專利名稱：一種檢測(cè)登革病毒ns1抗原的免疫診斷試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種醫(yī)用配制品，特別是用于診斷登革病毒的試劑盒。

背景技術(shù)：
登革熱是目前僅次于瘧疾的重要蟲媒性傳染病，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)；由于旅游業(yè)和國際貿(mào)易的發(fā)展、生態(tài)環(huán)境的改變、全球人口的增長并向城市集中化以及全球氣候變暖等因素的改變，登革病毒的傳播已不再局限于部分地區(qū)，而是隨著人口的流動(dòng)在全球大部分地區(qū)迅速傳播。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年發(fā)生登革病毒感染患者超過1億人，其中50萬人發(fā)展成為登革出血熱，每年死亡人數(shù)高達(dá)3萬人。目前，全球有將近25億的人口生活在登革熱的疫區(qū)中，備受登革病毒感染的威脅。總而言之，登革病毒所引起的登革熱和登革出血熱已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)的一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
登革病毒有4個(gè)血清型，分別為I型、II型、III型和IV型(DV1、DV2、DV3和DV4)。任何一種血清型的感染均可引起一系列的臨床癥狀，包括隱匿性感染、典型登革熱以及導(dǎo)致高死亡率發(fā)生的登革出血熱或登革休克綜合征。初次感染登革病毒對(duì)于同型病毒的再次感染可產(chǎn)生長久的免疫力，但對(duì)其他血清型的再次感染僅能產(chǎn)生部分而且短暫的免疫保護(hù)作用。由于存在抗體依賴的病毒感染增強(qiáng)作用，異型登革病毒再次感染是發(fā)生登革出血熱或登革休克綜合征的主要危險(xiǎn)因素。由于在一個(gè)地區(qū)存在不同血清型登革病毒的交替流行，人群普遍易感，這就更增加了登革出血熱發(fā)生的可能性。
目前，具有保護(hù)性的登革病毒疫苗尚未研制成功，臨床上對(duì)于登革病毒的感染亦未有特異性的治療措施。但實(shí)踐表明及時(shí)采取臨床救治措施可以大大減少登革出血熱的發(fā)病率和死亡率，因此登革熱的治療很大程度上取決于早期感染的診斷。由于多數(shù)登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、寒戰(zhàn)等流感樣癥狀，難以和其它發(fā)熱疾病和出血熱疾病區(qū)分，因此，登革病毒感染的確診依賴于實(shí)驗(yàn)室的診斷手段。目前，登革病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)。其中病毒分離是登革病毒感染診斷和血清型鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法費(fèi)時(shí)而且對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的條件要求較高。盡管病毒核酸的檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的病毒分離法更靈敏、快速，但分子診斷操作相對(duì)繁瑣，對(duì)技術(shù)水平要求較高，并較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果，同時(shí)由于毒株變異、潛在突變等序列改變也可能引起假陰性結(jié)果。而抗體檢測(cè)試劑不能用于早期診斷，而且由于4個(gè)血清型登革病毒之間以及與其它黃病毒存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，特別是接種乙型腦炎病毒、黃熱病毒疫苗的人群易發(fā)生抗體假陽性反應(yīng)結(jié)果。因此，建立一種快速、可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)室診斷登革病毒以及各血清型別感染的早期檢測(cè)試劑顯得非常必要。
登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural protein 1，NS1)是一種相對(duì)保守的糖蛋白，分子量為45～50kDa，有膜型和分泌型兩種形式，在感染細(xì)胞中高度表達(dá)，在登革病毒的研究中已經(jīng)將它作為診斷登革熱的靶抗原。研究發(fā)現(xiàn)在登革熱患者的早期血中存在高濃度的NS1循環(huán)抗原，因此檢測(cè)急性期病人血清中的循環(huán)NS1抗原可用于早期診斷登革病毒感染。目前已報(bào)道了幾種基于多克隆抗體的檢測(cè)登革病毒NS1的抗原捕獲ELISA法，但是這些方法都是在多克隆抗體的基礎(chǔ)上建立的，在不同批次的抗血清中存在很大差異，難以重復(fù)和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化；而利用抗NS1的單克隆抗體來檢測(cè)登革病毒的商品化試劑盒只有兩種Pan-EDengue Early ELISA test kit，Panbio，Queensland，Australia；PLATELIATM DENGUE NS1 AG，Bio-Rad，F(xiàn)rance，該試劑盒含有抗I～I(xiàn)V型登革病毒NS1的單克隆抗體，通過ELISA方法來實(shí)現(xiàn)登革病毒感染的早期診斷，其敏感度、特異性和穩(wěn)定性都比較好。但本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，試劑盒(Pan-E Dengue Early ELISA test kit，Panbio，Queensland，Australia)對(duì)I～I(xiàn)V型的登革病毒的敏感度不同，尤其對(duì)III型和IV型登革病毒檢測(cè)的敏感性很低，而早期感染登革病毒的患者血液樣本中的病毒含量相對(duì)較低，用該試劑盒檢測(cè)III型和IV型登革病毒的感染有可能會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，不利于臨床實(shí)踐應(yīng)用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提高檢測(cè)登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒的靈敏度，縮小登革病毒四個(gè)血清型NS1抗原檢測(cè)敏感度間的差異性。
本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是 一種檢測(cè)登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括捕獲抗體和與標(biāo)記物結(jié)合的檢測(cè)抗體，其特征在于所述的捕獲抗體由質(zhì)量比為1∶1∶1的單抗2E8A5、單抗DV2-M6和單抗4B14A1組成，所述的檢測(cè)抗體是單抗3B1A15。
本發(fā)明試劑盒中，所述的單抗組合2E8A5、DV2-M6、4B14A1和單抗3B1A15均是免疫球蛋白，其中單抗2E8A5能同時(shí)與IV和III型登革病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural protein1，NS1)結(jié)合，屬IgG1，由保藏號(hào)為CCTCC-C200855的雜交瘤細(xì)胞株分泌；單抗4B14A1能同時(shí)與I型和III型登革病毒NS1蛋白結(jié)合，屬IgG1，由保藏號(hào)為CCTCC-C200857的雜交瘤細(xì)胞株分泌；單抗DV2-M6能特異性結(jié)合II型登革病毒NS1蛋白，屬IgG1，由保藏號(hào)為CCTCC-C200736的雜交瘤細(xì)胞株分泌，記載于國知局2008年7月23日公布的發(fā)明專利“一種檢測(cè)II型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒”(申請(qǐng)?zhí)枮?00810026250.7)；單抗3B1A15能同時(shí)與四個(gè)血清型登革病毒NS1蛋白結(jié)合，屬IgG2a，由保藏號(hào)為CCTCC-C200859的雜交瘤細(xì)胞株分泌。其中，保藏號(hào)為CCTCC-C200855的雜交瘤細(xì)胞株、保藏號(hào)為CCTCC-C200857的雜交瘤細(xì)胞株和保藏號(hào)為CCTCC-C200859的雜交瘤細(xì)胞株均于2008年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為中國武漢大學(xué))。
本發(fā)明試劑盒中，所述的標(biāo)記物可以是生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金、熒光素等，當(dāng)本發(fā)明所述的檢測(cè)抗體上結(jié)合的標(biāo)記物為生物素時(shí)，本發(fā)明試劑盒還含有標(biāo)記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的親和素。所述的親和素能與生物素以1∶4的比例結(jié)合，起到放大檢測(cè)信號(hào)的作用，進(jìn)一步提高敏感度。
當(dāng)所述的標(biāo)記物為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶時(shí)，本發(fā)明試劑盒是一種基于雙抗體夾心ELISA方法的酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，由包被了單抗組合2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、標(biāo)記了辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的單抗3B1A15、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、濃縮洗液、顯色液和終止液組成。其中所述的顯色液中含有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的底物。該試劑盒對(duì)I型和II型登革病毒的敏感性均為49PFU/ml，是商品化進(jìn)口試劑盒Pan-E Dengue Early ELISA test kit的4倍；對(duì)III型和IV型登革病毒的敏感性分別為49PFU/ml和781PFU/ml，為進(jìn)口試劑盒Pan-E Dengue Early ELISA test kit的32倍。
本發(fā)明所用的捕獲抗體和檢測(cè)抗體3B1A15是從一組抗登革病毒的NS1蛋白的單克隆抗體中篩選出來的，其中，捕獲抗體是一組由單抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1組成的多克隆抗體，分別結(jié)合不同血清型的登革病毒NS1蛋白，不僅有效地提高了登革病毒檢測(cè)的特異性和敏感性，更保證了試劑盒的穩(wěn)定性，使得該試劑盒能更準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出四個(gè)血清型登革病毒，而與其他黃病毒屬，如乙型腦炎病毒、黃熱病毒無交叉反應(yīng)，且對(duì)四個(gè)血清型登革病毒都具有很高的敏感度，可有效降低臨床應(yīng)用中的漏檢現(xiàn)象。本發(fā)明試劑盒既克服了多克隆抗血清難以重復(fù)和實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)化的缺點(diǎn)，同時(shí)又兼有多克隆抗體的放大效應(yīng)，提高了檢測(cè)的敏感性，對(duì)登革病毒四個(gè)血清型NS1蛋白檢測(cè)的敏感性均高于國外同類產(chǎn)品。



圖1是單抗2E8A5、4B14A1、DV2-M6和3B1A15的免疫印跡圖，其中A、B、C、D顯示的是重組DV1NS1、DV2NS1、DV3NS1、DV4NS1蛋白與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的反應(yīng)；E、F、G和H分別顯示的是天然DV1、DV2、DV3和DV4病毒中的NS1蛋白與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的反應(yīng)，條帶1為雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6培養(yǎng)上清；條帶2為雜交瘤細(xì)胞株2E8A5培養(yǎng)上清；條帶3為雜交瘤細(xì)胞株4B14A1培養(yǎng)上清；條帶4為雜交瘤細(xì)胞株3B1A15培養(yǎng)上清；條帶5為無關(guān)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。

具體實(shí)施例方式 下面通過具體的例子和實(shí)驗(yàn)報(bào)告進(jìn)一步闡明本發(fā)明的試劑盒 1、所述的單抗2E8A5、4B14A1、DV2-M6和3B1A15的制備方法和鑒定結(jié)果 (1)免疫抗原的制備 本發(fā)明用于制備單克隆抗體的免疫原為基因重組DV2NS1、DV3NS1、DV4NS1蛋白和已滅活天然的病毒抗原?；蛑亟MDVNS1蛋白是用一種攜帶DVNS1基因的工程菌株進(jìn)行制備的，其制備按常規(guī)方法進(jìn)行，經(jīng)用鎳一次氮基三醋酸金屬親和層析的方法進(jìn)行純化獲得NS1抗原，詳細(xì)的制備方法可參照使用手冊(cè)。將NS1蛋白純化后，以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。Western blot對(duì)純化的重組蛋白鑒定結(jié)果顯示，小鼠抗his mAb在分子量約45KDa處出現(xiàn)特異性的反應(yīng)條帶，與預(yù)測(cè)的DVNS1分子量大小一致。已滅活天然的病毒抗原，是從DV2、DV3、DV4感染的病毒宿主細(xì)胞(C6/36，一種白蚊伊蚊細(xì)胞)獲得。
(2)免疫小鼠(三種免疫方案) 第一種免疫方案取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積DV2NS1抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐劑與天然的DV2抗原或重組的DV2NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV2NS1抗原100μg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
第二種免疫方案取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積DV3NS1抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐劑與天然的DV3抗原或重組的DV3NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV3NS1抗原100μg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
第三種免疫方案取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積DV4NS1抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射30μg，以后每10天以弗氏不完全佐劑與天然的DV4抗原或重組的DV4NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射DV4NS1抗原100μg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
(3)雜交瘤細(xì)胞的制備和鑒定 加強(qiáng)免疫3天后，無菌操作取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS-1按10∶1的比例混合，45％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)作用下進(jìn)行融合。按下述步驟將聚乙二醇溶液加入細(xì)胞。在37℃水浴中，在1min內(nèi)緩慢加入1.0ml PEG，邊加邊輕輕搖勻，分別于1min、2min、3min、4min、5min內(nèi)加1ml、2ml、3ml、4ml、5ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)基終止融合，最后加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫800rpm離心5min，棄上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕懸起細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液加入6塊96孔培養(yǎng)板上，在37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日于融合細(xì)胞中加入120μl 2×HAT篩選培養(yǎng)基。以后每3天用1×HAT培養(yǎng)基換液一次，當(dāng)克隆長至占孔底面積的1/10時(shí)，取培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA法用重組的DVNS1蛋白和DV病毒進(jìn)行雙篩選。陽性克隆轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)ELISA和免疫熒光(DV感染細(xì)胞抗原片)復(fù)測(cè)仍為強(qiáng)陽性的克隆用有限稀釋法進(jìn)行克隆化?？寺』?～3次至陽性率達(dá)100％，選擇分泌抗體效價(jià)高的細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)后置液氮保存，記為雜交瘤細(xì)胞株2E8A5、4B14A1、3B1A15和雜交瘤細(xì)胞株DV2-M6分別于2008年12月9號(hào)和2007年11月29日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，并收到保藏登記號(hào)為CCTCC-C200855、CCTCC-C200857、CCTCC-C200859和CCTCC-C200736。
(4)抗DVNS1蛋白單克隆抗體亞類檢測(cè) 采用間接ELISA，DV1NS1、DV2NS1、DV3NS1和DV4NS1抗原包被的微孔板，封閉后與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育，再分別與1∶1000倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球蛋白反應(yīng)，其中包括兔抗小鼠IgG1(美國ZYMED LABORATORIES，INC，目錄號(hào)61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目錄號(hào)61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目錄號(hào)61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目錄號(hào)61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目錄號(hào)61-6820)。檢測(cè)結(jié)果顯示，本專利發(fā)明的4株單克隆抗體中3B1A15為IgG2a陽性；其余3株單克隆抗體均為IgG1陽性。
(5)單克隆抗體腹水制備和純化 腹水制備采用體內(nèi)誘生法制備本發(fā)明中單克隆抗體，即在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞制備腹水。簡述如下每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml弗氏不完全佐劑(Sigma公司)，使瘤細(xì)胞能以腹水瘤形式在腹腔內(nèi)生長。大約1～2周后，將2×106個(gè)對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞懸浮于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔。約1～2周后，用7號(hào)針頭放腹水，離心后收集腹水上清，立即加入疊氮鈉至終濃度為0.1％，存放于4℃?zhèn)溆谩?br> 單抗純化采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水中的抗體，操作方法如下腹水用60mM、pH5.0醋酸緩沖液稀釋2倍，室溫下于30分鐘內(nèi)邊攪拌邊逐滴緩慢加入辛酸，為每毫升稀釋前腹水加33μl辛酸，出現(xiàn)大量沉淀，4℃靜置2小時(shí)，10000g，4℃離心30分鐘，取上清，加入1/10體積的pH7.4100mM磷酸鹽緩沖液，并用1N氫氧化鈉調(diào)pH值至7.4，冰浴攪拌下緩慢加入硫酸銨，為每毫升液體加入0.277硫酸銨即為45％飽和度，4℃靜置過夜，10000g，4℃離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于適量10mM磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4℃透析過夜，換液三次。以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE，Cat，No.ED62976)定量。測(cè)定濃度后的抗體加入終濃度50％的甘油于-80℃保存。
(6)單克隆抗體的特異性鑒定 a.間接ELISA法鑒定單克隆抗體的特異性 分別用四個(gè)血清型重組DV NS1抗原和天然的DV抗原包被微孔板，按照常規(guī)的間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。即在包被的微孔板中加入本專利發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37℃孵育1h，加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB顯色液室溫避光顯色10min，加1M H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)450nm吸光值(A450)。表1結(jié)果顯示本專利發(fā)明的單克隆抗體DV2-M6為DV2NS1的特異性單抗；與其它三型登革病毒均無交叉反應(yīng)；單克隆抗體2E8A5、、4B14A1和3B1A15為DV NS1的交叉單抗。
表1 DVNS1單克隆抗體與重組的DVNS1抗原和天然的DV抗原反應(yīng)間接ELISA結(jié)果
b.間接免疫熒光法鑒定單克隆抗體的特異性 分別用DV1、DV2、DV3和DV4感染C6/36細(xì)胞，當(dāng)有2/3細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗細(xì)胞二遍，然后將細(xì)胞滴于無菌干燥的玻片上，干燥后，制備成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分鐘后吹干，分別與陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG孵育，并設(shè)立未感染病毒的C6/36細(xì)胞抗原片作為陰性對(duì)照，最后用0.25％的伊文氏藍(lán)染色后，熒光顯微鏡下觀察熒光圖像，以熒光的強(qiáng)度和染色形態(tài)進(jìn)行結(jié)果判定，檢測(cè)抗體強(qiáng)度以(+～++++)計(jì)為陽性，抗體強(qiáng)度(±)和(-)計(jì)為陰性。如表2結(jié)果顯示本專利發(fā)明的單克隆抗體4D41A6與II型登革病毒結(jié)合的特異性單抗；2E8A5與III型和IV型登革病毒同時(shí)結(jié)合的交叉性單抗；4B14A1與I型和III型登革病毒同時(shí)結(jié)合的交叉單抗；而3B1A15與4個(gè)血清型的登革病毒NS1蛋白同時(shí)結(jié)合的交叉單抗。
表2 DVNS1單克隆抗體的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
c.免疫印跡鑒定單克隆抗體的特異性 將滅活DV培養(yǎng)液或重組的DV NS1蛋白，用2×SDS加樣緩沖液稀釋一倍，將樣品加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳分離蛋白質(zhì)，通過電洗脫使在凝膠上分離出來的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)印膜用含7％脫脂奶和3％BSA的10mM PBS于4℃封閉24小時(shí)，將轉(zhuǎn)印膜裝在專門的反應(yīng)板中，分別加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用含有0.5％Tween 20的10mM PBS洗滌膜后，加入1∶500倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)1小時(shí)，用同樣的洗滌液洗滌膜后，DAB顯色后，用去離子水終止顯色。
免疫印跡結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明的特異性單克隆抗體DV2-M6與重組DV2NS1蛋白和滅活DV2培養(yǎng)液在分子量為45千道爾頓可見一條很強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合帶，與預(yù)測(cè)分子量相一致；單克隆抗體2E8A5與重組DV3NS1、DV4NS1蛋白和滅活DV4培養(yǎng)液在分子量為45千道爾頓可見一條很強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合帶，與預(yù)測(cè)分子量相一致；單克隆抗體4B14A1與重組DV1NS1、DV3NS1蛋白和滅火DV3培養(yǎng)液在分子量為45千道爾頓可見一條很強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合帶，與預(yù)測(cè)分子量相一致；交叉單抗3B1A15與4個(gè)血清型的重組DVNS1蛋白和滅火的DV培養(yǎng)液在分子量為45千道爾頓可見一條很強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合帶，與預(yù)測(cè)分子量相一致；無關(guān)單克隆抗體與各抗原均不產(chǎn)生反應(yīng)。
2、本發(fā)明試劑盒的組成及制備 例1 (1)所用試劑的配制 a.樣品處理液由樣品處理液A和樣品處理液B組成，其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)； b.濃縮洗液含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高壓滅菌后，加入20ml Tween-20攪勻，使用時(shí)20倍稀釋； c.陽性對(duì)照物重組DVNS1蛋白1∶1000稀釋液； d.陰性對(duì)照物含0.1％Tween-2的10mM PH7.4PBS，其制備方法是將4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4·12H2O，175.3gNaCl溶于水中并定量至1L，在15磅壓力下高壓滅菌20min，20倍稀釋后加入0.1％Tween-20； e.顯色液由顯色液A和B組成，使用時(shí)取二者等量混勻使用。其中顯色液A、B的組成成分如下 顯色液A 將0.89g檸檬酸和0.16g EDTA二鈉溶于1000ml水中，115℃高壓30min，降至90℃后加TMB 0.25g，搖勻于4℃閉光保存； 顯色液B 將9.33g檸檬酸和14.6g EDTA二鈉溶于1000ml水中，115℃高壓30min后，降至90℃后加0.75％過氧化氫尿素12.8ml，搖勻于4℃閉光保存； f.終止液1MH2SO4。
(2)所述包被捕獲抗體的微孔反應(yīng)板的制備方法將本發(fā)明單抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1用10mM pH7.6的磷酸鹽緩沖液稀釋至每株單抗的終濃度為6μg/ml，用150μl/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4℃過夜。拍干后，每孔加入300μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封閉液，于4℃過夜以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。甩干板條，真空干燥12～24h，用鋁膜袋真空包裝4℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)所述辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗3B1A15的制備方法 采用改良過碘酸鈉法，操作方法如下將5mg HRP攪拌溶解于1mL雙蒸水中，加入0.2mL新配0.1M過碘酸鈉避光室溫?cái)嚢?0min，置1mM pH4.4醋酸鈉緩沖液中，4℃透析過夜；次日加入0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液使PH值達(dá)9.0～9.5后，加入到預(yù)先調(diào)節(jié)pH至9.5的抗體(10mg)中，在室溫避光輕輕攪拌2～3小時(shí)，然后加入100μl新配4mg/mL硼氫化鈉，4℃避光輕攪過夜；次日將過夜的抗體溶液用1×PBS稀釋5～10倍，冰浴攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨(硫酸銨用前先用氨水調(diào)pH至7.4)，置4℃避光過夜；12000rpm 4℃離心30min，棄上清，沉淀溶于適量1×PBS緩沖液，并置1×PBS中4℃透析過夜，換液三次。收集結(jié)合物加入終濃度50％的2％BSA甘油-PBS保護(hù)劑，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，即為工作液。
3、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)血清樣品中的登革病毒NS1抗原 (1)使用方法 取待測(cè)的樣品50μl，加入樣品處理液A 50μl，混勻后37℃作用1h，再加樣品處理液B 50μl混勻，取100μl加入多克隆抗體(2E8A5、DV2-M6和4B14A1)包被的聚苯乙烯96孔微量測(cè)試板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，37℃溫育1h，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板6次后，加入1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的單抗3B1A15，100μl/孔，37℃溫育30min，同上洗板8次后，加顯色液(顯色液A和B等量混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，100μl/孔，室溫避光顯色10min后，加入終止液，100μl/孔，終止反應(yīng)。
(2)結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于450nm波長測(cè)定吸光度(A值)。陽性對(duì)照平均值≥0.50，陰性對(duì)照平均值≤0.10，實(shí)驗(yàn)成立。樣品A值≥陰性對(duì)照A值平均值×2.1，則判為陽性，反之為陰性。
(3)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)相關(guān)病毒的特異性和靈敏度分析 a.靈敏度分析 通過對(duì)DV1、DV2、DV3、DV4進(jìn)行空斑實(shí)驗(yàn)確定病毒滴度分別為2.6×105PFU/mL、6.88×104PFU/mL、2.37×105PFU/mL、7.84×105PFU/mL。采用上述建立的方法檢測(cè)滅活的DV1、DV2、DV3、DV4，從1×105開始倍比稀釋多個(gè)梯度進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以檢測(cè)四個(gè)血清型DV NS1抗原的商品化試劑盒“pan-E DENGUE EARLY ELISA”(Panbio，Australia)進(jìn)行同步檢測(cè)比較，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)DV1、DV2、DV3培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度高達(dá)49PFU/ml；對(duì)DV4培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度為782PFU/ml；而對(duì)其他病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，如表3所示。商品化的pan-E DENGUE EARLY ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)四個(gè)血清型的DV培養(yǎng)上清的檢測(cè)敏感性不同，詳見表4結(jié)果。pan-E DENGUEEARLY ELISA試劑盒對(duì)DV1、DV2培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度均為195PFU/ml；對(duì)DV3培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度為1563PFU/ml；對(duì)DV4培養(yǎng)上清的檢測(cè)靈敏度為25000PFU/ml；明顯低于本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)4個(gè)血清型登革病毒培養(yǎng)上清的靈敏度。
表3 本發(fā)明試劑盒檢測(cè)四個(gè)血清型DV培養(yǎng)上清結(jié)果
表注此試劑盒的結(jié)果判定如下樣品檢測(cè)值≥陰性對(duì)照平均值的2.1倍(計(jì)算為0.062×2.1＝0.13)為陽性，反之為陰性。
表4 進(jìn)口試劑盒pan-E DENGUE EARLY ELISA檢測(cè)四個(gè)血清型DV培養(yǎng)上清結(jié)果
表注此試劑盒的結(jié)果判定如下顯示值＜9.0為陰性，顯示值9.0-11.0為可疑陽性，顯示值＞11.0為陽性。
b.特異性分析 用梯度稀釋的四個(gè)血清型登革病毒培養(yǎng)上清及乙腦病毒和黃熱病毒培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5顯示，本發(fā)明試劑盒僅特異地檢測(cè)4個(gè)血清型登革病毒培養(yǎng)上清，與其它黃病毒屬的病毒如乙腦病毒及黃熱病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)。說明建立的雙抗體夾心抗原捕獲ELISA檢測(cè)具有登革病毒特異性。
表5 本發(fā)明試劑盒檢測(cè)登革病毒的特異性鑒定
表注此試劑盒的結(jié)果判定如下樣品檢測(cè)值≥陰性對(duì)照平均值的2.1倍(計(jì)算為0.062×2.1＝0.13)為陽性，反之為陰性。
4、臨床試驗(yàn) 首先將臨床血清標(biāo)本用1.5M甘氨酸(PH2.8)進(jìn)行預(yù)處理使NS1與血清中的抗體形成的復(fù)合物解離，從而釋放游離的NS1抗原，再用1.5M Tris-Hcl(PH9.7)中和后用上述建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。
(1)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)正常人血清標(biāo)本 本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)了552例正常人血清，用此檢測(cè)結(jié)果確定本方法的臨界值。對(duì)檢測(cè)值進(jìn)行分析，計(jì)算得平均值為0.06，標(biāo)準(zhǔn)差為0.026，以平均值加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為本方法的檢測(cè)臨界值即0.06+0.026×3＝0.138，以大于或等于臨界值作為判斷檢測(cè)值陽性標(biāo)準(zhǔn)，552例正常人血清標(biāo)本檢測(cè)到1例為弱陽性(0.502)，可確定本方法的特異度為99.8％。
(2)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)DV1感染病人急性期血清 本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)了308例可能為DV1感染患者急性期血清，這些血清標(biāo)本經(jīng)MAC-ELISA確定為DV IgM/IgG抗體陽性，同時(shí)與商品化抗原檢測(cè)試劑盒“pan-E DENGUEEARLY ELISA”進(jìn)行比較。本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的這308例血清，其中陽性的有291例，陽性率達(dá)94.5％(291/308)，商品化試劑盒“pan-E DENGUE EARLY ELISA”檢測(cè)結(jié)果顯示，其中陽性的標(biāo)本為285例，陽性率為92.5％(285/308)。
表6 本發(fā)明試劑盒與pan-E DENGUE EARLY ELISA試劑盒檢測(cè)臨床標(biāo)本的比較
(3)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)臨床標(biāo)本的靈敏度分析 本發(fā)明試劑盒通過對(duì)27例經(jīng)梯度稀釋的DV1病人血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以商品化試劑盒“pan-E DENGUE EARLY ELISA”(Panbio，Australia)進(jìn)行同步檢測(cè)比較，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果表明，商品化試劑盒對(duì)DV1病人血清標(biāo)本檢測(cè)的最高稀釋度為1∶1280，而本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的最高稀釋度可達(dá)1∶5120，是商品化試劑盒的4倍，進(jìn)一步驗(yàn)證了前面檢測(cè)登革病毒培養(yǎng)上清的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表7)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩個(gè)試劑盒檢測(cè)DV1病人血清標(biāo)本的敏感性具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
表7 本發(fā)明試劑盒檢測(cè)臨床標(biāo)本的靈敏度分析
例2 1、本發(fā)明試劑盒由以下試劑組成 (1)包被抗體2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反應(yīng)板； (2)樣品處理液由樣品處理液A和樣品處理液B組成，其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)； (3)生物素標(biāo)記的單抗3B1A15； (4)辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，購自Zymed公司； (5)濃縮洗液含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高壓滅菌后，加入20ml Tween-20攪勻，使用時(shí)20倍稀釋； (6)陽性對(duì)照DVNS1抗原1∶1000稀釋液； (7)陰性對(duì)照含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高壓滅菌，20倍稀釋后加入0.1％Tween-20； (8)顯色液由顯色液A和B組成，使用時(shí)取二者等量混勻使用。其中顯色液A、B的組成成分如下 顯色液A 將0.89g檸檬酸和0.16g EDTA二鈉溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加TMB 0.25g，搖勻于4℃避光保存； 顯色液B 將9.33g檸檬酸和14.6g EDTA二鈉溶于1000ml水中，115℃30min后，降至90℃后加0.75％過氧化氫尿素12.8ml，搖勻于4℃避光保存； (9)終止液1M H2SO4。
上述試劑中，單抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1的制備方法、包被單抗組合2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反應(yīng)板的制備方法同例1；生物素標(biāo)記的單抗3B1A15的制備方法為將2.2mg生物素溶解于0.5ml蒸餾水中，取其30μl加入到1ml單抗DV2-M14(濃度為2mg/ml)中，4℃靜置2h后裝入透析袋中，于PBS中4℃透析過夜，換液三次。收集結(jié)合物加入終濃度50％甘油保護(hù)劑，最后用磷酸鹽緩沖液稀釋500倍，即為工作液。
2、使用方法 取待測(cè)的樣品50μl，加入樣品處理液A 50μl，混勻后置37℃1h，再加樣品處理液B 50μl混勻，加入單抗組合2E8A5、DV2-M6和4B14A1包被的聚苯乙烯96孔微量測(cè)試板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，37℃溫育1h，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板五次后，加入1∶500稀釋的生物素標(biāo)記的單抗3B1A15，100μl/孔，室溫30min，同上洗板五次后，加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，100μl/孔，室溫30min，同上洗板八次后加顯色液(顯色液A和B等量混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，100μl/孔，室溫避光10min后，加入終止液，100μl/孔，終止反應(yīng)。
3、結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于450nm波長測(cè)定吸光度(A值)。陽性對(duì)照平均值≥0.50，陰性對(duì)照平均值≤0.10，實(shí)驗(yàn)成立。樣品A值≥陰性對(duì)照A值平均值×2.1，則判為陽性，反之為陰性。
例3 1、本發(fā)明試劑盒由以下試劑組成 (1)包被單抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反應(yīng)板； (2)樣品處理液由樣品處理液A和樣品處理液B組成，其中A為1.5M甘氨酸溶液(PH2.8)，B為1.5M Tris-Hcl溶液(PH9.7)； (3)堿性磷酸酶標(biāo)記的單抗3B1A15； (4)濃縮洗液含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高壓滅菌后，加入20ml Tween-20攪勻，使用時(shí)20倍稀釋； (5)陽性對(duì)照DV2NS1抗原1∶1000稀釋液； (6)陰性對(duì)照含0.1％Tween-20的10mM PH7.4PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02g Na2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高壓滅菌，20倍稀釋后加入0.1％Tween-20； (7)顯色液為PNPP(購于PIERCE公司)，以10mg PNPP溶于10mM二乙醇胺溶液中； (8)終止液2M NaOH溶液。
上述試劑中，單抗2E8A5、DV2-M6和4B14A1的制備方法、包被單抗組合2E8A5、DV2-M6和4B14A1的微孔反應(yīng)板的制備方法同例1；堿性磷酸酶標(biāo)記的單抗3B1A15的制備方法為采用戊二醛法，即取堿性磷酸酶5mg溶于1ml抗體(2mg/ml)溶液中，在10mM PBS(PH7.2)透析24h，期間更換透析液3次，加入2.5％的戊二醛20μl，室溫靜置2h，在10mM PBS(PH7.2)透析12h，期間更換透析液3次，在50mM Tris-HCl溶液(PH8.0)中透析12h，期間更換透析液3次，用含1％BSA的Tris-HCl溶液(PH8.0，含0.02％NaN3)稀釋至4ml，加入等量60％中性甘油溶液，混勻后分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2、使用方法樣品處理液處理各種待測(cè)的樣品后，加150μl于2E8A5、DV2-M6和4B14A1包被的聚苯乙烯96孔微量測(cè)試板中，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，37℃溫育1h，濃縮洗滌液20倍稀釋后洗滌板條，洗板四次后，加入酶結(jié)合物，150μl/孔，37℃30min，同上洗板八次后，加顯色液PNPP，150μl/孔，室溫避光30min后，加入終止液，100μl/孔，終止反應(yīng)。
3、結(jié)果判定以空白孔調(diào)零，于405nm波長測(cè)定A值。陽性對(duì)照平均值≥0.50，陰性對(duì)照平均值≤0.10，實(shí)驗(yàn)成立。樣品A值≥陰性對(duì)照A值平均值×2.1，則判為陽性。反之為陰性。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括捕獲抗體和與標(biāo)記物結(jié)合的檢測(cè)抗體，其特征在于所述的捕獲抗體是由質(zhì)量比為1∶1∶1的單抗2E8A5、單抗DV2-M6和單抗4B14A1組成，其中單抗2E8A5由保藏號(hào)為CCTCC-C200855的雜交瘤細(xì)胞株分泌，單抗4B14A1由保藏號(hào)為CCTCC-C200857的雜交瘤細(xì)胞株分泌，單抗DV2-M6由保藏號(hào)為CCTCC-C200736的雜交瘤細(xì)胞株分泌；所述的檢測(cè)抗體是單抗3B1A15，由保藏號(hào)為CCTCC-C200859的雜交瘤細(xì)胞株3B1A15分泌；所述的標(biāo)記物可以是生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金或熒光素。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒是一種基于雙抗體夾心ELISA方法的酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，由包被了單抗2E8A5、單抗DV2-M6和單抗4B14A1的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、標(biāo)記了辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的單抗3B1A15、陽性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、濃縮洗液、顯色液和終止液組成，其中所述的顯色液中含有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的底物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括捕獲抗體和與標(biāo)記物結(jié)合的檢測(cè)抗體，其特征在于所述的捕獲抗體由單抗2E8A5、單抗DV2-M6和單抗4B14A1組成，所述的檢測(cè)抗體是單抗3B1A15，所述的標(biāo)記物可以是生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金或熒光素。該試劑盒能特異性的檢測(cè)4個(gè)血清型登革病毒的NS1蛋白，與其他黃病毒屬病毒，如黃病毒和乙型腦炎病毒無交叉反應(yīng)，其靈敏度比國外商品化試劑盒檢測(cè)的靈敏度至少高出4倍，可有效降低了臨床應(yīng)用中的漏檢現(xiàn)象。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101726593SQ200910040560
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者車小燕, 丁細(xì)霞, 潘玉先, 丘立文 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)