專利名稱：一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測牛乳中細(xì)菌的方法。
技術(shù)背景沙門氏菌屬于人畜共患病原菌，是世界衛(wèi)生組織(WHO)所列最主要的食 源性病原細(xì)菌。沙門氏菌不僅能導(dǎo)致動物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、 敗血癥、胃腸炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒 病例居于前列。2003年WHO的一份報告中指出"雖然在歐洲的一些國家中 沙門氏菌的致病率呈下降趨勢，但沙門氏菌在所有由食源性致病菌引起的病例 中占有75%,這說明了沙門氏菌仍然是引起食物中毒的最常見的食源性致病 菌。沙門氏菌作為致病菌檢測的一項重要指標(biāo)，在食品安全特別是乳品安全檢 驗檢疫中是必需檢測的項目，有重要的社會、經(jīng)濟(jì)的意義。傳統(tǒng)的沙門氏菌的 檢測常用分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，分別采用不同的檢驗程序、方法，分別報告， 確診檢驗結(jié)果至少需5 7天。這些傳統(tǒng)的沙門氏菌檢驗方法存在繁瑣、費時費 力、特異性低的缺陷。LAMP技術(shù)的全稱是環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification),是2000年由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明一種新型的基因擴(kuò)增技 術(shù)。LAMP技術(shù)利用特異性引物(4種)和兩個輔助引物，以識別耙基因的六 個特定區(qū)域。反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng) 極快， 一般在一小時內(nèi)完成；擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，肉眼、電泳或比濁儀均可 判度結(jié)果；靈敏度高、特異性強(qiáng)，極適于病原菌檢測。目前針對食源性致病菌的基因檢測技術(shù)(如PCR技術(shù)或LAMP技術(shù))的 檢測第一步大都采用預(yù)增菌來獲得足夠的菌體，在預(yù)增菌步驟后再進(jìn)行PCR 檢領(lǐng)!l，能夠達(dá)到很低的檢測限；但預(yù)增菌步驟一般需要8~12h，無形中就增加 了一個工作日的檢測時間，增加了檢測時間及檢測成本。如果不預(yù)增菌直接進(jìn) 行PCR或LAMP檢測食品樣品其檢測靈敏度均不理想。
隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速增長和乳品行業(yè)的蓬勃發(fā)展，牛乳已經(jīng)成為百姓生活 中必不可少的營養(yǎng)食品，牛乳的食用安全性也備受重視。但是現(xiàn)在沒有一種可 以快速檢測牛乳中沙門氏菌的方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決傳統(tǒng)的沙門氏菌檢驗方法存在繁瑣、費時費力、特異性低的缺陷及現(xiàn)有的PCR技術(shù)或LAMP技術(shù)必需預(yù)增菌，無法快速檢測 牛乳的問題，而提供的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法。檢測牛乳中沙門氏菌的方法按以下步驟進(jìn)行 一、被檢測牛乳脫脂；二、 按脫脂牛乳與EDTA溶液6~8 : 1的體積比向脫脂牛乳中加入質(zhì)量濃度為 400/。 60。/。的EDTA溶液，然后在37士1。C條件下水浴40 50min;三、過濾無 菌操作；四、用生理鹽水洗脫過濾膜上的細(xì)菌，然后離心洗脫液，再棄去上清 液，并用lmLTE溶液重新懸浮沉淀物，之后再次離心、棄去上清液，用細(xì)菌 基因組DNA提取試劑盒快速提取被檢測樣品DNA;五、LAMP擴(kuò)增25jiL 擴(kuò)增體系由2.5pL lOxThermoPol Buffer、 l|iL濃度為1.4mM的dNTP、 1.6pL 濃度為25]tiM的FIP引物、1.6iiL濃度為25pM的BIP引物、0.8iaL濃度為25pM 的F3引物、0.8|aL濃度為25nM的B3引物、0.4pL濃度為25pM的Loop f 引物、0.4pL濃度為25pM的loopb引物、5jiL樣品DNA、 0.5pLBst聚合酶 和10.4pL滅菌超純水組成，擴(kuò)增條件為65。C擴(kuò)增60min;六、鑒定取LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物5pL，點樣于質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠，再以100V電壓在lxTAE 電泳緩沖液中電泳45min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中成像；其中步驟六使用的瓊 脂糖凝膠中含有0.25jig/mL的溴化乙啶。本發(fā)明方法簡單、省時，檢測操作僅需約3小時(對原料乳的初處理至分 析鑒定完畢，全部流程可以控制在6.5h以'內(nèi))，大大的提高了被檢牛乳產(chǎn)品的 新鮮度和貨架期；而且本發(fā)明方法不需要預(yù)增菌，具有快速靈敏的優(yōu)點。本發(fā) 明克服了現(xiàn)有技術(shù)無法采用過濾法直接對牛乳中沙門氏菌進(jìn)行快速富集檢測 的缺陷。本發(fā)明方法利用螯合劑EDTA對二價金屬離子具有螯合作用，可以奪 取酪蛋白膠束中的Ca2、使酪蛋白膠束解離成小分子酪蛋白單體，從而克服了 牛乳酪蛋白膠束在快速過濾富集過程中的阻遏作用，達(dá)到過濾直接快速富集檢 測沙門氏菌。 本發(fā)明方法利用沙門氏菌特異性引物，采用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)系統(tǒng)，成功 地以沙門氏菌Mv4基因為靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高達(dá)99.6%。


圖1是具體實施方式
十一檢測結(jié)果的凝膠電泳圖。
具體實施方式
具體實施方式
一本實施方式檢測牛乳中沙門氏菌的方法按以下步驟進(jìn) 行 一、被檢測牛乳脫脂；二、按脫脂牛乳與EDTA溶液6 8 : 1的體積比向 脫脂牛乳中加入質(zhì)量濃度為40%~60%的EDTA溶液，然后在37土rC條件下水 浴40 50min;三、過濾無菌操作；四、用生理鹽水洗脫過濾膜上的細(xì)菌， 然后離心洗脫液，再棄去上清液，并用lmLTE溶液重新懸浮沉淀物，之后再 次離心、棄去上清液，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒快速提取被檢測樣品 DNA;五、LAMP擴(kuò)增25jaL擴(kuò)增體系由2.5pL lOxThermoPol Buffer、 1 pL濃 度為10mM的dNTP、 1.6pLFIP引物、1.6pLBIP引物、0.8pLF3引物、0.8nL B3引物、0.4juL Loop f弓l物、0.4pL loop b引物、5pL樣品DNA、 0.5pL Bst 聚合酶和10.4iiL滅菌超純水組成，擴(kuò)增條件為65'C擴(kuò)增60min;六、鑒定 取LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物5^L，點樣于質(zhì)量濃度為2%的瓊脂糖凝膠，再以100V電 壓在lxTAE電泳緩沖液中電泳45min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中成像；其中步 驟六使用的瓊脂糖凝膠中含有0.25pg/mL的溴^^乙啶。本實施方式步驟五中使用的聚合酶購自于美國New England Biolabs (NEB) 公司。本實施方式擴(kuò)增結(jié)果無條帶表明被檢測牛乳中無沙門氏菌或被檢測牛乳 中沙門氏菌含量低于檢出限(10QcfU/mL);擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)梯形條帶表明被檢測 牛乳中有沙門氏菌。本實施方式步驟五中 loop f 引物的序列為 CGGCCTTCAAATCGGCATCAATAC ; loop b 引物的序列為 AAGGGAAAGCCAGCTTTACG ; FIP 引 物 的 序 列 為 GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG; BIP引物的序序列為 CGGCCCGATTTTCTCTGG ; B3 引物的序列為 GATGCCGGC AATAGCGTC 。
本實施方式步驟三過濾前需要對過濾膜進(jìn)行檢查，避免過濾膜有空隙、裂 紋或漏氣。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一被檢測牛乳在2800 3200g的條件下離心10 20min，然后真空抽取上層脂肪進(jìn)行脫 脂。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一被檢測牛乳在3000g的條件下離心15min，然后真空抽取上層脂肪進(jìn)行脫脂。其它 步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中按脫脂牛乳與EDTA溶液7 : 1的體積比加入質(zhì)量濃度為50%的EDTA溶液。其 它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟二中在37"C條件下水浴45min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟三中采用真空抽濾。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。本實施方式采用真空抽濾，細(xì)菌與過濾膜之間的結(jié)合力小，更容易被冼脫 下來。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟三中過濾膜的孔徑為0.22pm。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟四中洗脫液在10000g的條件下離心5min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟四中懸浮的沉淀物在10000g的條件下離心5min。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟四中用20mL生理鹽水洗脫過濾膜上的細(xì)菌。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
十一本實施方式檢測牛乳中沙門氏菌的方法按以下步驟進(jìn) 行 一、被檢測牛乳脫脂取M0mL被檢測牛乳在3000g的條件下離心i5min， 然后真空抽取上層脂肪進(jìn)行脫脂；二、按脫脂牛乳與EDTA溶液6.5 : 1的體 積比向脫脂牛乳中加入質(zhì)量濃度為50%的EDTA溶液，然后在37。C條件下水
浴45min;三、過濾無菌采用真空抽濾操作，過濾膜的孔徑為0.22pm;四、 將過濾膜粉碎成小塊，然后用20mL生理鹽水在漩渦振蕩器上洗脫過濾膜上的 細(xì)菌，然后在10000g的條件下離心洗脫液5min，再棄去上清液，并用lmLTE 溶液重新懸浮沉淀物，之后再次在lOOOOg的條件下離心5min、棄去上清液， 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒快速提取被檢測樣品DNA;五、LAMP擴(kuò)增 25|iL擴(kuò)增體系由2.5pL lOxThermoPol Buffer、 lpL濃度為1.4mM的dNTP、 1.6pL濃度為25pM的FIP引物、1.6piL濃度為25pM的BIP引物、0.8^L濃 度為25jiM的F3引物、0.8pL濃度為25pM的B3引物、0.4pL濃度為25^M 的Loopf引物、0.4iaL濃度為25^M的loop b引物、5pL樣品DNA、 0.5jaLBst 聚合酶和10.4nL滅菌超純水組成，擴(kuò)增條件為65r擴(kuò)增60min;六、鑒定 分別取4組LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，每組LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物10pL點樣于質(zhì)量濃度為 2%的瓊脂糖凝膠，并以100bpDNAMarker作為標(biāo)準(zhǔn)分子參照，再以100V電 壓在lxTAE電泳緩沖液中電泳45min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中成像；其中步 驟六使用的瓊脂糖凝膠中含有0.25|ig/mL的溴化乙啶。本實施方式的凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，檢測結(jié)果證明本實施方式方 法準(zhǔn)確率高、穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)。本實施方式步驟六中使用的凝膠成像系統(tǒng)為美國的UVP凝膠成像系統(tǒng)。 本實施方式步驟五中l(wèi)oopf引物的序列為 CGGCCTTCAAATCGGCATCAATAC ;loopb引物的序歹!]為 AAGGGAAAGCCAGCTTTACG; FIP 引物的序列 為 GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG; BIP引物的序序歹U為 CGGCCCGATTTTCTCTGG ; B3 引物的序列為 GATGCCGGC AATAGCGTC 。 序列表〈110>東北農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉 一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法〈160〉 6〈210〉 1 〈211〉 24 〈212〉醒 〈213>人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)沙門氏菌的i/7^l基因設(shè)計的loop f引物。 〈400〉 1cggccttcaa atcggcatca atac 24〈210〉 2 <211> 20 〈212〉腿 <213>人工序列〈220>〈223〉根據(jù)沙門氏菌的i/7^基因設(shè)計的loop b引物。 〈400〉 2aagggaaagc cagctttacg 20〈210> 3 <211〉 40 <212> DNA
〈213〉人工序列 〈220〉〈223>根據(jù)沙門氏菌的i"W基因設(shè)計引物的FIP引物。 〈400> 3gcgcggcatc cgcatcaata atggtatgcc cggtaaacag 40〈210〉 4 ,〈211> 38〈212〉 DNA 〈213>人工序列〈220>〈223〉根據(jù)沙門氏菌的i/7^基因設(shè)計的BIP引物。 〈400> 4gaacggcgaa gcttactgga catcgcaccg tcaa鄉(xiāng)a 38〈210> 5 〈211〉 18 <212>腿 〈213〉人工序列〈220〉〈223>根據(jù)沙門氏菌的i"W基因設(shè)計的F3引物。 〈400〉 5cggcccgatt ttctctgg 18 '〈210〉 6 〈211> 18
〈212>腿 〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)沙門氏菌的i/7^基因設(shè)計的B3引物。 〈400〉 6gatgccggca atagcgtc 18
權(quán)利要求
1、一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于檢測牛乳中沙門氏菌的方法按以下步驟進(jìn)行一、被檢測牛乳脫脂；二、按脫脂牛乳與EDTA溶液6～8∶1的體積比向脫脂牛乳中加入質(zhì)量濃度為40％～60％的EDTA溶液，然后在37±1℃條件下水浴40～50min；三、過濾無菌操作；四、用生理鹽水洗脫過濾膜上的細(xì)菌，然后離心洗脫液，再棄去上清液，并用1mL TE溶液重新懸浮沉淀物，之后再次離心、棄去上清液，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒快速提取被檢測樣品DNA；五、LAMP擴(kuò)增25μL擴(kuò)增體系由2.5μL 10×ThermoPolBuffer、1μL濃度為1.4mM的dNTP、1.6μL濃度為25μM的FIP引物、1.6μL濃度為25μM的BIP引物、0.8μL濃度為25μM的F3引物、0.8μL濃度為25μM的B3引物、0.4μL濃度為25μM的Loop f引物、0.4μL濃度為25μM的loopb引物、5μL樣品DNA、0.5μL Bst聚合酶和10.4μL滅菌超純水組成，擴(kuò)增條件為65℃擴(kuò)增60min；六、鑒定取LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，點樣于質(zhì)量濃度為2％的瓊脂糖凝膠，再以100V電壓在1×TAE電泳緩沖液中電泳45min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中成像；其中步驟六使用的瓊脂糖凝膠中含有0.25μg/mL的溴化乙啶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟一被檢測牛乳在2S00 3200g的條件下離心10 20min，然后真空抽取上層 脂肪進(jìn)行脫脂。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟二中按脫脂牛乳與EDTA溶液7 : 1的體積比加入質(zhì)量濃度為50%的 EDTA溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟二中在37"C條件下水浴45min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟三中采用真空抽濾。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟三中過濾膜的孔徑為0.22pm。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于步驟四中洗脫液在lOOOOg的條件下離心5min。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟四中用20mL生理鹽水洗脫過濾膜上的細(xì)菌。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，其特征在于 步驟五中l(wèi)oop f引物的序列為CGGCCTTCAAATCGGCATCAATAC; loop b 引物的序列為AAGGGAAAGCCAGCTTTACG ; FIP引物的序列為 GCGCGGCATCCGCATCAATAATGGTATGCCCGGTAAACAG; BIP引物的序 列為GAACGGCGAAGCTTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGA; F3引物的 序歹U為 CGGCCCGATTTTCTCTGG ; B3 弓l物的序列為 GATGCCGGC AATAGCGTC 。
全文摘要
一種檢測牛乳中沙門氏菌的方法，它涉及一種檢測牛乳中細(xì)菌的方法。它解決了傳統(tǒng)的沙門氏菌檢驗方法存在繁瑣、費時費力、特異性低的缺陷及現(xiàn)有的PCR技術(shù)或LAMP技術(shù)必需預(yù)增菌，無法快速檢測牛乳的問題。檢測方法一、牛乳脫脂；二、加入EDTA溶液水浴；三、過濾；四、提取樣品DNA；五、LAMP擴(kuò)增；六、鑒定。本發(fā)明方法簡單、省時，檢測操作僅需約3小時，大大的提高了被檢牛乳產(chǎn)品的新鮮度和貨架期；而且本發(fā)明方法不需要預(yù)增菌，具有快速靈敏的優(yōu)點。本發(fā)明方法利用沙門氏菌特異性引物，采用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)系統(tǒng)，成功地以沙門氏菌invA基因為靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高達(dá)99.6％。
文檔編號G01N27/447GK101149355SQ200710144578
公開日2008年3月26日 申請日期2007年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者偉 劉, 琦 呂, 姜毓君, 孫大慶, 王明娜, 冰 閆, 韓希妍 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)