGKEMGIYLDYISSGLS 序列4 :(第129位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
序列5 :(第130位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))MHHHHHHSSGLVPRGSGM
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序列6 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
AVGEGVRALKNAASTLLSAEDAAEAGSYFDYVVGALQ 序列7 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
AVAESIRAMKYVATS匪SVEDRAEVDTYFDYLIGAMQ 序列8 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
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NAAAIVKEAVAKSLLYSDITRPGG畫YTTRRYAACIRDLDY YLRYATYAMLAGDPSILDERVLNGLKETYNSLGVP VGATVQAIQAIKEVTASLVGADAGKEMGIYLDYISSGLS 序列9 :(第257位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
GMVEAINSLKKASLDLLSSEDAAAAAPYFDYIIQAMS 序列10 :(第258位半胱氨酸C為藻紅膽素PEB的結(jié)合位點(diǎn))
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具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，但這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)
明，并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列l(wèi)所示，將別藻藍(lán)蛋白A亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒， 表達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白A亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純，還有 助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第129位(相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋A亞基第 81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖1所示，吸收峰為551nm，熒光發(fā)射峰為568nm。
實(shí)施例2 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列2所示，將別藻藍(lán)蛋白A2亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì) 粒，表達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白A2亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純， 還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第129位(相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A2 亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖2所示，吸收峰為552nm，熒光發(fā)射峰為568nm。
實(shí)施例3 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列3所示，將別藻藍(lán)蛋白B亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒， 表達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白B亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純，還有 助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第130位(相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白B亞基 第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖3所示，吸收峰為554nm，熒光發(fā)射峰為571nm。
實(shí)施例4 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列4所示，將別藻藍(lán)蛋白D亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒， 表達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白D亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純，還有
9助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第129位(相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白D亞基 第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖4所示，吸收峰為562nm，熒光發(fā)射峰為582nm。
實(shí)施例5 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列5所示，將別藻藍(lán)蛋白F亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒， 表達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白F亞基，其N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純，還有 助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第130位(相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白F亞基 第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖5所示，吸收峰為562nm，熒光發(fā)射峰為576nm。
實(shí)施例6 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列6所示，將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白A亞基編 碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白A亞基的融合蛋白， 直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對別藻藍(lán)蛋白A亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于 對其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第257位(相當(dāng)于原 始別藻藍(lán)蛋白A亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖6所示，吸收峰為551nm，熒光 發(fā)射峰為568nm。
實(shí)施例7 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列7所示，將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白A2亞基編 碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白A2亞基的融合蛋白， 直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對別藻藍(lán)蛋白A2亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利 于對其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第257位(相當(dāng)于 原始別藻藍(lán)蛋白A2亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖7所示，吸收峰為552nm， 熒光發(fā)射峰為568nm。
實(shí)施例8 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列8所示，將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白B亞基編 碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白B亞基的融合蛋白， 直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對別藻藍(lán)蛋白B亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于 對其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第258位(相當(dāng)于原 始別藻藍(lán)蛋白B亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖8所示，吸收峰為554nm，熒光 發(fā)射峰為571nm。
實(shí)施例9 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列9所示，將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白D亞基編 碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白D亞基的融合蛋白， 直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對別藻藍(lán)蛋白D亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于 對其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第257位(相當(dāng)于原 始別藻藍(lán)蛋白D亞基第81位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖7所示，吸收峰為562nm，熒光 發(fā)射峰為582nm。
實(shí)施例10 蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列IO所示，將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白F亞基編 碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到的鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白F亞基的融合蛋白， 直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對別藻藍(lán)蛋白F亞基的標(biāo)記；且N端帶有His-tag標(biāo)記，這不僅有利于對其進(jìn)行提純，還有助于提高其溶解性。藻紅膽素通過硫醚健結(jié)合在第258位(相當(dāng)于原 始別藻藍(lán)蛋白F亞基第82位)半胱氨酸殘基上。其光譜如圖8所示，吸收峰為562nm，熒光 發(fā)射峰為576nm。
實(shí)施例11 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做九個(gè)平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每三個(gè)平行樣為一組，分以下三種步驟完成 第一種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白 的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2) 準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗 滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體， 備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟①準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用；③取標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白，用pH7. 2的0. 05M磷酸 鉀、0. 5M NaCl緩沖液稀釋至10 y g/mL，取150 y L加入到步驟②準(zhǔn)備的平行樣及空白對照 孔中，37"C孵育0. 5小時(shí); 第二種①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋 白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟 (2)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用 洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液 體，備用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻 藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別都是10 ii g/mL，取上述溶液150 y L加 入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)； 第三種取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含 0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)中，癌胚抗原CEA的兔多克 隆抗體終濃度為2 ii g/mL，另外兩個(gè)組分的終濃度分別都是10 ii g/mL ;取上述溶液150 y L加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實(shí)施例12 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，兩組平行樣分別4t:和37。C包被12 至20小時(shí)；倒去包被用的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖 液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)300 y L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液 (含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用；
(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做六個(gè)平行樣，另取兩孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用；②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白 A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2 的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別都是10 ii g/mL，取上述溶液150 y L加入到步驟 ①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實(shí)施例13 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔中， 做二十七個(gè)平行樣，另取九孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，
12甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻 藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別為5 ii g/mL、5 ii g/mL， 5 y g/mL、 10 y g/ mL， 5 li g/mL、20 u g/mL，10 u g/mL、5 u g/mL，10 u g/mL、10 u g/mL，10 u g/mL、20 u g/mL， 20u g/mL、5u g/mL，20u g/mL、10u g/mL，20u g/mL、20u g/mL，取上述溶液150u L分另U力口 入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，每一種濃度對應(yīng)一組平行樣，37t:孵育1. 5小 時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實(shí)施例14 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做六個(gè)平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻 藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液或pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃 度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體20ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的
13別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白10 g/mL，取上述溶液150 L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣 及空白對照孔中，每一種溶液對應(yīng)一組平行樣，37t:孵育1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實(shí)施例15 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用； (2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL，取150 y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，做九個(gè)平行樣，另取三孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1.5小時(shí)，倒去 液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次， 甩干液體，備用； (3)每一組平行樣分別按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻 藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含0. 05 % Tween-20的 pH7.2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體 20 ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白10 y g/mL，取上述溶液 150 ii L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，三組平行樣分別37t:孵育0. 5小 時(shí)、1小時(shí)、1. 5小時(shí)； (4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的O. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl
緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。
實(shí)施例16 (1)將癌胚抗原CEA的小鼠單克隆抗體用包被緩沖液(0. 05M、 pH9. 6碳酸鹽緩沖 液)稀釋到2 ii g/mL，取150 ii L加入黑色96孔酶標(biāo)板，4t:包被12至20小時(shí)；倒去包被用 的抗體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4 次，甩干液體；每孔加入封閉緩沖液(含1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20的pH7. 2的 PBS緩沖液)300 ii L， 37。C封閉30分鐘；倒去封閉液，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的 pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備用；
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(2)取癌胚抗原CEA，用稀釋緩沖液(含O. 1%牛血清蛋白的含0.05% Tween-20 的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋到50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL、 1. 562ng/mL、0. 781ng/mL、0. 390ng/mL，分別取150y L加入到步驟(1)準(zhǔn)備好的酶標(biāo)板微孔 中，每個(gè)濃度做二個(gè)平行樣，另取二孔直接加入稀釋緩沖液作為空白對照，37t:孵育1. 5小 時(shí)，倒去液體，用洗滌緩沖液(含0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗 滌4次，甩干液體，備用；
(3)按以下步驟完成 ①取癌胚抗原CEA的兔多克隆抗體，用稀釋緩沖液(含0. 1 %牛血清蛋白的含 0. 05% Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)稀釋至2 y g/mL，取150 y L加入到步驟(2)準(zhǔn)備 好的酶標(biāo)板微孔中，做三個(gè)平行樣以及空白對照；37t:孵育1. 5小時(shí)，倒去液體，用洗滌緩 沖液(含0. 05 % Tween-20的pH7. 2的PBS緩沖液)洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體，備 用； ②取生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體和標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻 藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白混合加入稀釋緩沖液(含0. 1%牛血清蛋白的含0. 05% Tween-20 的pH7.2的PBS緩沖液)中，兩個(gè)組分的終濃度分別為生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗 體20ii g/mL、標(biāo)記鏈霉親和素的結(jié)合PEB的別藻藍(lán)蛋白A亞基熒光蛋白10y g/mL，取上述 溶液150ii L分別加入到步驟①準(zhǔn)備的平行樣及空白對照孔中，37t:孵育1. 5小時(shí)；
(4)把步驟(3)所得酶標(biāo)板倒去液體，用pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl緩沖 液洗滌酶標(biāo)板，洗滌4次，甩干液體后，每孔加入150 ii L pH7. 2的0. 05M磷酸鉀、0. 5M NaCl 緩沖液，置于微孔板熒光檢測儀中檢測熒光值。 上述蛋白中，His-tag標(biāo)記和鏈霉親和素標(biāo)記所處的位置不限定位于蛋白N端，位 于別的位置只要不影響別藻藍(lán)蛋白亞基蛋白的活性也可以同樣實(shí)施本發(fā)明。同時(shí)，除了 82 位或81位半胱氨酸外，對別藻藍(lán)蛋白亞基氨基酸序列進(jìn)行的其余突變，若對別藻藍(lán)蛋白亞 基蛋白熒光性質(zhì)無較大影響，也可同樣實(shí)施本發(fā)明；對別藻藍(lán)蛋白亞基氨基酸序列的N端 或C端進(jìn)行部分缺失，也不會對別藻藍(lán)蛋白亞基蛋白熒光性質(zhì)產(chǎn)生較大影響，也可同樣實(shí) 施本發(fā)明。 上述檢測方法適用于利用各種不同抗體或抗原、不同固相載體、熒光檢測儀器來 檢測可溶性抗原或抗體。但由于可能涉及的抗體種類及其繁多，藻膽蛋白種類也較多，本 發(fā)明只選取癌胚抗原及其一種鼠源單克隆抗體和兔源多克隆抗體、鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合 PEB的別藻藍(lán)蛋白A亞基為例，在以96孔板為固相載體，利用微孔板熒光檢測儀，對本發(fā)明 加以說明。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容，材料其他材料和儀器，實(shí)施本發(fā) 明。
權(quán)利要求
一種結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，其特征在于將別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到別藻藍(lán)蛋白亞基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，其特征在 于所述的蛋白質(zhì)的序列為ApcA為序列1、ApcA2為序列2、ApcB為序列3、ApcD為序列4、 ApcF為序列5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，其特 征在于所述的蛋白質(zhì)序列N端具有His-tag標(biāo)記，但是His-tag標(biāo)記不限于N端。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，其 特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合在ApcA的129位， 相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A亞基的81位，ApcA2的129位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A2亞基的 81位，ApcB的130位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白B亞基的82位，ApcD的129位，相當(dāng)于原始 別藻藍(lán)蛋白D亞基的81位，ApcF的130位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白F亞基的82位。
5. —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白，其特征在 于將鏈霉親和素編碼基因和別藻藍(lán)蛋白亞基編碼基因拼接后克隆于表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)得到 鏈霉親和素和別藻藍(lán)蛋白亞基的融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒 光蛋白，其特征在于所述的蛋白質(zhì)的序列為鏈霉親和素標(biāo)記的ApcA為序列6、鏈霉親和 素標(biāo)記的ApcA2為序列7、鏈霉親和素標(biāo)記的ApcB為序列8、鏈霉親和素標(biāo)記的ApcD為序 列9、鏈霉親和素標(biāo)記的ApcF為序列10。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白 亞基類熒光蛋白，其特征在于鏈霉親和素在別藻藍(lán)蛋白亞基的N端，但是不限于在N端。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白 亞基類熒光蛋白，其特征在于所述的結(jié)合藻紅膽素PEB是指藻紅膽素PEB通過硫醚鍵結(jié)合 在鏈霉親和素標(biāo)記的ApcA的257位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A亞基的81位，鏈霉親和素 標(biāo)記的ApcA2的257位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白A2亞基的81位，鏈霉親和素標(biāo)記的ApcB 的258位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋白B亞基的82位，鏈霉親和素標(biāo)記的ApcD的257位，相當(dāng) 于原始別藻藍(lán)蛋白D亞基的81位，鏈霉親和素標(biāo)記的ApcF的258位，相當(dāng)于原始別藻藍(lán)蛋 白F亞基的82位。
9. 結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白的應(yīng)用，其特征在于利用鏈霉親 和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白檢測可溶性抗原或抗體的免 疫檢測。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白的應(yīng)用，其 特征在于所述的免疫檢測包括以下步驟(1) 將可與固相結(jié)合并能識別抗原的第一抗體包被固相上，封閉液封閉未結(jié)合抗體部 分，備用；(2) 將待測抗原、識別抗原的第二抗體、識別第二抗體的標(biāo)記生物素的抗抗體、標(biāo)記鏈 霉素親和素的熒光藻膽蛋白按一定步驟加入固相中，充分反應(yīng)；(3) 利用微孔板熒光檢測儀或其它相應(yīng)的儀器檢測熒光，分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種結(jié)合藻紅膽素PEB的別藻藍(lán)蛋白亞基類熒光蛋白及其與鏈霉親和素形成的融合蛋白，其序列為序列1至序列10；并公開了融合鏈霉親和素的熒光蛋白直接用于熒光免疫檢測的方法；別藻藍(lán)蛋白亞基保守的半胱氨酸殘基可以通過硫醚鍵結(jié)合藻紅膽素PEB，通過基因工程利用大腸桿菌制備得到熒光別藻藍(lán)蛋白的亞基，這類蛋白的光譜性質(zhì)由于帶有His-tag標(biāo)記，不僅便于提純，還有助于改善其溶解性，與鏈霉親和素形成融合蛋白，可以直接用于免疫熒光檢測，有利于其在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/52GK101759790SQ20081021966
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者佟順剛, 夏坤 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司