專利名稱：一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種診斷登革病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，以及以該抗原蛋白作為包被抗原的登革病毒檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
登革病毒(Dengue virus, DV)隸屬黃病毒科，包括1 4個(gè)血清型，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全世界超過100個(gè)國家的25億人正受登革病毒威脅，每年感染人口多達(dá)5000 萬 1億，其中有25 50萬人屬于嚴(yán)重的登革出血熱，平均死亡率為5 %，是僅次于瘧疾的重要熱帶病。我國南方各省為登革熱高發(fā)區(qū)，監(jiān)測表明，1990 2010年間我國每年都有登革熱流行，種種跡象表明我國已成為登革病毒的疫源地。因此，登革病毒的預(yù)防與控制日益緊迫。而該類病毒防制的關(guān)鍵在于及時(shí)發(fā)現(xiàn)，并盡早隔離，故而對(duì)登革病毒及時(shí)、有效地檢測對(duì)于該病的檢疫和防止具有非常重要的意義。目前國內(nèi)外關(guān)于登革病毒檢測方法一般采取病毒分離、核酸檢測及免疫學(xué)檢測。其中病毒分離及核酸雜交法操作都較繁瑣，對(duì)儀器要求較高，而且其周期都較長，且病毒分離還受標(biāo)本抽取時(shí)間、臨床用藥等因素的影響，達(dá)不到早期快速診治的目的，很難在實(shí)踐中得到應(yīng)用；建立在PCR基礎(chǔ)上的快檢方法近年進(jìn)展較快，但對(duì)設(shè)備及操作人員的要求較高，容易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。免疫學(xué)檢測主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及膠體金等方法，速度快，對(duì)實(shí)驗(yàn)要求不高，不需要無菌操作，可以自動(dòng)化、高通量的檢測大量樣品，同時(shí)也比較靈敏、可靠，并且已經(jīng)在不同的病原檢測中得到廣泛應(yīng)用，其操作已被廣大基層衛(wèi)生防疫人員熟練掌握，有其他方法無法代替的優(yōu)勢。從現(xiàn)有技術(shù)中公開的登革病毒血清學(xué)診斷方面的資料來看，主要存在以下方面的問題(1)不同黃病毒之間存在嚴(yán)重的血清學(xué)交叉反應(yīng)，在那些存在多種黃病毒流行的區(qū)域，由于混合感染，患者體內(nèi)存在交叉抗體，使得免疫學(xué)診斷及鑒別診斷十分困難。(2)由于IgG抗體可以在宿主體內(nèi)存在很長時(shí)間，有的還會(huì)超過10個(gè)月，甚至終生攜帶，使得鑒別過去、最近還是現(xiàn)在感染登革病毒十分困難。( 登革病毒為小RNA病毒，具有較高的突變率，因此采用單抗原檢測時(shí)其覆蓋面往往受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的所解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，該重組抗原蛋白具有特異性強(qiáng)、親和力高的優(yōu)點(diǎn)，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學(xué)交叉反應(yīng)，而與登革病毒抗體具有極高親和力。本發(fā)明的所解決的技術(shù)問題在于提供一種登革病毒的檢測試劑盒，利用所制備的重組抗原蛋白，建立登革病毒抗體的ELISA快速檢測技術(shù)。為了解決上述技術(shù)問題，一方面，本發(fā)明提供一種檢測登革病毒的重組抗原蛋白， 所述重組抗原蛋白包括具有如SEQ ID而.6所示氨基酸序列的0611-六85。優(yōu)選地，所述Den-Ag5的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述重組抗原蛋白還包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的Den-Agl 和/或具有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列Den-Ag2 ；所述Den-Agl的編碼基因序列具有如 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-AgU Den-Ag2等量混合而成。該重組抗原蛋白是通過選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，并將相應(yīng)的目的基因片段通過原核表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)而制備得到，而目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達(dá)載體的融合蛋白對(duì)多肽表位的掩蓋，使表達(dá)的重組抗原蛋白正確折疊。另一方面，本發(fā)明具體實(shí)施方式
中還提供了一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟一、選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段， 該目的基因片段包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達(dá)載體的融合蛋白對(duì)多肽表位的掩蓋，使表達(dá)的重組抗原蛋白正確折疊；二、設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并通過PCR擴(kuò)增所述目的基因片段；三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建含有所述目的基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒；四、將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達(dá)宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)所述表達(dá)宿主細(xì)胞使其產(chǎn)生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID N0. 6所示氨基酸序列。優(yōu)選地，所述目的基因片段還包括如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的Den-Agl ；如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID N0. 4所示氨基酸序列的Den-Ag2。優(yōu)選地，所述步驟二中采用的PCR擴(kuò)增引物序列如下擴(kuò)增SEQ ID NO. 1核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQID NO. 7>反向引物ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQID NO. 8> ；
擴(kuò)增SEQ ID N0. 3核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQID N0. 9>，反向引物ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQID NO. 10> ；擴(kuò)增SEQ ID N0. 5核苷酸序列的引物正向引物CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQID Ν0· 11 >，反向引物ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQID Ν0· 12>。優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中所述原核表達(dá)載體選用pET3h或pMAL c2x原核表達(dá)載體，所述表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌。對(duì)于本發(fā)明的重組抗原蛋白，其具有特異性強(qiáng)、親和力高的優(yōu)點(diǎn)，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學(xué)交叉反應(yīng)，而與登革病毒抗體具有極高親和力。在本發(fā)明的實(shí)施例中，
5通過將表達(dá)獲得的抗原蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，用病毒抗血清進(jìn)行ffestern-blot，驗(yàn)證了本發(fā)明的重組抗原蛋白具有極高的特異性，并獲取了能高效表達(dá)登革病毒特異性重組抗原的基因工程菌株，同時(shí)結(jié)合采用了該重組抗原蛋白的登革病毒檢測試劑盒在其靈敏度試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和對(duì)具體臨床標(biāo)本的測試試驗(yàn)結(jié)果，更進(jìn)一步地說明了本發(fā)明的重組抗原蛋白在用于檢測登革病毒時(shí)表現(xiàn)出的高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢。對(duì)于本發(fā)明的重組抗原蛋白制備方法，由于其選擇了登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，而目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達(dá)載體的融合蛋白對(duì)多肽表位的掩蓋，使表達(dá)的重組抗原蛋白正確折疊，同時(shí)結(jié)合上述方案中涉及的專用引物，有效地獲取了該目的基因，同時(shí)結(jié)合該方法中采用的原核表達(dá)載體和表達(dá)宿主菌，使重組抗原蛋白具備高效的表達(dá)效果。另外，在本發(fā)明的實(shí)施例中，通過將表達(dá)獲得的抗原蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，用病毒抗血清進(jìn)行ffestern-blot，同時(shí)結(jié)合采用了該重組抗原蛋白的登革病毒檢測試劑盒在其靈敏度試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和對(duì)具體臨床標(biāo)本的測試試驗(yàn)結(jié)果，更進(jìn)一步地說明了本發(fā)明的重組抗原蛋白的制備方法在高效表達(dá)重組抗原蛋白、以及保證本發(fā)明重組抗原蛋白的高靈敏度、高特異性方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢。另外，本發(fā)明還提供了一種登革病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應(yīng)液，所述抗體檢測板上包被有檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，而所述重組抗原蛋白即為本發(fā)明上述方案中揭示的重組抗原蛋白。其中，試劑盒中ELISA反應(yīng)液包括酶結(jié)合物工作液，陽性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結(jié)合物工作液，陽性對(duì)照為登革病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照為登革病毒抗體陰性血清。優(yōu)選地，在本發(fā)明具體實(shí)施例中所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人 IgG0優(yōu)選地，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟一、按照本發(fā)明上述方案中揭示的重組抗原蛋白制備方法制備重組抗原蛋白；二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯(lián)板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級(jí)濃度包被酶聯(lián)板，每孔50-200ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉1-3小時(shí)，晾干后即得到所述抗體檢測板；而所述重組抗體為即為本發(fā)明上述方案中揭示的檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白。優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-AgU Den-Ag2等量混合而成。結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中揭示的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容可以看出，實(shí)驗(yàn)中在保證反應(yīng)原性的基礎(chǔ)上，盡量縮短了抗原片段長度，確保所篩選的原核表達(dá)抗原具備良好的特異性，與所測試的流行性乙型腦炎、黃熱、西尼羅河、基孔肯亞、辛德畢斯、西門利克、馬雅羅、羅斯河、鷺山及蓋塔病毒均無交叉反應(yīng)。同時(shí)，所建立的制備方法及登革病毒的檢測試劑盒均具備較高靈敏度及檢出范圍，以登革病毒小鼠免疫血清進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，在血清1 1 1 1觀00倍稀釋范圍內(nèi)，均可獲得陽性結(jié)果，而且無非特異性結(jié)果。以登革病毒患者血清進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，在血清1 50 1 200倍稀釋范圍內(nèi)，均可獲得陽性結(jié)果，檢測OD值在0. 25以上，S/N比值在15以上。另外，還需要說明的是，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中包被于抗體檢測板上的重組抗原蛋白由三段登革病毒原核表達(dá)抗原混合而成，既包括病毒NSl早期蛋白，可用于早期診斷，也包括病毒E包膜蛋白，具備較高的敏感性，并且多檢測位點(diǎn)也提高了檢測方法的覆蓋面。但本發(fā)明的所要求保護(hù)的內(nèi)容并不僅限于該技術(shù)方案，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，僅含有Den-Ag5 的重組抗原蛋白即可實(shí)現(xiàn)該檢測，而該實(shí)施例中的方式通過等量的三種混合抗原，保證了試劑盒較高的敏感性和有效性。另一方面，結(jié)合本發(fā)明的重組抗原蛋白用于登革病毒的檢測試劑盒的具體實(shí)施方式
，充分說明了本發(fā)明的重組抗原蛋白在制備診斷登革病毒試劑盒中的運(yùn)用，并能夠保證登革病毒診斷過程中的靈敏度和特異性。相對(duì)于全病毒抗原，重組抗原蛋白純度高、特異性強(qiáng)，便于質(zhì)量控制，可以去掉不與抗體結(jié)合的無關(guān)區(qū)段，將使得檢測靈敏度和特異性增加， 并且成本也較低，在病毒檢測中具有較大優(yōu)勢。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中登革1-4型病毒、黃熱病毒、流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體與原核表達(dá)抗原的western blot雜交結(jié)果。a =SDS PAGE電泳圖；b 登革1型病毒多克隆抗體^festern blot結(jié)果；c 登革2型病毒多克隆抗體flfestern blot結(jié)果；d 登革3型病毒多克隆抗體^fester blot結(jié)果；e 登革4型病毒多克隆抗體flfestern blot結(jié)果；f 黃熱病毒多克隆抗體Astern blot結(jié)果；g 流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體flfestern blot 結(jié)果。1.未誘導(dǎo)對(duì)照；2. pMAL c2x 空載體誘導(dǎo)；3. Den-Ag 1+pMAL c2x ；4. Den_Ag2+pET32a ； 5. Den-Ag3+pMAL c2x ；6. Den-Ag4+pMAL c2x ；Μ.蛋白分子量 Marker (分子量由上至下分別為 170、130、95、72、55、43、34、26、17kDa) ；7.Den_Ag5+pET32a。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中ELISA方法及其應(yīng)用；其中，a 抗原包被濃度實(shí)驗(yàn)，Al A2，Bl B2，Cl C2，Dl D2，El E2，F(xiàn)l F2，Gl G2分別為三種重組抗原等量混合后 20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2. 5ug/ml、l. 25ug/ml、0. 625ug/ml、0. 3125ug/ml 包被，H1、H2 為未包被對(duì)照；b =ELISA敏感性實(shí)驗(yàn)，正交法法將鼠抗登革2型病毒多克隆抗體進(jìn)行稀釋， 測定ELISA方法敏感性；c =ELISA特異性實(shí)驗(yàn)，Al，A2孔加登革1型病毒多克隆抗體，Bi， B2為登革2型病毒多克隆抗體，Cl，C2為登革3型病毒多克隆抗體，Dl, D2為登革4型病毒多克隆抗體，El, E2為流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體，F(xiàn)l, F2為黃熱病度多克隆抗體， Gl，G2為西尼羅河病毒多克隆抗體；Hl，H2基孔肯雅病毒多克隆抗體；A3，A4為瑪雅羅病毒多克隆抗體；B3，B4為羅斯河病毒多克隆抗體，C3，C4為鷺山病毒多克隆抗體，D3，D4為蓋塔病毒多克隆抗體；E3，E4，辛德畢斯病毒多克隆抗體；F3，F(xiàn)4，西門利克病毒病毒多克隆抗體；G3，G4為陰性血清對(duì)照；H3，H4為陽性血清對(duì)照；d 臨床標(biāo)本檢測結(jié)果，Al A4 1號(hào)患者血清50、100、400、800倍稀釋后的檢測結(jié)果，Bl B4，2號(hào)患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，Cl C4，3號(hào)患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，Dl D4，4 號(hào)患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，El E4，5號(hào)患者血清50、100、200、400 倍稀釋后的檢測結(jié)果，F(xiàn)l F4，6號(hào)患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果；Gl G4，陰性血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，Hl H4，陽性血清2000、4000、8000、 16000倍稀釋后的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)施手冊(cè)中所述的條件。本發(fā)明的下列實(shí)施例中，選用的登革病毒為登革病毒1型(Hawaii株，DVl)，登革病毒2型(NGC株，DV2)，登革病毒3型(H87株，DV3)，登革病毒4型(H241株，DV4)，申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有毒株樣本；而實(shí)驗(yàn)中用的內(nèi)切酶、連接酶、T載體購自大連TaKaRa公司。凝膠純化回收及質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸設(shè)MEGA公司。Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑購自^witrogen 公司。pET3h表達(dá)載體及其重組蛋白純化試劑購自Novagen公司，pMAL-Ch表達(dá)載體購自New England Biolabs公司，Amylose Resin親和層析試劑購自NEB公司，表達(dá)宿主菌 Rosetta (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。實(shí)施例1、檢測登革病毒的重組抗原蛋白的制備按照如下步驟制備檢測登革病毒的重組抗原蛋白步驟一、選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達(dá)載體的融合蛋白對(duì)多肽表位的掩蓋，使表達(dá)的重組抗原蛋白正確折疊。其中，目的基因片段包括Den-Ag5的編碼序列、Den-Agl的編碼序列和Den_Ag2的編碼序列，Den-Agl的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；所述Den-Ag5的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。步驟二、設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并通過PCR分別擴(kuò)增步驟一種三個(gè)不同的目的基因片段。其中，所述步驟二中采用的PCR擴(kuò)增引物序列如下擴(kuò)增SEQ ID NO. 1核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQID NO. 7>
反向引物ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQ ID NO. 8> ；擴(kuò)增SEQ ID N0. 3核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQID N0. 9>，反向引物ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQID NO. 10> ；擴(kuò)增SEQ ID N0. 5核苷酸序列的引物正向引物CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQID Ν0· 11 >，反向引物ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQID Ν0· 12>。步驟三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建含有所述目的基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒；步驟四、將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達(dá)宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)所述表達(dá)宿主細(xì)胞使其產(chǎn)生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白。具體實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)時(shí)，上述步驟一中，參考登革病毒登革2型病毒NGC株基因組序列， 利用DNAstar及ANTHEPR0T軟件對(duì)其編碼蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性進(jìn)行詳細(xì)分析，并參考Genbank中的序列信息，對(duì)預(yù)測的抗原表位進(jìn)行比對(duì)，初步篩選可能的抗原性片段5段。步驟二中，根據(jù)步驟一種所選的抗原性片段，并結(jié)合多肽結(jié)構(gòu)中需要的延伸區(qū)段， 并通過優(yōu)化設(shè)計(jì)與各區(qū)段對(duì)應(yīng)的引物，通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因片段，從而使由延伸區(qū)段編碼柔性臂能夠消除表達(dá)載體的融合蛋白對(duì)多肽表位的掩蓋，使表達(dá)的重組抗原蛋白正確折疊。為此，在本步驟的優(yōu)選過程中，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物5對(duì)，如表一所示表一抗原片段克隆所用引物序列
引物名稱序列(5’to3’)_
DenAgl-R ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT DenAg2-F
CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT
DenAg2-R
ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG
DenAg3-F
CGGAATTCAAAACGGAAGCCAAACAGCCTG
DenAg3-R
ACGTGTCGACCTTCTTGGGATCCTAAAACAAC
DenAg4-F
CGGAATTC ATGCATACAGCACTCACAGG
DenAg4-R
ACGTGTCGACCTGTGCACATGGAGTATGAC
DenAg5-F
CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA DenAg5-R ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC其中，引物設(shè)計(jì)過程為根據(jù)抗原性分析結(jié)果設(shè)計(jì)表一中所述的引物5對(duì)，并分別于引物5’末端及3’末端導(dǎo)入BamH I及Hind III酶切位點(diǎn)。作為獲取目的基因片度的預(yù)先步驟，還需反轉(zhuǎn)錄登革病毒的基因組，該反轉(zhuǎn)錄過程為登革2型病毒NGC株經(jīng)C6/36細(xì)胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)，采用hvitrogen的Trizol試劑提取病毒RNA，采用常規(guī)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA。而后按如下條件進(jìn)行PCR:取cDNA2 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，正向引物、反向引物各2μ l、dNTP 8 μ l.Taq 2U，補(bǔ)水至總體積50 μ 1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)為:95°C 5min， 然后94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 60s，共32次循環(huán)，最后一次循環(huán)后72°C延伸7min，擴(kuò)增片段經(jīng)純化、回收后，-20°C保存?zhèn)溆?。步驟三中、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建含有目的基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述原核表達(dá)載體為PET3M或 PMAL ch原核表達(dá)載體，所述表達(dá)宿主細(xì)胞為大腸桿菌。本步驟具體如下酶切各取IOul經(jīng)純化的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別加入Buffer K 3ul，BamH I及Hind III 各1111(10扔，滅菌去離子水15111，371酶切過夜。另取pET3h或pMAL dx表達(dá)載體質(zhì)粒 2ug JnABuffer K 3ul，BamH I 及 Hind III 各 Iul (IOU)，滅菌去離子水補(bǔ)至 30ul，37°C酶切過夜。酶切產(chǎn)物分別用TaKaRa公司凝膠回收試劑盒純化回收。連接取2ul經(jīng)以上處理的ρΕΤ3^ι或pMAL c2x載體(約130ng)，5ul酶切目的片段(約40ng)，45°C加熱5min，以使退火的粘端解鏈，立即冰浴lOsec，加入T4DNA連接酶 0.5U，連接酶Buffer Iul，用滅菌四餾水補(bǔ)至IOul，16°C連接過夜。取重組質(zhì)粒5ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌Dffia，加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基300ul，37°C復(fù)蘇45min后，取IOOul涂氨芐青霉素(100ug/ml)平皿，37°C培養(yǎng) 18h。重組子鑒定挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，PCR反應(yīng)體10XPCR緩沖液2 μ 1， 正向引物、反向引物各1μ l、dNTP 0.4 μ l.Taq 2U，補(bǔ)水至總體積20 μ 1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件同步驟二，陽性克隆送生物工程(上海)有限公司測序確認(rèn)。經(jīng)測序確認(rèn)獲正確重組表達(dá)質(zhì)粒5組，并提取質(zhì)粒，并-20°C保存?zhèn)溆谩２襟E四中、將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達(dá)宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)表達(dá)宿主細(xì)胞， 并檢測其重組蛋白表達(dá)情況，在本實(shí)施例中本步驟具體為挑經(jīng)轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體的表達(dá)宿主菌單菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)4h，當(dāng)OD值達(dá)0. 6時(shí)，吸取未誘導(dǎo)對(duì)照菌1ml，并向剩余菌中加入誘導(dǎo)物IPTG使其終濃度為0. 5mmol/L，于37°C振蕩培養(yǎng) 4h，冰浴5min后，4°C、12000g離心^iin收菌，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測，參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，配制好反應(yīng)液體，積層膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，積層膠恒流10mA，分離膠恒流 25mA電泳，電泳完畢后，考馬斯亮藍(lán)染色，驗(yàn)證重組蛋白表達(dá)情況。經(jīng)本步實(shí)驗(yàn)，所構(gòu)建的5 個(gè)重組表達(dá)載體均獲高效表達(dá)。而后、對(duì)所獲重組表達(dá)抗原進(jìn)行western blot分析，以驗(yàn)證其免疫反應(yīng)原性及免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，在本實(shí)施例中本步驟具體為=SDS-PAGE電泳同步驟四，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黃熱病毒、流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體1 5000稀釋，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(western-blot)，驗(yàn)證表達(dá)抗原的反應(yīng)特異性，獲能高效表達(dá)登革病毒特異性重組抗原的基因工程菌株五株，結(jié)果如圖一所示。另外，通過此高效表達(dá)菌株進(jìn)行上述重組抗原蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，獲取適合用于ELISA實(shí)驗(yàn)的重組抗原蛋白，本實(shí)施例中本步驟具體為表達(dá)菌過夜培養(yǎng)物IOml接種 IL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/ml氨芐青霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)2 3小時(shí)，待OD值達(dá)0.6時(shí)， 加入IPTG至終濃度0. 5mM,繼續(xù)37°C振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后，離心收獲細(xì)菌，并用PBS洗滌兩次，50mlPBS重懸，超聲波破碎細(xì)菌后，采用NEB公司Amylose Resin親和層析柱純化純化重組蛋白，核酸蛋白分析儀測定其濃度分別為Den-Agl3523l·! g/ml、Den-Ag21627 μ g/ml, Den-Ag51872y g/ml。如圖1所示，進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡，參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，配制好反應(yīng)液體，積層膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，積層膠恒流10mA，分離膠恒流25mA 電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黃熱病毒、流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體1 5000稀釋，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡 (western-blot)，驗(yàn)證表達(dá)抗原的反應(yīng)特異性，，并獲得能高效表達(dá)登革病毒特異性重組抗原的基因工程菌株。而后通過此高效表達(dá)菌株進(jìn)行上述重組抗原蛋白的表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)，獲取適合用于ELISA實(shí)驗(yàn)的重組抗原蛋白。實(shí)施例2、重組抗原蛋白的包被實(shí)驗(yàn)在本實(shí)施例中需要對(duì)本發(fā)明的重組抗原蛋白的包被條件和濃度進(jìn)行優(yōu)化 ’為了達(dá)到此目的還需要先對(duì)試劑盒中ELISA反應(yīng)液成分進(jìn)行說明酶結(jié)合物工作液辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG多克隆抗體；陽性對(duì)照登革熱患者血清。
陰性對(duì)照登革病毒抗體陰性人血清。樣品稀釋液10mmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有1 % BSA，0. 05%Tween_20和 lmg/L慶大霉素；濃縮洗滌液0. lmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有1 %胎牛血清，0. 5 % Tween-20和20mg/L慶大霉素；顯色液A :0. 02% H202 ；用0. IM檸檬酸_0. 2M磷酸氫二鈉，PH4. 5 5. 0稀釋。顯色液B 0. 4%o TMB-HCl 用50mM檸檬酸鈉，濃HCl調(diào)PH值為2. 8的溶液溶解。終止液2MH2SO4將上述實(shí)施例1中獲取的純化重組抗原蛋白Den-Agl、Den_Ag2、Den_Ag5純化抗原等量混合后，抗原分別以20、10、5、2. 5,1.25,0. 625,0. 3125ug/ml濃度(指3種蛋白混合后的總濃度)包被酶聯(lián)板，每孔用量100ul，4°C包被過夜，PBST洗滌3分鐘，拍干，5% BSA 37°C封閉2小時(shí)，鼠抗登革病毒多克隆抗體1 5000倍稀釋后取IOOul加入反應(yīng)孔，37°C 反應(yīng)1小時(shí)，PBST洗滌4次，每次1分鐘，拍干，HRP標(biāo)記抗鼠二抗1 10000倍稀釋后，每孔加入IOOul，37°C反應(yīng)40分鐘，PBST洗滌4次，每次1分鐘，拍干，每孔加入TMB底物溶液 lOOul，37°C反應(yīng)15分鐘，加入50ul 2M H2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定OD 值，如表二所示，結(jié)果顯示在包被濃度2. 5 20ug/ml范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)OD值無明顯差別，最終選擇抗原包被濃度為10ug/ml。表二抗原包被濃度實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白包括具有如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的Den-Ag5，所述Den_Ag5的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白還包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的Den-Agl和/或具有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列Den-Ag2 ；所述Den-Agl的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-Agl、Den-Ag2等量混合而成。
4.一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟一、選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達(dá)載體的融合蛋白對(duì)多肽表位的掩蓋，使表達(dá)的重組抗原蛋白正確折疊；二、設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并通過PCR擴(kuò)增所述目的基因片段；三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建含有所述目的基因片段的重組表達(dá)質(zhì)粒；四、將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達(dá)宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)所述表達(dá)宿主細(xì)胞使其產(chǎn)生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述目的基因片段還包括如SEQID NO. 1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的Den-Agl ；如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID而.4所示氨基酸序列的0611-六82。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二中采用的PCR擴(kuò)增引物序列如下擴(kuò)增SEQ ID NO. 1核苷酸序列的引物 正向引物CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQ ID NO. 7> 反向引物ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAIXSEQ ID NO. 8> ； 擴(kuò)增SEQ ID NO. 3核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQ ID NO. 9>， 反向引物ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQ ID NO. 10> ； 擴(kuò)增SEQ ID NO. 5核苷酸序列的引物 正向引物CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQ ID NO. 11>， 反向引物ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQ ID NO. 12>。
7.一種登革病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應(yīng)液，其特征在于所述抗體檢測板上包被有檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白為權(quán)利要求1-3 中任意一項(xiàng)中所述的重組抗原蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中ELISA反應(yīng)液包括酶結(jié)合物工作液，陽性對(duì)照，陰性對(duì)照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液， 酶結(jié)合物工作液，陽性對(duì)照為登革病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照為登革病毒抗體陰性血清，所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟一、以權(quán)利要求4-6中任意一項(xiàng)所述的制備方法制備重組抗原蛋白；二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯(lián)板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級(jí)濃度包被酶聯(lián)板，每孔50-200ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉1-3小時(shí)，晾干后即得到所述抗體檢測板；所述重組抗體為如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)中所述的重組抗原蛋白。
10.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的重組抗原蛋白在制備診斷登革病毒試劑盒中的運(yùn)用。
全文摘要
一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白是以登革病毒的原核表達(dá)抗原Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2等量混合而成。本發(fā)明還公開了該重組抗原蛋白的制備方法。另外，本發(fā)明公開的登革病毒的檢測試劑盒中包括抗體檢測板和ELISA反應(yīng)液，該抗體檢測板上包被有以登革病毒的原核表達(dá)抗原Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2等量混合而成重組抗原蛋白。本發(fā)明的重組抗原蛋白具有特異性強(qiáng)、親和力高的優(yōu)點(diǎn)，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學(xué)交叉反應(yīng)，而與登革病毒抗體具有極高親和力，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測登革病毒抗體，從而診斷登革病毒的感染情況。
文檔編號(hào)C07K14/18GK102432676SQ201110300230
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者于德憲, 任瑞文, 唐博恒, 張培, 洪文艷 申請(qǐng)人:中國人民解放軍廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心