專利名稱：：人類免疫缺陷病毒(hiv)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是涉及生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測的免疫層析試劑盒。技術(shù)背景獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmunodeficiencysyndrome。AIDS)簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,證)感染引起的一種嚴(yán)重傳染病。自美國1981年診斷出首例艾滋病患者以來，據(jù)最新的WHO數(shù)據(jù)評估，至2007年底，全球估計共有3300萬艾滋病病毒感染者，中國國內(nèi)有艾滋病病毒感染者約70萬。艾滋病病毒的傳播途徑主要包括血液傳播、性接觸、毒品注射和母嬰傳播。在人體內(nèi)的潛伏期平均為710年。HIV感染潛伏期病人沒有明顯的臨床癥狀，但具有高度的傳染性。對HIV進行檢測以發(fā)現(xiàn)傳染源和切斷傳播途經(jīng)是防制AIDS最有效的手段。HIV免疫學(xué)檢測是最有效和最廣泛使用的方法，HIV抗體篩査是我國法定的的四個血源性篩査項目之一。HIV抗體檢測最常用的試劑為HIV抗體酶聯(lián)免疫試劑(ELISA)和膠體金類試劑，采用雙抗原夾心法的第三代HIV抗體診斷試劑盒，靈敏度達到99%以上，特異性大于97%。最短在HIV感染后十余天即可檢測出陽性。但由于部分HIV感染在5-8個月才出現(xiàn)抗體，世界衛(wèi)生組織(WHO)將HIV感染的窗口期定為6個月。HIV在窗口期內(nèi)已具有傳染性，為了進一步減少窗口期傳染情況的發(fā)生，目前國際上已出現(xiàn)了第四代HIV診斷試劑盒，試劑盒采用了HIV抗體和HIVp24抗原同時檢測的方法，能較HIV感染后抗體轉(zhuǎn)陽前4一7天檢測HIV的感染。HIV感染后，最早出現(xiàn)的是p24抗原，然后才出現(xiàn)相應(yīng)的特異性抗HIV抗體，隨抗體滴度的升高p24逐漸下降至檢測不出。在病情發(fā)展后期p24抗原在血中又可檢測出，另外P24抗原的檢測適合對嬰兒HIV感染的診斷。到目前為止HIV抗原抗體聯(lián)合檢測主要應(yīng)用于ELISA試劑盒，尚無抗原抗體聯(lián)合檢測的免疫層析膠體金類試劑盒出現(xiàn)。徐克沂等雖然發(fā)表了"同時檢測HIV抗體及p24抗原快速診斷試劑的研制"[徐克沂，張永新，王瑛等，同時檢測HIV抗體及p24抗原快速診斷試劑的研制，中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2002,16(4)377-279]，但采用并非免疫層析方法，實際方法和ELISA的檢測方法類似，整個檢測過程分為多步，檢測時間超過l小時，不符合快速診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)。膠體金類試劑的檢測原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對抗原或抗體，檢測時當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見的檢測(T)線，通過檢測線的有無實現(xiàn)對結(jié)果的判定。HIV膠體金類免疫層析快速診斷試劑具有ELISA不具備的優(yōu)勢檢測快速5-30分鐘即出結(jié)果，操作簡便，適于現(xiàn)場檢測，試劑的穩(wěn)定性好。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種操作簡便、快速、適合現(xiàn)場檢測、靈敏度和特異性高、適合于臨床診斷或篩查用的HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測免疫層析試劑盒。技術(shù)方案如下一種人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，包括盒蓋、盒底，其特征在于在盒蓋19的前面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24,在B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)各設(shè)置一個箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25，在加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25的右側(cè)各設(shè)置一個A加樣孔20,B加樣孔21;在盒底31左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋D，在盒底31右側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋C，試紙A9的上樣墊1對應(yīng)A加樣孔20的位置裝入盒底31的組合支撐肋C、組合支撐肋D上，將試紙B10的上樣墊(14)對應(yīng)B加樣孔(23)的位置裝入盒底(31)的組合支撐肋C、組合支撐肋D上，盒蓋19上的所有凸柱27插入盒底31上的凸起孔35中，即為HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18;還在于所述的試紙A9包括上樣墊1與緊密連接于所述上樣墊1一端的含有標(biāo)記HIV抗原gp41、gp36的膠體金墊2、與所述膠體金墊2的另一端緊密連接的硝酸纖維素NC膜3和緊密連接于所述NC膜3另一端的吸樣墊4，所述NC膜包被有相互分離的檢測線5、6和質(zhì)控線7，所述檢測線為包被在NC膜上的HIVgp41、gp36抗原，所述質(zhì)控線為包被在NC膜上的抗HIV抗原的抗體，所述上樣墊1、膠體金墊2、NC膜2和吸樣墊4粘貼到塑料支撐板8上形成試紙A9;試紙B(IO)和試紙A綿構(gòu)基本相同，但膠體金墊15為抗HIVp24抗體，檢測線13為抗HIVp24抗'體，質(zhì)控線12為抗鼠IgG抗體。試劑盒的上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。試劑盒試紙A抗原的包被方法為以0.01MpH9.0碳酸鹽緩沖液(CBS)分別將gp41、gp36抗原配制成lmg/ml、0.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)分別劃線，包被T1，T2線，同時在NC膜上部包被抗HIV抗體作為C線。試紙B包被方法為以0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗p24抗體配制成1.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)劃線，包被T3線，同時在NC膜上部包被鼠IgG抗體作為C線。劃線后將NC膜在干燥間，溫度20-25'C，濕度小于30%，干燥8-10小時，備用。制備標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30—50mn的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2M1(20)3調(diào)至pH9.0，按100ml膠體金溶液分別加入lmg抗原或抗體，室溫攪拌l小時，加入1柳SA，0.1%PEG20000，封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間(溫度20-25°C，濕度小于30%)干燥2-4小時，制成膠體金墊，備用。試紙條的裝配方法為在干燥室內(nèi)(溫度20-25°C，濕度小于30%)，取塑料支撐板板，將己包被的NC膜放置在塑料支撐板板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);試紙A和試紙B的區(qū)別為試紙A所用的膠體金墊標(biāo)記的為HIVgp41、gp36抗原，NC膜包被的為HIVgp41、gp36抗原，試紙B用的膠體金墊標(biāo)記的為抗HIVp24抗體，NC膜包被的為抗HIVp24抗體。最后用裁剪機將貼好塑料板切成3mm寬的試紙條。切好的試紙A和試紙B平行裝入塑料盒，形成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒。試劑盒的檢測方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試劑盒平放,由加樣孔在試紙A和試紙B上樣墊上分別加入50—100nl被檢樣品，樣品溶解膠體金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在30分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。若試紙A出現(xiàn)T線，說明樣品中含有抗HIV抗體，若試紙B出現(xiàn)T線，說明樣品中含有HIVp24抗原。若T線不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低于試劑盒的最低檢測限。人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18是由盒蓋19、盒底31構(gòu)成，盒蓋19、盒底31均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋19、盒底31均是兩個長方形盒狀體。'盒蓋19的長、寬、高以試紙A9、試紙B10的長、寬、高配合設(shè)置，在盒蓋19的前面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的長方形孔為B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24，在B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)各設(shè)置一個箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25，在加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25的右側(cè)各設(shè)置一個圓形孔為A加樣孔20，B加樣孔21;在盒蓋19的后面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24左側(cè)邊緣各設(shè)置兩個同樣大小的凸柱28、凸柱29，在B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)縱向各設(shè)置兩條同樣長、寬、高的凸起為肋26、肋30，在盒蓋19的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個凸柱27，凸柱27高比凸柱28、凸柱29的高度要高。在盒底31左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋D，組合支撐肋D是由類似"["形狀的凸起肋36，在凸起肋36兩側(cè)外邊緣橫向，向右各設(shè)置一個凸起肋37，在凸起肋37里邊緣向右設(shè)置一向右各設(shè)置一"]"形狀的凸起肋39，在凸起肋39右側(cè)縱向各設(shè)置兩個同樣大小的凸起肋40;在盒底31右側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋C，組合支撐肋C是由類似"["形狀的凸起肋32,凸起肋32的高度是由左向右逐漸降低形成的，在凸起肋32里側(cè)內(nèi)縱向設(shè)置兩個同樣大小的兩個凸起肋33，個凸起肋32右側(cè)外邊緣設(shè)置一個"]"形狀的凸起肋34，在盒底31的邊緣有間隔地設(shè)置多個凸柱27，凸柱27高比凸柱28、凸柱29的高度要高的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個凸起孔35，以便與在盒蓋19的上的凸柱27配合連接。本發(fā)明的有益效果如下采用HIV抗體和抗原聯(lián)合檢測，使目前的HIV膠體金類診斷試劑由第三代進入第四代，能提高HIV的檢出率，縮短HIV檢測的窗口期，達到和第四代HIVELISA診斷試劑盒類似的效果，同時保持膠體金試劑適于現(xiàn)場檢測，5-30分鐘即出結(jié)果，操作簡單，試劑的穩(wěn)定性好等特點。本試劑盒采用了試紙A和試紙B裝入同一個塑料盒中，分別檢測HIV的抗體和抗原。雖然采用了兩條試紙，但檢測時只需要直接加入被檢樣品，并不增加檢測的步驟和復(fù)雜性。而采用兩條試紙，極大地減少了產(chǎn)品研制的復(fù)雜性試紙A用于HIV抗體的檢測在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上不用作任何的改變[李洲，人類免疫缺陷病毒(HIV)l+2型抗體三條線快速檢測板，中國專利(公開)號CN2501049]。單獨研制出HIVP24抗原檢測試紙就可以實現(xiàn)同時對HIV抗體和抗原的聯(lián)合檢測。而在ELISA試劑盒中，由于要將HIV抗原和抗體包被在同一個酶標(biāo)板孔中，常常引起產(chǎn)品的靈敏度的明顯下降，需要改變各自的工藝，增加了產(chǎn)品制造的難度，到目前為止，同時檢測HIV抗體和抗原的ELISA試劑的靈敏度都低于相應(yīng)的單獨檢測試劑。圖1試紙A結(jié)構(gòu)示意圖。圖2試紙B結(jié)構(gòu)示意圖。圖3HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒蓋主視圖。圖4HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒蓋后視圖。圖5HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒底俯視圖。附圖符號說明1:上樣墊2:膠體金墊3:NC膜4:吸樣墊5:gp41檢測線6:gp36檢測線7:質(zhì)控線(C)8:塑料支撐板9:試紙A10:試紙B11:吸樣墊12:質(zhì)控線(C)13:P24檢測線(T3)14:上樣墊15膠體金墊16:NC膜17:塑料支撐板18:試劑盒19:品20:A加樣孔21:B加樣孔22:加樣標(biāo)示23:B反應(yīng)區(qū)孔24:A反應(yīng)區(qū)孔25:加樣標(biāo)示26:肋27:凸柱28:凸柱29:凸柱30:肋31:盒底32:凸起肋33:凸起肋34:凸起肋35:凸柱36:凸起肋37:凸起肋38:凸起肋39:凸起肋40:凸起肋C:組合支撐肋D:組合支撐肋具體實施方式實施例lHIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測檢測試紙A9、試紙B10的制備1主要材料l,l重組抗原HIVgp41、gp36:美國BiotechAtlanticInc(BAI.)產(chǎn)品，用于試紙A的包被和標(biāo)記；抗HIVP24抗體配對BAI公司產(chǎn)品，用于試紙B的包被和標(biāo)記；氯金酸Sigma公司產(chǎn)品，NC膜Millipore公司產(chǎn)品；BSA，PEG20000，水解酪蛋白Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純試劑。1.2HIV抗體國家參考品(膠體金類)中國藥品生物制品檢定所檢研制。包括20份陽性血清，20份陰性血清，3份靈敏度血清，l份精密度血清。HIV1P24抗原國家參考品，包括括10份陽性血清，20份陰性血清，10份靈敏度血清，2份精密度血清。2方法2.1HIV抗原、抗體的膠體金標(biāo)記氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取3份膠體金溶液，用分別用0.2MK2C03將溶液調(diào)到pH7.0、pH8.0和pH9.0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每100ml溶液加入0.5mg、lmg、1.5mg將重組抗原或抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌l小時，再滴加入到終濃度為0.1%的PEG2000和W的BSA封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液(Tris緩沖液，含BSA、水解酪蛋白，蔗糖和表面活性劑)中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按lml溶液鋪22cm2的比例加樣于無紡布上，在干燥間(溫度20-25°C，濕度小于30%)干燥2-4小時，制成膠體金墊，干燥備用。2.2HIV抗原與抗體的包被在試紙A中，以0.01MpH9.0的CBS分別將gp41、gp36抗原配制成0.5mg/ml、lmg/ml、1.5mg/ml的溶液,用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)分別劃線，包被T1，T2線，同時在NC膜上部包被抗HIV抗體作為C線。試紙B包被方法為以0.01MpH7.2PBS將抗P24抗體配制成0.5mg/ml、lmg/ml、1.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)劃線，包被T3線，同時在NC膜上部包被抗鼠IgG抗體作為C線。劃線后將NC膜在干燥間(溫度20-25°C，濕度小于30%)干燥8-IO小時，備用。2.3HIV快速診斷試紙條的組裝在干燥室內(nèi)(溫度20-25°C，濕度小于30%)，取塑料支撐板板，將己包被的NC膜放置在塑料支撐板板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10);試紙A和試紙B的區(qū)別為試紙A所用的膠體金墊標(biāo)記的為HIVgp41、gp36抗原，NC膜包被的為HIVgp41、gp36抗原，試紙B用的膠體金墊標(biāo)記的為抗HIVp24抗體，NC膜包被的為抗HIVp24抗體。然后用裁剪機將貼好塑料板切成3mm寬的試紙條。切好的試紙A和試紙B平行裝入塑料盒，形成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒。2.4檢測方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑盒平放，檢測時，在試紙A和B上樣墊上分別加入50—100ul被檢樣品，若樣品中含抗H工V抗體、P24抗原，則和樣品墊上的標(biāo)記的膠體金結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴散到NC膜上進一步層析，當(dāng)遇到包被在NC膜上T線處的配對抗原、P24抗體時，復(fù)合物則又和包被抗原、P24抗體結(jié)合，被捕獲在包被處，當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達到一定數(shù)量時，則形成肉眼可見的T線。若試紙A出現(xiàn)T線，說明樣品中含有抗HIV抗體，若試紙B出現(xiàn)T線，說明樣品中含有HIVp24抗原。若T線不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低于試劑盒的最低檢測限。C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽性和陰性樣品檢測時均會出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在15、20、30和45分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果。2.5反應(yīng)體系工藝評價方法不同參數(shù)制備的試劑研制小樣后，以HIV抗體國家參考品(膠體金類)、HIV1P24抗原國家參考品為質(zhì)控，進行檢測，確定最佳的產(chǎn)品反應(yīng)體系和工藝路線。3結(jié)果根據(jù)小樣的檢測結(jié)果，確定了試紙的最佳標(biāo)記HIV抗原、抗體pH值為為9.0;最佳標(biāo)記量均為lmg每100ml膠體金溶液；最佳的膠體工作液為50mMTris緩沖液，pH9.0，含0.5%BSA、1%的水解酪蛋白、2%蔗糖和0.2%Tween20;最佳的gp41抗原包被濃度為lmg/ml，gp36抗原包被濃度為0.5mg/ml，P24抗體包被濃度為1.5mg/ml。檢測結(jié)果的最佳判定時間為在5-30分鐘內(nèi)判定。實施例2:HIV抗體抗原聯(lián)合快速診斷試劑盒的性能分析1主要材料1.1HIV抗體抗原聯(lián)合快速診斷試劑盒制備方法見實施例一；1.2HIV抗體、抗原國家參考品中國藥品生物制品檢定所檢研制，說明見實施例一；1.3含干擾物血清包括常見干擾物高血脂、溶血、黃疸血清各10份，含相關(guān)傳染病HAV、HBV、HIV、TP和HP抗體陽性血清各IO份，含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿各10份，由本公司在天津地區(qū)相關(guān)醫(yī)院收集驗證并保存，以上血清或血漿經(jīng)兩種以上ELISA檢測均為HIV抗體和抗原陰性血清。1.4臨床血清HIV陽性血清600份，由公司在天津地區(qū)相關(guān)醫(yī)院收集，為門診采集檢驗用血清，經(jīng)兩種以上ELISA檢測均為HIV抗體和抗原陰性血清。HIV陽性血清20份，由公司在相關(guān)AIDS?？漆t(yī)院獲得，確證為HIV抗體陽性血清，己滅活。2方法2.1樣品檢測方法見實施例一，在30分鐘內(nèi)判定檢測結(jié)果。2.2HIV抗體國家參考品(膠體金類)檢測取出HIV抗體國家參考品(膠體金類)血清盤，平衡到室溫后用本試紙進行檢測。2.3HIV1P24抗原國家參考品的檢測取出國家參考品血清盤，平衡到室溫后用本試紙進行檢測。2.4分析特異性評估用試紙對公司保存的含干擾物樣品進行檢測。2.5穩(wěn)定性試驗將本試紙在室溫條件下保存，在l、3、6、12、18個月取出部分試紙，以國家參考品進行測試；將本試紙置于37'C、5(TC條件下，每隔7天取出部試紙，以國家參考品進行測試。2.6臨床樣品評估由企業(yè)從相關(guān)醫(yī)院收集臨床血清，用本試劑盒進行檢領(lǐng)U，若遇到檢測陽性樣品，再以兩種以上商用ELISA試劑進行檢測，以確證結(jié)果。3結(jié)果3.1HIV抗體國家參考品(膠體金類)檢測對國家參考品(膠體金類)血清盤進行測試，結(jié)果和預(yù)期完全一致(表l),通過國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。表l本試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.2HIV1P24抗原國家參考品檢測檢測結(jié)果表明能通過國家參考品陰性和陽性參考品的檢測，P24抗原檢測靈敏度至10U/ml(表2)。表2本試劑盒對HIV1P24國家參考品的測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3.3分析特異性評估檢測結(jié)果表明本試紙對常見干擾物高血脂、溶血、黃疸血清檢測均為陰性，對含相關(guān)傳染病HAV、HBV、HIV、TP和HP杌懷陽性血清檢測均為陰性，對含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿檢測均為陰性。說明對以上物質(zhì)沒有非特異性反應(yīng)。3.4穩(wěn)定性分析本試紙在室溫條件下保存，用國家參考品進行測試；1、3、6、12個月檢測均能通過測試，結(jié)果無顯著性差異。37"C條件下加速破壞性試驗，共檢測到6周，5(TC條件下加速破壞性試驗，共檢測到3周，均能通過測試，試紙性能無顯著下降。根據(jù)加速破壞試驗結(jié)果，試紙的穩(wěn)定性在室溫條件下應(yīng)該在18個月以上。3.5臨床樣品試驗共檢測了企業(yè)收集的臨床樣品600份，本試劑共檢測出陽性8份，經(jīng)ELISA試劑復(fù)檢為陰性。特異性=592/600二98.7%。20份陽性血清檢測均為陽性，靈敏度為=20/20二100實施例3:制備HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18:圖3HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒蓋主視圖。圖4HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒蓋后視圖。圖5HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒底俯視圖。如圖3、圖4、圖5所示，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18是由盒蓋19、盒底31構(gòu)成，盒蓋19、盒底31均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋19、盒底31均是兩個長方形盒狀體。盒蓋19的長、寬、高以試紙A9、試紙B10的長、寬、高配合設(shè)置，在盒蓋19的前面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的長方形孔為B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24，在B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)各設(shè)置一個箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25，在加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25的右側(cè)各設(shè)置一個圓形孔為A加樣孔20，B加樣孔21;在盒蓋19的后面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24左側(cè)邊緣各設(shè)置兩個同樣大小的凸柱28、凸柱29，在B反應(yīng)區(qū)孔23、A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)縱向各設(shè)置兩條同樣長、寬、高的凸起為肋26、肋30，在盒蓋19的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個凸柱27，凸柱27高比凸柱28、凸柱29的高度要高。在盒底31左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋D，組合支撐肋D是由類似"["形狀的凸起肋36，在凸起肋36兩側(cè)外邊緣橫向，向右各設(shè)置一個凸起肋37，在凸起肋37里邊緣向右設(shè)置一向右各設(shè)置一"]"形狀的凸起肋39，在凸起肋39右側(cè)縱向各設(shè)置兩個同樣大小的凸起肋40;在盒底31右側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋C，組合支撐肋C是由類似"["形狀的凸起肋32，凸起肋32的高度是由左向右逐漸降低形成的，在凸起肋32里側(cè)內(nèi)縱向設(shè)置兩個同樣大小的兩個凸起肋33，個凸起肋32右側(cè)外邊緣設(shè)置一個"]"形狀的凸起肋34，在盒底31的邊緣有間隔地設(shè)置多個凸柱27，凸柱27高比凸柱28、凸柱29的高度要高的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個凸起孔35,以便與在盒蓋19的上的凸柱27配合連接。本實用新型試劑盒的組裝方法將試紙A9的上樣墊1對應(yīng)A加樣孔20的位置裝入盒底31的組合支撐肋C、組合支撐肋D上，將試紙B10的上樣墊14對應(yīng)B加樣孔23的位置裝入盒底31的組合支撐肋C、組合支撐肋D上，然后將盒蓋19上的所有凸柱27插入盒底31上的凸起孔35中，即為完成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18的組裝。權(quán)利要求1.一種人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，包括盒蓋、盒底，其特征在于在盒蓋(19)的前面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)，在B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)的右側(cè)各設(shè)置一個箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)，在加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)的右側(cè)各設(shè)置一個A加樣孔(20)，B加樣孔(21)；在盒底(31)左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋(D)，在盒底(31)右側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋(C)，試紙A(9)的上樣墊(1)對應(yīng)A加樣孔(20)的位置裝入盒底(31)的組合支撐肋(C)、組合支撐肋(D)上，將試紙B(10)的上樣墊(14)對應(yīng)B加樣孔(23)的位置裝入盒底(31)的組合支撐肋(C)、組合支撐肋(D)上，盒蓋(19)上的所有凸柱(27)插入盒底(31)上的凸起孔(35)中，即為HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒(18)；還在于所述的試紙A(9)包括上樣墊(1)與緊密連接于所述上樣墊(1)一端的含有標(biāo)記HIV抗原gp41、gp36的膠體金墊(2)、與所述膠體金墊(2)的另一端緊密連接的硝酸纖維素NC膜(3)和緊密連接于所述NC膜(3)另一端的吸樣墊(4)，所述NC膜包被有相互分離的檢測線(5)、(6)和質(zhì)控線(7)，所述檢測線為包被在NC膜上的HIVgp41、gp36抗原，所述質(zhì)控線為包被在NC膜上的抗HIV抗原的抗體，所述上樣墊(1)、膠體金墊(2)、NC膜(2)和吸樣墊(4)粘貼到塑料支撐板(8)上形成試紙A(9)；試紙B(10)和試紙A結(jié)構(gòu)基本相同，但膠體金墊(15)為抗HIVp24抗體，檢測線(13)為配對的抗HIVp24抗體，質(zhì)控線(12)為抗鼠IgG抗體。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于，試紙A(10)標(biāo)記和包被用抗原為重組表達HlV抗原gp41、gp36，亦可再增加或替換為HIV其它特異性抗原gpl60、gpl20、P24及0亞型gp41等，試紙B標(biāo)記和包被用抗體為抗HIVp24抗體。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于所述的上樣墊(l)(14)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊(4)(ll)由吸水濾紙構(gòu)成。4、根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于，試紙A抗原的包被方法為以0.01MpH9.0碳酸鹽緩沖液(CBS)分別將gp41、gp36抗原配制成lmg/ml、0.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)分別劃線，包被T1、T2線，分別用于檢測gp41、gp36抗體。同時在NC膜上部包被抗HIV抗體作為C線。試紙B包被方法為以0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗P24抗體配制成1.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)劃線，包被T3線，同時在NC膜上部包被鼠IgG抗體作為C線。劃線后將NC膜在干燥間溫度20-25°C，濕度小于30%干燥8-10小時。5、根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于，制備標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30—50nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2MK2C(U周至pH9.0，按100ml膠體金溶液分別加入lmg抗原或抗體，室溫攪拌l小時，加入1%(牛血清白蛋白)BSA，0.ly。PEG(聚乙二醇)20000，封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪22cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間，溫度20-25°C，濕度小于30%，干燥2-4小時，制成膠體金墊。6、根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于，試紙A(9)、試紙B(10)的裝配方法為在干燥室內(nèi)溫度20-25-C，濕度小于30%，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊，搭膠體金墊的l/3粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的l/5;在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10;然后用裁剪機將貼好塑料板切成3mm寬的試紙條，切好的試紙A(9)、試紙B(10)平行裝入塑料盒，形成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒(18)。7、根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于，檢測方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試劑盒平放，通過加樣孔在試紙A和試紙B上樣墊上分別加入50—100ul被檢樣品，樣品將溶解膠體金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在30分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測結(jié)果；若試紙A出現(xiàn)T線，說明樣品中含有抗HIV抗體，若試紙B出現(xiàn)T線，說明樣品中含有HIVp24抗原，若T線不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或低于試劑盒的最低檢測限。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒(18)的盒蓋(11)、盒底(20)均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋(11)、盒底(20)均是兩個上角為圓弧形狀的長條形狀且其下邊中部設(shè)置向上的方形凹陷；人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒(18)是由盒蓋(19)、盒底(31)構(gòu)成，盒蓋(19)、盒底(31)均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋(19)、盒底(31均是兩個長方形盒狀體。盒蓋(19)的長、寬、高以試紙A(9)、試紙B(10)的長、寬、高配合設(shè)置，在盒蓋(19)的前面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的長方形孔為B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)，在B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)的右側(cè)各設(shè)置一個箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)，在加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)的右側(cè)各設(shè)置一個圓形孔為A加樣孔(20)，B加樣孔(21);在盒蓋(19)的后面左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)左側(cè)邊緣各設(shè)置兩個同樣大小的凸柱(28)、凸柱(29)，在B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)的右側(cè)縱向各設(shè)置兩條同樣長、寬、高的凸起為肋(26)、肋(30)，在盒蓋(19)的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個凸柱(27)，凸柱(27)高比凸柱(28)、凸柱(29)的高度要高。在盒底(31)左側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋(D)，組合支撐肋(D)是由類似"["形狀的凸起肋(36)，在凸起肋(36)兩側(cè)外邊緣橫向，向右各設(shè)置一個凸起肋(37)，在凸起肋(37)里邊緣向右設(shè)置一向右各設(shè)置一"]"形狀的凸起肋(39)，在凸起肋(39)右側(cè)縱向各設(shè)置兩個同樣大小的凸起肋(40);在盒底(31)右側(cè)設(shè)置兩個同樣大小的組合支撐肋(C)，組合支撐肋(C)是由類似"["形狀的凸起肋(32)，凸起肋(32)的高度是由左向右逐漸降低形成的，在凸起肋(32)里側(cè)內(nèi)縱向設(shè)置兩個同樣大小的兩個凸起肋(33)，個凸起肋(32)右側(cè)外邊緣設(shè)置一個"]"形狀的凸起肋(34)，在盒底(31)的邊緣有間隔地設(shè)置多個凸柱(27)，凸柱(27)高比凸柱(28)、凸柱(29)的高度要高的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個凸起孔(35)，以便與在盒蓋(19)的上的凸柱(27)配合連接。全文摘要本發(fā)明是涉及生物應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測的免疫層析試劑盒。試劑盒由兩條獨立的試紙A、B和存放試紙的塑料盒C組成，試紙A用于檢測HIV抗體。試紙B用于檢測HIVp24抗原。將試紙A和試紙B平行裝入塑料盒中組成試劑盒。檢測時將被檢樣品加在試紙條的上樣墊上，然后直接觀察免疫反應(yīng)結(jié)果，實現(xiàn)檢測。本試劑盒用于HIV感染的篩查或臨床診斷，同時檢測HIV抗體和抗原，較單純的抗體檢測能有效縮短HIV檢測的窗口期，具有反應(yīng)快速、操作簡便、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。文檔編號G01N33/569GK101266246SQ20081005296公開日2008年9月17日申請日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日發(fā)明者洲李,楊發(fā)青申請人:天津中新科炬生物制藥有限公司