專利名稱：檢測和治療人類免疫缺陷病毒的方法和物質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說是涉及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的診斷和治療所用的方法和物質(zhì)，更具體地說，本發(fā)明涉及具有免疫活性的多肽，最好是抗體或抗體片段，尤其是單克隆抗體，它們對人類淋巴細胞T4蛋白的基因型抗體具有活性，并且以可供體內(nèi)和體外中和HIV感染的方式與HIV的病毒粒子起反應(yīng)。此外，本發(fā)明還涉及在疫苗組合物中有用的免疫活性多肽，該疫苗組合物對HIV的感染產(chǎn)生保護性應(yīng)答。
下述文獻對人類愛滋病病因的流行病學(xué)和免疫學(xué)方面的已有技術(shù)作了很好的總結(jié)Laurence，“The Immune System in AIDS”，1985年12月的Scientific Ameri Can第84-93頁;Gallo，“The First Human RetroVirus”1986年12月的Scientific American第88-98頁;Gallo，“The AIDS Virus”1987年1月的Scientific AmeriCan第47-56頁;Levy等人1984年225期Science 840-842頁;“Mobilizing Against AIDS”，Institute of Medicine，National Academy of Sciences，Harvard University Press(Cambridge，Mass.1986);以及Lane等人1985年第3期Ann.Rev.Immunol.第477-500頁。在HIV感染中人類T淋巴細胞的T4表面糖蛋白(有時稱為“CD4蛋白或決定子)的作用已被廣泛地研究，如Dalgleish等人1984年312期Nature763-767;Klatzman等人1986年312期Science767-768頁;Klatzman等人1984年第225期Science59-62頁;MCDougal等人1985年第135期J.Immunol.3151-3162頁;以及Maddon等人1986年Cell第47期338-348頁。還可參見Marrack等人“TheTCellanditsReceptor”1986年2月SCientificAmerican36-45頁;以及McDougal等人1986年Science第231期382-385頁。
近來，可溶形式的CD4在治療HIV感染中可能具有治療實用性已在具體化，見Fisher等人1988年Nature第331期76-77頁;Hussey等人，Ibid，78-81頁;Deen等人，Ibid，82-83頁;以及Traunecker等人，Ibid，84-86頁，所有這些都涉及用可溶性CD4在體外中和HIV感染。計劃使用可溶性CD4治療劑的潛在缺點是CD4與存在于其它免疫細胞，包括B細胞、巨噬細胞、單核白細胞表面的Ⅱ級主要組織相容性復(fù)合物(“MHC”)分子的已知反應(yīng)性，這意味著將CD4用于治療之前可能需要修飾(例如，通過截斷)。
文獻中已有許多報道涉及抗體在體內(nèi)和體外中和HIV感染的能力，特別是涉及為了形成保護性免疫而進行的活性免疫的嘗試。參見Matthews等人1986年P(guān)roc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)83期9709-9713頁;Norman，“AIDSTherapyANewPushForClinicalTrials”，1985年Science230期1355-1358頁以及這一系列以前的文章;Newmark，1986年Nature324期304-305頁;以及出現(xiàn)在1987年2月ScientificAmerican86-88頁在標(biāo)題“AIDSHoPe……AndWarnings”下的注釋，以及在1986年12月18日NewScientist中在標(biāo)題“CanproteinTThwarttheAIDSVirus……？”下的注釋。還可參見Mitsuya等人，1987年Nature325期773-778頁;Kennedy等人1986年Science231期1556-1559頁;Chanh等人1986年EMBO.Journal第5(11)期3065-3071頁;Chanh等人1986年Eur.J.Immunol.16期1465-1468頁;Putney等人1986年Science234期1392-1395頁;以及Matshushita等人1987年6月1-5日的“ⅢInternationalConferenceonAcquiredImmunodeficiencySyndrome(AIDS)”106頁的文獻W.3.2。
已公開的抗-基因型免疫作用研究的結(jié)果是本發(fā)明的重要背景技術(shù)。參見Kennedy等人“Anti-IdiotypeandImmunity”1986年7月ScientificAmerican48-56頁;Jerne，“TheImmuneSystem”，1973年7月ScientificAmerical52-60頁;Marx，“MakingAntibodiesWithoutTheAntigens”，1985年Science228期162-165頁;Finberg等人1987年CRCCritiCalReviewsinImmunology第7期269-284頁;以及Kennedy等人1986年ScienCe232期220-223頁。還參見Norman，Supra有關(guān)抗-HIV-免疫治療和產(chǎn)生對HIV表面蛋白的抗基因型抗體之間潛在的相關(guān)性。
本發(fā)明的特別有意義的背景技術(shù)是MCDougal等人1986年J.Immunology 137期2937-2944頁所報道的工作，其中指出“……產(chǎn)生抗四種候選CD4單克隆抗體〔OKT4A，OKT4D，OKT4F和Leu3a(有時稱為“抗-Leu3a”)〕的家兔抗-基因型血漿不與(HIV)病毒反應(yīng)或者不能抑制病毒接合到CD4+T細胞上。這一報道應(yīng)與Ronald C.Kennedy 1987年3月1-4日在舊金山的第7次DNA/雜化體年度會議(the 7 th Annual DNA/Hybridoma Congress)上的報告(報道在1987年Bio/Technology第5期第421-422頁)以及1987年6月1-5日在華盛頓的第三屆獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)國際會議上的報告(見文獻TH.9.5，并報道在1987年6月11日New Scientist第26頁)相比較。這些報告指出了對抗抗-T4抗體的多克隆抗血清的發(fā)展以及這樣的抗血清識別HIV和在體外部分中和HIV感染的能力。后一個報告還提到了單克隆抗-基因型抗體的制備方法，這一發(fā)展在Chanh等人1987年6月Proc.Nat′l.Acad.sci.(USA)第84期第3891-3859頁也作了介紹。
在該技術(shù)里，確實需要能用于診斷生物體液和組織樣本中存在的HIV粒子和HIV感染細胞的新方法和材料，并需要對體內(nèi)中和HIV感染的新手段和發(fā)展能賦予抗HIV感染的免疫性保護的疫苗接種程序。
本發(fā)明提供了經(jīng)純化和分離的免疫活性多肽，較好的是抗體或嵌合體或它們的片段，最好是單克隆抗體，它們對人類淋巴細胞T4蛋白的基因型抗體(最好是單克隆抗體)具有活性。本發(fā)明的這些產(chǎn)品具有與HIV病毒粒子的那部分進行特異性免疫結(jié)合的能力，那部分是指在HIV感染諸如人類T淋巴細胞和人類神經(jīng)系統(tǒng)細胞這樣的宿主細胞時必然與T4表面蛋白相互作用的部分。本發(fā)明這些產(chǎn)品的特征尤其在于它們的菌株在體外具有中和HIV感染的獨特能力，在于與具有大約從60000在80000分子量(由SDS-PAGE測定)的HIV蛋白的特異反應(yīng)性以及它們對與人類免疫細胞表面有關(guān)的第Ⅱ級主要組織相容性分子的不反應(yīng)性。
因此，本發(fā)明的一個實例中，免疫活性產(chǎn)品是通過與HIV粒子及HIV感染細胞表面特異結(jié)合“應(yīng)答”而生成的，即使它們的生成對這些表面蛋白沒有直接免疫學(xué)關(guān)系。
本發(fā)明提純和分離的多肽特別適用于對生物體液中HIV的檢測和定量的分析過程，該檢測過程以HIV粒子和本發(fā)明反應(yīng)性多肽(例如抗體)之間的免疫結(jié)合為基礎(chǔ)。而且，本發(fā)明形成的抗體、嵌合抗體和它們的片段是選擇性地與HIV感染細胞的表面起免疫反應(yīng)的，于是提供了用于在體液和組織樣本中檢測HIV感染細胞以及從包括感染與非感染細胞二者的細胞群體中分離HIV感染細胞時有用的試劑。因此，本發(fā)明的產(chǎn)品可用于診斷和治療過程，包括分離和/或選擇性地消滅HIV感染細胞。
本發(fā)明提純和分離的免疫活性物質(zhì)也特別適用于對易為HIV感染的動物、特別是人類進行抗HIV治療。按這樣的一種方法，給已經(jīng)感染了HIV的病人或處在HIV感染危險中的病人施用免疫有效量的例如本發(fā)明的單克隆抗體以產(chǎn)生對HIV感染的被動免疫性。按照另一種辦法，受HIV感染的細胞例如在體外與病人未感染的細胞分離并可將后者送回給病人。
如下詳細陳述中指出，本發(fā)明的與抗體有關(guān)的多肽最好最初形成人淋巴T4糖蛋白(CD4決定子)的單一特異抗體(最好單克隆抗體)，接著制備在該初始形成步驟中形成的抗體的T4基因型區(qū)域的抗體(最好單克隆抗體)。
嵌合抗體和它們的片段，尤其是雙特異抗體也屬于本發(fā)明的產(chǎn)品蛭竊諼⑸鎪拗鰨ɡ繚諗嘌械腦訟赴駝婧松鏘赴┲脅撓肟固逵泄氐牟罰庵炙拗饔鎂哂興瓚嚯牟繁嗦氳腄NA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
作為一個例子，在掌握有關(guān)本發(fā)明抗體的基因型區(qū)域的結(jié)構(gòu)資料時，就可能利用在培養(yǎng)基中的諸如大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞這樣的真核生物細胞來產(chǎn)生有用的抗體片段(如fab′和f(ab′)2片段)。此外，用轉(zhuǎn)化的鼠骨髓瘤細胞或雜化瘤細胞(特別是重鏈缺失突變細胞)作為生產(chǎn)宿主來制備嵌合抗體(例如鼠/人抗體)也在本發(fā)明范圍內(nèi)。人們期望雜化的雜化瘤細胞會產(chǎn)生具有診斷和治療用途的雙特異抗體。也可用重組體方法生產(chǎn)HIV亞群疫苗材料。例如，預(yù)計本發(fā)明的單克隆抗體能極好的適用于在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的小管或原核細胞中篩選出HIV DNA的表達產(chǎn)品，可以分離出編碼了天然產(chǎn)生的免疫有效的HIV蛋白(包括糖蛋白)的全部或部分氨基酸序列的DNA。在適宜的宿主中，存在這樣的DNA可以高水平地生產(chǎn)疫苗物質(zhì)。
在一種優(yōu)選的方案中，本發(fā)明提供了與特征為單克隆的抗-單克隆-抗人淋巴T4抗體的抗體有關(guān)的多肽，最好是單克隆的抗-oKT4和抗-oKT4A抗體，兩者均與60-80kd HIV蛋白有反應(yīng)活性。目前，最好是單克隆的抗-okT4A抗體，它具有很強的在體外中和多種HIV菌株的HIV感染的能力，并參與HIV感染細胞的補體-中介溶胞作用。
在另一個實例中，本發(fā)明第一次提供了對人淋巴T4蛋白的單克隆抗體以抗原/抗體反應(yīng)進行特異免疫反應(yīng)的“抗-基因型”單克隆抗體的雜化細胞系。例如，本發(fā)明提供了新的鼠衍生的雜化細胞系，JT4C8，JT4C12和JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15，它們每一個以在培養(yǎng)基中生長的上清液組份形式產(chǎn)生一種與抗-T4基因型特異反應(yīng)的單克隆抗體，而且這種單克隆抗體以在體內(nèi)和體外中和HIV感染的方式與HIV病毒粒子蛋白反應(yīng)。
雜化細胞系JT4C8于1987年2月18日寄存在美國農(nóng)業(yè)部機構(gòu)美國普通培養(yǎng)物收集中心(Rockville，Maryland)，寄存號為HB9385。雜化細胞系JT4C12在1987年2月18日寄存在上處，寄存號為HB9387。雜化細胞系JT4C16于1987年2月18日寄存在上處，寄存號為HB9386。雜化細胞系JT1-1F3于1987年6月25日寄存在動物細胞培養(yǎng)物歐洲寄存中心ECACC(Salisbury，Wiltshive，U.K)，寄存號為87062501。雜化細胞系JT1-1F3-E5也于1987年6月25日寄存在動物細胞培養(yǎng)物歐洲寄存中心ECACC，寄存號為87062502。雜化細胞系JT1-1D7于1988年1月29日寄存在發(fā)酵研究所(日本Ibaragi-Ken)，寄存號為FERMBP-1685，雜化細胞系JT2-N15于1988年1月29日寄存在日本發(fā)酵研究所，寄存號為FEMBP-1684。
在另外一個實例中，本發(fā)明提供了用眾所周知的親和性純化來生產(chǎn)HIV亞群疫苗物質(zhì)的方法，從而通過用由本發(fā)明抗體制備的選擇性免疫吸附劑分離出HIV的蛋白組份(分子量范圍約為60000至80000，尤其是65000至67000)。
通過下述對本發(fā)明實施例和附圖的詳細說明，對本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將會一目了然，附

圖1、2和3表示本發(fā)明的抗體與HIV和未感染細胞蛋白的免疫試驗結(jié)果;圖4和5提供了與本發(fā)明抗體和HIV蛋白有關(guān)的免疫斑檢測結(jié)果;而圖6A至6E提供了對感染和未感染的細胞使用本發(fā)明抗體的免疫熒光染色檢測的照片結(jié)果。
下列實施例說明本發(fā)明生產(chǎn)的包括JT4C8，JT4C12，JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15的一些雜化細胞系、從中分離出抗-CD4的單克隆抗體，以及這樣的單克隆抗體的擴大及其特征。
更具體地說，實例1涉及到刺激鼠宿主來產(chǎn)生市場上有的抗-T4單克隆抗體、“oKT4”的抗體、脾細胞與骨髓瘤細胞的融合，雜化細胞的篩選、克隆并從中分離出單克隆抗體。實例2涉及用熒光免疫分析法、分析與HIV蛋白反應(yīng)活性的Western斑檢測法以及通過在體外具有中和HIV感染的能力所產(chǎn)生的單克隆抗體的特性。實例3涉及能在生長介質(zhì)中提供市場上有的抗體“oKT4A”的單克隆抗體的雜化細胞系的第一種生成方法。實例4涉及通過免疫熒光分析、Werstern斑檢測、體外中和檢測、ELISA檢測以及熒光細胞染色分析產(chǎn)生的單克隆抗體的特性。實例5涉及形成雜化細胞系的第二種方法，該雜化細胞系能在它們生長的介質(zhì)中提供市場上有的抗體“oKT4A”的單克隆抗體，以及由Western斑檢測、體外中和檢測產(chǎn)生的單克隆抗體的特性。
實例1按本發(fā)明的一個實施方案，用諸如Oi和Herzenberg在Selected Methods Cell Immunology 351-372(1979)及Godding在“Antibody Production By Hybridomas”1980年J.Immunol.Meth.39期285-308頁上描述的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)產(chǎn)生雜化腫瘤細胞系。用單克隆抗-T4超免疫的鼠的脾細胞在聚乙二醇存在下與鼠骨髓瘤細胞進行融合。檢驗生長每個“雜化瘤”細胞培養(yǎng)物的上清液是否存在所需要的抗體活性。把選出的雜化瘤細胞進行克隆以成增殖細胞系，這種細胞系在其生長培養(yǎng)物的上清液中產(chǎn)生具有高度特異抗-抗-T4活性的抗體。
A免疫作用用單克隆的抗-人淋巴細胞T4抗體(oKT4，ortho Diagnostics，Rahway，N.J)給每個BALB/C鼠進行脾注射。
將1微克凍干的oKT4物質(zhì)放入1毫升蒸餾水中，用50mM MES緩沖液(Sigma化學(xué)公司)，PH6.0進行透析以除去和置換有機磷酸鹽緩沖劑。然后在FPLC(注冊商標(biāo))儀器上(Pharmacia，Laboratory Separation Division，Piscataway，N.J.08854)進行高壓液相層析分離。用一個單Q柱以推薦的方法(其中鹽的梯度為0至0.5M NaCl)進行分離。每0.5毫升組份的等分試樣(20微升)用新鮮采集的人淋巴細胞(105個細胞/毫升)來分析活性。更具體地說，將HPLC組份與細胞混合并離心，將細胞清洗幾次并懸浮在磷酸鹽緩沖過的鹽水(PBS)中。將5微克用FITC標(biāo)記的兔抗-鼠IgG與該細胞一起培養(yǎng)，離心后將細胞片再懸浮在PBS中并用熒光細胞計數(shù)器讀出結(jié)果。匯集顯示最高活性的組份，在SDS-PAGE上進行分析，結(jié)果表明純度高于90%。
四只小鼠每個最初脾注射總計約100微升的接種劑(每只鼠大約1.5微克的okT4)。十四天和廿八天后對每只鼠進行100微升接種劑的增強注射。
在最后一次增強注射后四天殺死這些小鼠，無菌地取出脾臟，放在盛有Dulbecoo氏改良的Eagle氏介質(zhì)(Gibco)的Petri氏培養(yǎng)皿(在冰中)中，去除脾的脂肪和結(jié)締組織，將其通過100目的不銹鋼篩，得到的各個脾細胞通過在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘形成片丸，用介質(zhì)(如上)清洗這種細胞片丸兩次，并重新懸浮在RPMI1640中，在有0.2%錐蟲蘭存在的情況下在血細胞計數(shù)器中計數(shù)測定細胞濃度。
在含有15%熱-失活的馬血清(Pel-Freeze)的RPMI1640介質(zhì)中培養(yǎng)生長由Balb/c株得到的鼠骨髓瘤細胞Ns1/1.Ag4.1。在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，使該細胞成為片丸，用不含抗菌素的RPMI1640洗滌。在重新懸浮到相同介質(zhì)中后由計數(shù)確定細胞濃度。
以4∶1的比例混合脾細胞和NS1/1細胞，并在1000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘。抽去上清液，在37℃下用分子量為500-600的聚乙二醇(PEG)1500進行細胞融合，在不斷的緩和攪動下，在指定的時間內(nèi)加入以下物質(zhì)在1分鐘的時間內(nèi)加入1毫升含50%PEG的RPMI1640，攪拌1分鐘，在1分鐘內(nèi)加入1毫升含有15%馬血清的RPMI1640;在1分鐘內(nèi)加入1毫升含15%馬血清的RPMI1640，在2分鐘內(nèi)加入8微升含15%馬血清的RPMI1640。
在1000轉(zhuǎn)/分下將得到的融合細胞離心10分鐘，重新懸浮在含有15%馬血清、還含有青霉素G和鏈霉素分別為每毫升100單位和100毫克的RPMI1640中，在預(yù)先用5%CO2平衡的96板上以每孔0.1毫升將這些細胞沉積在孔板上，該板在37℃下和5%的CO2中培養(yǎng)過夜。
第二天，在每個孔中加入0.1毫升含有15%馬血清RPMI1640的HAT介質(zhì)(13.6微克/毫升的次黃嘌呤，0.176微克/毫升的氨基喋呤和3.88微克/毫升的胸苷)。這種介質(zhì)選擇性地允許脾細胞NS1/1雜化體存活，篩除未融合的NS1/1細胞或與其它細胞融合了的NS1/1細胞。從成年鼠得來的未融化的原始脾細胞在兩天之后不能在培養(yǎng)基中存活。
在第3、4、6、9和12天，從每個孔中取出0.1毫升的介質(zhì)，并加入0.1毫升含有15%馬血清的RPML1640的新鮮HAT。在第15、19、23和27天，從每個孔中取出0.1毫升的介質(zhì)，并加入0.1毫升含有15%馬血清和只有如上同樣濃度的次黃嘌呤和胸苷的RPMI1640。在第28天，對每個孔的培養(yǎng)物上清液進行篩選以檢測對oKT4特異的抗體。
用熒光結(jié)合免疫吸收分析法ā癋LISA”)檢測產(chǎn)生oKT4抗體的雜化瘤。用100微升含3.0微克/毫升的抗-鼠IgGFC的碳酸鹽-碳酸氫鹽溶液涂敷96孔板的孔中，在37℃下過夜，用含0.05%吐溫20的PBS將孔清洗10次。用20%馬血清在37℃下將這些孔阻斷1小時，用上述的PBS/吐溫20洗兩次，去除阻斷劑。
每個雜化瘤孔中的培養(yǎng)液的20微升的等分試樣與80微升PBS在被涂敷的孔中，在室溫下培養(yǎng)1小時，然后在4℃下過夜。用含0.05%吐溫20的PBS將這些孔洗滌10次，并用150微升/孔的鼠血清(8微克/毫升)阻斷，在37℃下培養(yǎng)3小時，然后在4℃下培養(yǎng)2小時。
在每個孔里將100微升的FITC-標(biāo)記的okT4(0.3微克/毫升)在黑暗中和4℃下培養(yǎng)過夜，然后用上述的PBS/吐溫20溶液將孔洗滌10次，每個孔里加入200微升5×10-5N的N NaoH和5.6×10-4N的NH4oH溶液。將此板在室溫下保持15分鐘，然后擺動1分鐘。在轉(zhuǎn)移到Titertek微滴定1×8板上后，用Corona Electric型MTP 100F微板讀數(shù)器對這些孔進行熒光測定(激發(fā)490微米，散射530微米)。
在被篩選的2710個孔中，有19個對oKT4反應(yīng)呈現(xiàn)顯著的陽性，這19個陽性的克隆被命名為JT4C1至JT4C19。
以每3個孔大約一個細胞的比例將這些細胞稀釋劑到另外許多孔中，正式對由這些陽性孔得到的雜化瘤細胞進行克隆。一般，由一個活性孔進行正式的克隆產(chǎn)生出似乎是該同一雜化瘤細胞亞克隆的正式克隆，實際上，在三代以上顯示出不同的克隆群體。來自同一孔的亞克隆用其親本的編號再加上一個號命名(例如由孔JT4C7得到的克隆被標(biāo)記為JT4C7-1JT4C7-2等)。
實例2為了描述由實例1所述的那些陽性克隆產(chǎn)生的抗體的特性，進行一些測試以確定單克隆抗體與原始免疫原的相對親和性，該抗體還通過Western斑檢測法篩選對HIV病毒粒子蛋白的免疫反應(yīng)活性，還對抗體中和HIV病毒感染的能力進行篩選。
A、相對親和滴定除了將各種兔的抗-鼠IgGFc的稀釋液置于試驗孔中外，按照實例1中所采用的常規(guī)篩選抗體的方法進行熒光結(jié)合檢測。從克隆JT4C1到JT4C-13和JT4C-16得到的抗體的熒光結(jié)果列于表1中。各種JT4C7亞克隆的熒光結(jié)果列于表2中。
表1中的數(shù)據(jù)表明，克隆JT4C1，JT4C2和JT4C4的抗體具有較高的親和力。由克隆JT4C11和JT4C13得到的抗體具有較低的親和力，而其余試驗克隆得到的抗體具有中等的親和力。
相應(yīng)地，表2表明JT4C7的亞克隆，JT4C7-12和JT4C7-9分別具有該試驗中最高和最低的親和力。
BWestern斑分析由所有在實例1中鑒別為陽性的19個克隆得到的抗體用Western斑分析來測定與HIV病毒粒子蛋白的免疫反應(yīng)活性。更具體地說，用SDS(0.1%)和二硫蘇糖醇(0.003M)使HTLV-IIIB顆粒崩解，并將該物質(zhì)放在7.5%聚丙烯酰胺凝膠中，用標(biāo)準(zhǔn)方法對該凝膠進行電泳，將該物質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝基纖維素過濾紙上。最初用含20%熱失活馬血清的PBS液將濾紙培養(yǎng)1小時，用PBS洗滌。然后用每個克隆的抗體上清液在室溫和輕度搖動下將濾紙培養(yǎng)3小時，再在4℃和輕度搖動下過夜。在用PBS/吐溫20洗滌后，如上所述用20%的馬血清阻斷一小時，加入10微克表1濃度克隆編號抗-鼠抗體01234567(μg/ml)(空白)10-27288227992511291325292435160132718778038239387236887631372012002361281781331990.324311710637991091420.120514-11232349531030.0339221-82766866551200.013011523105548846850.00317-8-4386-1411642115濃度克隆編號抗-鼠抗體891011121316(μg/ml)102395252324631003228111512203361775171640583049762018498112922151922720.33888761013971852630.119496116117701570.034343125761041072020.01-51401033180601980.003-2729126265165136
過氧化物酶標(biāo)記的兔抗-鼠IgG，在室溫下培養(yǎng)該混合物4個小時，用PBS/吐溫20洗滌10次后，用標(biāo)準(zhǔn)方法顯色。由克隆JT4C8、JT4C12和JT4C16得到的抗體都與分子量為60000至80000的HIV蛋白強烈地反應(yīng)。這些抗體與HIV蛋白免疫反應(yīng)的能力(而他們的后代中沒有這種能力)強烈預(yù)示了這些抗體在體內(nèi)和體外實現(xiàn)中和HIV的能力。
對于在Western斑檢測中有反應(yīng)性的上述抗體進行同型分析揭示了JT4C12和JT4C16抗體是IgG3同型抗體。
C、HIV中和以下述方法測試雜化瘤培養(yǎng)物上清液的HIV中和能力。把培養(yǎng)3天的上清液以1∶5的比例用完全培養(yǎng)介質(zhì)〔500毫升RPMI 1640;6毫升100×青霉素/鏈霉素;6毫升100×L-介酰胺;100毫升FCS;和1.2毫升Polybrene stock(1mg/ml)〕進行稀釋，取200微升該介質(zhì)稀釋試樣加到24孔微量滴定板除了二個孔外的所有孔中，二個孔只加入等量的介質(zhì)。在一個“只加入介質(zhì)”的孔中加入補充介質(zhì)，其余每個孔中加入200微升高滴定度的HIV病毒，將這些板密封在塑料袋中，在4℃下培養(yǎng)1-1 1/2 小時，然后回到17℃保持15分鐘。將H9細胞以1×106細胞/毫升的密度在完全介質(zhì)中于37℃下培養(yǎng)30分鐘，然后進行離心，并以5×106細胞/毫升的密度懸浮在新鮮的完全介質(zhì)中，將200微升的細胞懸浮液加到每個孔中(使其總體積為600微升)，然后將這些微滴定板于37℃下保溫1小時，隨后將150微升轉(zhuǎn)移到每孔含有2.0毫升新鮮的完全培養(yǎng)介質(zhì)的一個完全相同的板上。將培養(yǎng)物在CO2培養(yǎng)箱中于37℃下進行培養(yǎng)，4天后，分出培養(yǎng)物，加入新鮮的完全培養(yǎng)介質(zhì)，在培養(yǎng)的第7天，制備用IFA和逆向轉(zhuǎn)錄酶法中和篩選的樣品(見Guroff等人1985年Nature316期72-74頁;Matthews等人1986年P(guān)roC.Nat′l.Acad.Sci(USA)，83期，9709-9713頁;和Poiesz等人1980年P(guān)roc.Nat′l.Acad.Sci(USA)，77期7415-7419頁)。在第一種中和篩選方法中，其結(jié)果基本上是陰性或沒有結(jié)論，而在與第一種方法同時開始的第二種方法中，JT4C1-19系列中15個試驗克隆中的12個得到的抗體在IFA或RT試驗或同時在這兩個試驗中顯示了中和活性，而被測試的6個JT4C7亞克隆的抗體中的5個顯示了中和特性。與在這些檢測中顯示100%中和的人愛滋病(HTLV-IIIB)病人血清相比，所有這些中和都是“部分”的。
實例3將市場上可買到的稱為okT4A的單克隆抗-人淋巴細胞T4(OrthoDiagnostics，Rahway，N.J.)用MonoS(比MonoQ更好)柱提純，用它重復(fù)實例1中普通雜化瘤的形成和篩選程序。特異免疫法與實例1稍微有些不同，差別是初次注射是腹腔內(nèi)注射，并含有大約15微克提純的抗體。第二次腹腔接種是在七天之后，并由大約10微克的提純抗體組成。13天后，通過脾注射施加5微克抗體以進行最后一次增強注射。在篩選的2090個槽中，34個對于與oKT4A的反應(yīng)性呈明顯陽性，其中的10個顯示出高度的活性(對大約為200的“背景”，熒光值約為100或更高些)。這10個陽性克隆被命名為JT1-1D11，JT1-1F3，JT1-1G2，JT1-6E12，JT1-6F12，JT2-8E9，JT3-2C4，JT3-5A11，JT3-6D9，以及JT3-6E8。
實例4為了說明實例3所述的陽性克隆產(chǎn)生的抗體的特性，進行與實例2所述的基本相同的試驗，簡單地說，在Western斑檢測法中，抗體上清液是與分子量約為60000至80000的HIV蛋白起反應(yīng)的，該分析方法明顯表示了與分子量約為67000的蛋白的反應(yīng)性，一些抗體顯示出與分子量為78000的蛋白的反應(yīng)性。值得注意的是與通常被認為起重要免疫作用的HIV殼糖蛋白的41kd或120kd組份無反應(yīng)性。在這些顯示最強反應(yīng)性的抗體中，二個(JT1-6E12和JT2-8E9)是IgM同型的，而克隆JT1-1F3的抗體是IgG1同型的。用JT1-1F3抗體進行熒光結(jié)合分析的結(jié)果列于表3中。
表3抗-鼠抗體濃度對照(μg/ml)空白(HAT)JT1-1F320μg/ml4754109310-3773810105-437568992.5-567599081.25-24546340.625-382913250.313233153100.15711340331
與實例2(C)同時進行的中和性研究也表示最初的陰性中和結(jié)果，在第2次試驗中，在RT測試中只具有輕微的中和能力的跡象。盡管如此，選擇IgG1-分泌JT1-1F3克隆用于腹水放大，并進一步進行與HIV蛋白反應(yīng)性的抗體ELISA篩選。
在第一次ELISA篩選中，在一些微滴定板上涂上各種不同濃度的HTLV-IIIB蛋白(濃度分別為40，20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0.078，0.039和0.020μg/ml)，阻斷(20%馬血清/PBS，在37℃下阻斷2小時)并干燥過夜。將培養(yǎng)物上清液(20微升與80微升PBS)或HAT培養(yǎng)介質(zhì)對照作為第一抗體加入，在室溫下培養(yǎng)1小時，于4℃下貯存過夜。把過氧化物酶結(jié)合的兔抗-鼠IgG(0.3微克/毫升在5%的馬血清/PBS中)作為第二抗體加入。在室溫下培養(yǎng)2小時后，加入底物(0-苯二胺，0.5mg/ml在McIlvan氏緩沖液中，pH5.5;3%過氧化氫10毫升)。在室溫下培養(yǎng)20分鐘后，用50微升0.4M硫酸停止反應(yīng)，并在入492-610處讀出吸收度。試驗結(jié)果表示在圖1中，結(jié)果表明，在1.25微克的水平上HIV是可檢測的，直到含40微克病毒時，反應(yīng)活性逐漸增加。
對一開始涂以不同濃度的未感染的H9細胞膜制劑(106，6×105，4×105，2×105，6×104，4×104，2×104，1×104，6×103，4×103，2×103細胞/毫升)的滴定板重復(fù)ELISA程序，試驗結(jié)果表示在圖2中，結(jié)果表明與未感染的制劑無反應(yīng)性。
最后，用各種同樣濃度的由HTLV-IIIBHIV變異種，命名為AL1212C的Haitian HIV變異種(由馬薩諸塞州，波士頓，Massachusetts General Hospital的DaVid Hall醫(yī)生獲得)和命名為906的African HIV變異種(由馬薩諸塞州，波士頓的New England DeaConess Hospital的Jerone Groopman醫(yī)生獲得)得到的蛋白重復(fù)HIV蛋白的ELISA。如圖3所示，JT1-1F3抗體可識別所有三種HIV變異種的一個共同的抗原決定部位。如上所述的RT分析法和Syncitium誘導(dǎo)指示的那樣，再測試由JT1-1F3抗體得出的腹水體液的體外中和活性。在這一方法中，對各種水平的JT1-1F3抗體(腹水體液的IgG組分)、一種陰性對照(腹水/姥鮫烷(Pristane))和以一個HTLV-IIIB感染病人血清形式的陽性對照之間進行比較，按照這種方法，HIV菌株IIIB，AL1212C和906與Mab JR1-1F3，對照腹水或中和人血清(以1∶5的稀釋度在磷酸鹽緩沖過的鹽水中)一起在4℃下培養(yǎng)90分鐘。然后對每個孔加入H9細胞(5×106)，在37℃下培養(yǎng)1小時。從每個孔中取出等分試樣(150微升)并加到2.0毫升的新鮮培養(yǎng)介質(zhì)中。在第4天將培養(yǎng)物以1∶1分開。在第4天和第7天記錄逆向轉(zhuǎn)錄酶活性和Syncytium誘導(dǎo)。該方法第7天的結(jié)果列于表4中，其中相對Syncytium誘導(dǎo)表示如下(-)，0/200細胞;(+/-)1-5/200細胞;(+)，＞10%細胞;(++)，＞細胞的25%;以及(+++)，＞細胞的50%。
表4所示結(jié)果清楚地表明了JT1－1F3抗體對所有三種試驗的HIV變異種在體外的中和活性，與未感染的病人血清的中和活性相對照，它完全是變種一特異性的，這表明可用一種重要類型的公共的抗原決定部位來識別。
JT1－1F3抗體反應(yīng)種的分子量由免疫斑(immunoblo－tting)來測定。用SDS－PAGE和Coomasie蘭／銀染色(圖4，通道B和C)分析經(jīng)純化的HTLV－IIIB。用SDS－PAGE分析類似的一些等分試樣，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素紙上，并分析與JT1－1F3抗體的反應(yīng)活性。在大約67kd(圖4，通道E和F)處可檢測到一個單獨的反應(yīng)種。
將JT1－1F3抗體與HTLV－IIIB分離株的反應(yīng)活性與對其它HIV株的反應(yīng)性進行比較。用ELISA方法得到與HTLV－IIIB，AL1212C和906株的類似型式的反應(yīng)活性。此外JT1－1F3抗體與三種HIB株中每一個的Western斑分析揭示了與相似分子量抗原的反應(yīng)活性(圖5)。這些發(fā)現(xiàn)表面，MAbJT1－1F3與各種HIV株中可檢測到的有關(guān)的或相同的抗原反應(yīng)。
上述對JT1－1F3抗體的發(fā)現(xiàn)啟示了它在檢測HTV病毒感染的細胞中也可能是有用的。關(guān)于這一點，對JT1－1F3抗體(腹水體液的IgG組分)結(jié)合到未感染的和HIV感染的H9細胞進行了監(jiān)測，由熒光化的兔的抗－鼠IgG確定JT1－1F3結(jié)合的程度。如圖6A所示，如果有的話，只有很少的可以檢測到的抗體與未感染的H9細胞結(jié)合，相反，可檢測到該抗體與HTLV－IIIB感染的H9細胞集中的和彌散的結(jié)合(圖6B)。在用906和AL1212C株感染的H9細胞時獲得類似的結(jié)論(圖6C和D)。這一方法已被推廣到愛滋病人的造血細胞上。通過Ficoll-Hypaque分離法從愛滋病人的外周血中收集單核細胞并檢查與JT1-1F3的反應(yīng)活性。如圖6E所示，用這些細胞檢測到一個集中和彌散的兔疫熒光染色圖形，與用HIV感染的H9細胞得出的結(jié)果相似。
值得注意的是，篩選的JT1-1F3抗體與具有第Ⅱ級重要的組織相容性(“MHC”)表面成分(即人的B細胞系MD1和正常的外周血單核細胞)的反應(yīng)活性不具有明顯的反應(yīng)活性。
由JT1-1F3的亞克隆而選出的亞克隆JT1-1F3-E5和JT1-1D7分別作為產(chǎn)生比JT1-1F3更高水平的IgG1抗體。JT1-1F3，JT1-1F3-E5和JT1-1D7相互比較的中和分析數(shù)據(jù)列于下表5中。這三個雜化瘤產(chǎn)生的抗體在ELISA分析中的反應(yīng)活性列于下表6中。
表6在ELISA分析中3個雜化瘤的比較HIV-IIIB對照病毒蛋白JT1-1F3JT1-1E5JT1-1D7(培養(yǎng)介質(zhì))101.3371.1111.3920.03150.9140.8871.1180.0232.50.9960.8311.0810.0221.250.4990.2780.5230.0110.630.2210.1220.1760.0200.310.0700.0750.0600.0150.160.0480.0490.0360.0040.080.0270.0270.0310.012實例5用okT4A并在免疫方法中作如下變動來重復(fù)實例1和3的雜化瘤形成和篩選步驟，最初的免疫包括10微克MonoS提純的okT4A抗體的腹腔注射;17天后進行第二次腹腔注射(7微克)，18天后進行最后一次7微克的腹腔注射。在融合和篩選后，選出一個命名為JT2-N15的產(chǎn)生IgG1陽性的克隆供進一步研究。象JT1-1F3和它的亞克隆JT1-1F3-E5和JT1-1D7一樣，克隆JT2-N15產(chǎn)生一個在Western印跡分析中與具有分子量約為65000至67000的HIV蛋白起反應(yīng)的單克隆抗體。JT2-N15生長的培養(yǎng)介質(zhì)在ELISA分析中是陽性的，與HIV-IIIB感染性有關(guān)的初步中和分析結(jié)果列于下表7中。
表7JT2-N15對HIV-IIIB的中和作用RT活性和%中和作用1、未感染的H9157/-2、HIV12194/03、HIV+1.5mg/mlAb343/98.54、HIV+750μg/mlAb568/96.6在對由腹水法繁殖的抗-特異基因型抗體的中和活性作進一步篩選的過程中，已初步確定，下列方案可產(chǎn)生最大活性的腹水制劑。5至8周齡的小鼠首次注射0.5至1.0毫升的姥鮫烷，二周后注射2至8×106(最好約5×106)的雜化瘤細胞。接種二周后開始收集腹水體液，最初收集到的體液(約3-5毫升)顯示出最高的中和活性。三天后進行第二次腹水體液的收集，得到8至10毫升活性稍低的體液。第三次從存活動物進行收集，一般給出3-5毫升的體液，它往往比第一次或第二次收集的物質(zhì)具有更小的活性。表4和5中表示的中和作用數(shù)據(jù)是以匯集的三次收集物的腹水為基礎(chǔ)的，而表6和7中的JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15的數(shù)據(jù)是以只匯集第一和第二次收集物的腹水為基礎(chǔ)的。
雖然上述實例與市場上有的單克隆抗體制劑okT4和okT4A的方法有關(guān)，但是預(yù)料其它市售的抗體，如Leu3a(Becton-Dickenson，ImmunocytometrySystemMountainView，California，94039)也同樣適用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗一特異基因型抗體。用表達T4糖蛋白的人T細胞、人T淋巴細胞和重組體產(chǎn)生的人T4蛋白分離物作為原始免疫原通過已知的雜化瘤技術(shù)制備的非市售抗體(最好單克隆抗體)同樣是適用的。此外，當(dāng)由JT1-1F3和它的亞克隆和JT2-N15產(chǎn)生的抗體是IgG1同型時，可以預(yù)料，不同的同型抗體同樣都是有用的。例如，IgG2同型抗體在涉及補體一中介溶胞反應(yīng)的方法中將更為有用。
Chanh等人1987年6月P.N.A.S(USA)84期3891-3895頁上的報道可證實本發(fā)明方法的切實可行性，其中報道了Leu3a(命名為HF1.7)的單克隆抗體能夠在體外中和HIV-IIIB感染。然而，HF1.7的中和活性其特征為“弱”的(見Weiss1988年1月Nature331期15頁)并且還沒有證明可以擴大到HIV-IIIB以外的菌株。此外，與上述實例中的抗-okT4和okT4A單克隆抗體不同，Chanh等人的抗-Leu3a抗體如Chanh等人上文3894頁圖4所示那樣，未指出與除gP120以外的任何HTV-衍生蛋白有反應(yīng)性〔也參見Dalgleish等人1987年11月7日的TheLancetii1047-1050有關(guān)多克隆抗-Leu3a抗體的內(nèi)容)。
雖然上述實例都涉及小白鼠衍生的雜化瘤細胞，但是生成和利用雜種雜化瘤(例如鼠/人和特別是例如用與Borrebaeck1986年1月的TIBTECH147-153;Abrams等人1986年MethodsinEnzymology121期107-119頁;Kozbor等人1986年MethodsinEnzymology121期120-140頁;Suresh等人1986年MethodsinEnzymology121期210-228頁;以及Masuho等人1986年Biochem.&Biophys.Res.Comm.，135(2)495-500頁一致的方法制備的人/人雜化瘤都在本發(fā)明的范圍中。還參見Klausner“SingleChain′AntibodiesBecomeaReality”1986年Bio/Technology，4，1041-1042，Klausner，“StageSetFor′ImmunologicalStarWar′”1987年Bio/Technology，5，867-868頁以及Marx，“AntibodiesMadeToOrder”1985年Science，229，455-456頁。
因此，很容易理解到，上述生產(chǎn)雜化瘤和鑒別、分離單克隆抗體的具體方法不能限制本發(fā)明的實施范圍，如MethodsinEnzy-mologyVo1.121中的許多報道和1986年紐約Academic出版公司出版的Langone等人編輯的“ImmunologicalTechniques，PartI”的報道，有許多可供選擇的方法可達到同樣的結(jié)果。
在培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核和真核生物宿主細胞表達具有其編碼的DNA序列來形成用于本發(fā)明的診斷和治療方法中的免疫活性多肽也在本發(fā)明范圍中。
本發(fā)明的抗-HIV治療方法將被理解為包括給感染HIV或處于HIV感染危險之中的病人服用有效量的本發(fā)明的抗體或抗體片段，以產(chǎn)生包含在體內(nèi)中和HIV感染的被動免疫力。關(guān)于這一點，為了形成免疫活性的抗-HIV治療組合物，預(yù)料本發(fā)明產(chǎn)品可與免疫學(xué)上可接受的稀釋劑、輔助劑和載體相組合。
屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的抗-HIV治療方法還包括用對單克隆抗-單克隆抗-人淋巴細胞有反應(yīng)性的生物活性HIV蛋白進行的自動免疫法。這些產(chǎn)品可以直接由病毒制劑通過眾所周知的親和性提純工藝，包括先形成HIV蛋白和本發(fā)明抗體之間的免疫反應(yīng)混合物，接著分離所需蛋白而獲得。作為一個例子，在實例4的方法中由JT1-1F3識別的分子量為60000到80000的HIV蛋白是最初的作疫苗用的選擇物。同樣可預(yù)料基于用本發(fā)明抗體免疫識別(和/或提純的)的HIVDNA的重組體表達產(chǎn)品。
利用多肽產(chǎn)品來檢測和確定諸如血液這樣的生物體液中的HIV粒子量的本發(fā)明診斷方法預(yù)期在初步甄別從本發(fā)明的被動免疫法受益的病人和在監(jiān)測本發(fā)明的治療狀況下，構(gòu)成一個必不可少的部分。關(guān)于本發(fā)明抗體與HIV感染細胞表面選擇性反應(yīng)的結(jié)論指出了各種診斷和治療的用途，包括不能用篩選抗體為基礎(chǔ)的分析法檢測的早期感染階段，為了檢測HIV感染進行組織(例如淋巴細胞)和體液(例如血液)樣本的組織篩選。用本發(fā)明的抗體識別感染細胞允許從包含感染和未感染細胞兩者的細胞群體中分離出感染細胞。因此，可以預(yù)料愛滋病人的血液可以用本發(fā)明的抗體在體外進行處理，以去除或選擇性地殺死受感染的淋巴細胞。此外，用本發(fā)明的抗體結(jié)合輔助以循環(huán)補體來實現(xiàn)感染細胞的溶胞作用而進行體內(nèi)處理也在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種治療方案對測試JT1-1D7抗體參與體內(nèi)HIV感染的H9細胞的補體相關(guān)的溶胞作用提供了初步陽性結(jié)果。
抗體選擇性反應(yīng)活性的性質(zhì)使它們成為體內(nèi)藥物或傳送到受感染細胞的毒素以及用于發(fā)展包括可供例如聚集效應(yīng)子T細胞活性的雙決定子的雙特異抗體的良好的選擇物。參見例如Stearz等人1986年P(guān)roc.Nat′1.Acad.Sci.(USA)，83，1453-1457頁。
基于這樣一個事實，即本發(fā)明基于T4蛋白的免疫學(xué)特性-據(jù)信它對所有變異種(例如AL1212C，906，ARC.LAV，HTLV-IIIRF，HTLV-IIIB)提供共同的受體-而不是任何一個特定的HIV變種，所以，可以預(yù)料，本發(fā)明的診斷和治療方法將適用于檢測和治療包含所有HIV變種的感染。利用本發(fā)明的多肽作為診斷和研究的工作預(yù)料可提供深入到HIV和宿主細胞之間相互作用的其它信息。作為一個例子，本發(fā)明的單克隆抗體將用于辨識HIV和宿主細胞的表面蛋白區(qū)域的準(zhǔn)確的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)的形態(tài)中，這些表面蛋白在識別細胞的HIV感染和有關(guān)過程中必定是相互作用的。反之，用這種信息，將使合成的和重組體產(chǎn)生的多肽免疫原生成本發(fā)明的免疫活性物質(zhì)。
上述詳細說明只是為了能清楚地理解發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明，因為該技術(shù)中的專業(yè)人員可預(yù)料對本發(fā)明所作的各種修改和變更。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)提純和分離的免疫活性多肽，能與HIV病毒粒子的一部分進行特異免疫結(jié)合，所說的這部分HIV病毒粒子在HIV感染宿主細胞時必然與T4表面蛋白相互作用，其特征為在體外具有中和HIV感染的能力以及與對人淋巴細胞T4免疫特異的抗體具有特異免疫反應(yīng)活性。
2.如權(quán)利要求1所述的一種多肽呈抗體或嵌合抗體或它們的片段形式。
3.如權(quán)利要求1所述的一種多肽其特征為與oKT4抗體有特異免疫反應(yīng)活性。
4.如權(quán)利要求1所述的一種多肽其特征為與oKT4A抗體有特異免疫反應(yīng)活性。
5.如權(quán)利要求1所述的一種多肽呈與由SDS-PAGE測定的分子量約為60000至80000的HIV蛋白具有特異免疫反應(yīng)活性的抗體形式、嵌合抗體或它們的片段形式。
6.如權(quán)利要求5所述的一種多肽，它與由SDS-PAGE測定的分子量約為65000至67000的HIV蛋白具有特異免疫反應(yīng)活性。
7.如權(quán)利要求1所述的一種多肽，它與第Ⅱ級組織相容性分子在免疫學(xué)上是無反應(yīng)的。
8.如權(quán)利要求1所述的一種多肽呈鼠-衍生抗體或抗體片段形式。
9.如權(quán)利要求1所述的一種多肽呈人抗體或抗體片段形式。
10.如權(quán)利要求8或9所述的一種多肽呈單克隆抗體或單克隆抗體片段形式。
11.如權(quán)利要求10所述的一種多肽呈雙決定子、雙特異單克隆抗體的形式。
12.單克隆的抗-單克隆-抗-人淋巴細胞T4抗體。
13.單克隆的抗-oKT4抗體。
14.單克隆的抗-oKT4抗體。
15.一種能在其生長介質(zhì)中產(chǎn)生權(quán)利要求12的一種單克隆抗體的雜化瘤細胞系。
16.如權(quán)利要求15所述的一種雜化瘤細胞系選自JT4C8，JT4C12，JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15。
17.一種能在其生長介質(zhì)中產(chǎn)生權(quán)利要求11的一種多肽的雜化瘤細胞系。
18.一種抗-HIV治療方法包括給易受HIV感染的動物施用免疫行Я康娜ɡ 所述的一種多肽。
19.一種抗-HIV治療方法包括給易受HIV感染的動物施用免疫有效量的權(quán)利要求12所述的一種多肽。
20.一種用于對HIV感染產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的疫苗組合物含有免疫有效量的權(quán)利要求1所述的多肽。
21.一種用于對HIV感染產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的疫苗組合物含有免疫有效量的權(quán)利要求12所述的一種抗體。
22.一種基于HIV與對HIV具有特異免疫結(jié)合能力的免疫活性多肽之間的免疫反應(yīng)，在生物體液中用于檢測和/或確定HIV量的分析方法，其改進包括采用權(quán)利要求1所述的一種多肽作為免疫活性多肽。
23.一種基于HIV與對HIV具有特異免疫結(jié)合能力的免疫活性多肽之間的免疫反應(yīng)，在生物體液中用于檢測和/或確定HIV量的分析方法，其改進包括采用權(quán)利要求12所述的一種抗體。
24.一種用于檢測和/或確定在體液或組織樣本中HIV-感染宿主細胞量的分析方法，所說的方法包括所說樣本與權(quán)利要求1所述的一種多肽形成一種免疫反應(yīng)混合物，并檢測所說多肽對感染細胞表面存在的免疫結(jié)合。
25.一種用于檢測和/或確定在體液或組織樣本中HIV-感染宿主細胞量的分析方法，所說的方法包括所說樣本與權(quán)利要求12所述的一種抗體形成一種免疫反應(yīng)混合物，并檢測所說抗體對感染細胞表面存在的免疫結(jié)合。
26.如權(quán)利要求25所述的一種分析方法，其中所說的檢測步驟包括確定結(jié)合到所說抗體上的可檢測的標(biāo)記。
27.如權(quán)利要求25所述的一種分析方法，其中所說的檢測步驟包括確定結(jié)合到加至所說反應(yīng)混合物中的抗-抗體上的可檢測的標(biāo)記。
28.如權(quán)利要求25所述的一種分析方法，其中所說的抗體選自抗-oKT4抗體或抗-oKT4A抗體。
29.一種在感染和未感染細胞的群體中分離HIV感染細胞的方法，該方法包括所說細胞群體和權(quán)利要求1所述的一種多肽形成一種免疫反應(yīng)混合物，并根據(jù)所說多肽對感染細胞的選擇性結(jié)合從未感染細胞中分離感染細胞。
30.一種在感染和未感染細胞群體中分離HIV感染細胞的方法，該方法包括所說細胞群體與權(quán)利要求12的一種抗體形成一種免疫反應(yīng)混合物，并根據(jù)所說抗體對感染細胞的選擇性結(jié)合從未感染細胞中分離感染細胞。
31.一種從體液樣本中分離HIV蛋白的方法，該方法包括將所說樣本與權(quán)利要求1的一種多肽接觸以形成一種包括所說蛋白和所說多肽的免疫反應(yīng)混合物，并從所說反應(yīng)混合物中分離所說的蛋白。
32.一種從體液樣本中分離HIV蛋白的方法，該方法包括將所說樣本與權(quán)利要求12的一種抗體接觸以形成一種包括所說蛋白和所說多肽的免疫反應(yīng)混合物，并從所說反應(yīng)混合物中分離所說的蛋白。
33.一種經(jīng)提純和分離的HIV蛋白，其特征在于(1)由SDS-PAGE確定其分子量約為60000-80000;以及(2)與單克隆的抗-單克隆-抗-人淋巴細胞T4抗體的特異免疫反應(yīng)活性。
34.如權(quán)利要求33所述的一種經(jīng)提純和分離的HIV蛋白，其特征在于由SDS-PAGE確定分子量約為65000-67000。
35.如權(quán)利要求33所述的一種HIV蛋白，其另一特征為在一個敏感的宿主中能對HIV感染刺激起保護作用的體內(nèi)免疫應(yīng)答。
36.一種如權(quán)利要求33所述的HIV蛋白，其另一特征為采用包括單克隆抗-單克隆-抗-人淋巴細胞T4抗體的一種免疫吸附劑作為親和性提純法的一種產(chǎn)品。
37.一種用于對HIV病毒感染產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的疫苗組合物包括免疫活性量的權(quán)利要求33所述的一種HIV蛋白和免疫學(xué)上可接受的稀釋劑、輔助劑或載體。
38.一種用于對HIV病毒感染產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的疫苗組合物，包括具有部分和全部的用SDS-PAGE測定分子量為60000至80000的HIV蛋白編碼的DNA轉(zhuǎn)化或感染的宿主細胞的表達產(chǎn)品，且該產(chǎn)品與單克隆的抗-單克隆-抗人淋巴細胞T4抗體具有特異免疫反應(yīng)活性。
39.一種用編碼了權(quán)利要求1的一種多肽的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的微生物宿主細胞。
40.一種用編碼了權(quán)利要求33的一種多肽的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的微生物宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了免疫活性多肽、最好是抗體或抗體片段，尤其是單克隆抗體，它們對人淋巴細胞T4蛋白的特異基因型抗體具有活性，并且以可供體內(nèi)和體外中和HIV感染的方式與HIV病毒粒子起反應(yīng)，并檢測在生物體液中的HIV粒子。目前最好的實施方案包括用新的小白鼠雜化瘤細胞系JT4C8，JT4C12，JT4C16，JT1-1F3，JT1-1F3-E5，JT1-1D7和JT2-N15產(chǎn)生的單克隆的抗-單克隆-抗-人淋巴細胞T4抗體。還公開了自動和被動接種方法。
文檔編號G01N33/569GK1030256SQ88101470
公開日1989年1月11日 申請日期1988年3月4日 優(yōu)先權(quán)日1987年6月29日
發(fā)明者大野典也 申請人:日清食品株式會社