一種快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種基于核酸適體的生物傳感巧片，特別 為一種基于核酸適體的快速檢測鼠傷寒沙口氏菌的生物傳感巧片及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠傷寒沙口氏菌，是一群非適應(yīng)性或泛嗜性的沙口氏菌，具有廣泛的宿主，是目前 世界各國分離率最高的菌型之一。該菌自然疫源廣泛，很多家禽、家畜、鼠、鳥和冷血動物是 自然宿主，蛹、圣可帶菌傳播，常由污染的水、牛奶和食物經(jīng)口感染。人感染沙口氏菌后，可 呈無癥狀帶菌，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，嚴(yán)重威脅著 人們的身體健康。因此鼠傷寒沙口氏菌的臨床快速診斷具有重要的公共衛(wèi)生意義。
[0003] 為了有效預(yù)防沙口氏菌病，人們在探索沙口氏菌檢測方法的過程中，做出了不懈 的努力，特別是在生物化學(xué)（GB/T 4789)、免疫學(xué)（Appl. Environ. Microbiol. January 2004 vol. 70 no. 1 152-158)、分子生物學(xué)（Letters in Applied Microbiology, Volume 42， Issue 2, pages 149-154, February 2006)等方面，開發(fā)出了各種新型快速檢測技術(shù)，提高 了沙口氏菌檢測的速度和質(zhì)量，有效預(yù)防和控制沙口氏菌的傳染。由于其樣品來源極為繁 雜，盡管各國學(xué)者對其進(jìn)行了長期研究，仍存在不少問題。目前主要存在分析過程復(fù)雜、分 析時間長、檢測靈敏度較低等缺點。
[0004] 核酸適體（Aptamer)是利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELE)〇,從核酸分子文庫中得到的 一段脫氧核糖核酸值NA)或者核糖核酸（RNA)序列。核酸適體具有與傳統(tǒng)免疫分析的抗 原-抗體性質(zhì)類似的性能，能與特定目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合，并且比傳統(tǒng)的抗 體具有更好的穩(wěn)定性，因此近年來被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域。
[0005] 當(dāng)光線入射到由貴金屬構(gòu)成的納米顆粒上時，如果入射光子頻率與貴金屬納米 顆?；蚪饘賺u傳導(dǎo)電子的整體振動頻率相匹配時，納米顆?；蚪饘賺u會對光子能量產(chǎn)生 很強的吸收作用，就會發(fā)生局域表面等離子體共振（LSPR;localized Su計ace Plasmon Resonance)現(xiàn)象，LSPR吸收譜還對周圍介質(zhì)極其敏感，因此可W作為基于光學(xué)信號的化學(xué) 傳感器和生物傳感器?；贚SPR現(xiàn)象的傳感器可W做到無需標(biāo)記，并且是無污染、實時、高 靈敏度的檢測，可W廣泛用于藥物研究、生物檢測、細(xì)胞標(biāo)記、定點診斷、分子動力學(xué)研究及 疾病診斷等方面。迄今為止，還沒有基于核酸適體與LSH?檢測技術(shù)相結(jié)合來定量檢測鼠傷 寒沙口氏菌的相關(guān)產(chǎn)品或文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，目的在于提供一種基于核酸適體的快速檢測鼠 傷寒沙口氏菌的生物傳感巧片，其具有特異性好、靈敏度高、快速有效的特點。
[0007] 本發(fā)明具體通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[000引一種快速檢測鼠傷寒沙口氏菌的生物傳感巧片，通過將核酸適體固定于修飾有金 納米椿的巧片，所述的核酸適體基因序列為TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGAC AG。
[0009] 本發(fā)明所述的核酸適體末端修飾有琉基。
[0010] 本發(fā)明所述的一種快速檢測鼠傷寒沙口氏菌的生物傳感巧片具體通過W下方法 制備：
[0011] 1)金納米椿的制備；制備長徑比為3~5的金納米椿；
[0012] 2)金納米椿在巧片上的固定；
[0013] a.巧片的清洗；將巧片浸入體積比為3 : 1的濃硫酸與過氧化氨的混合溶液中氧 化，在室溫20KHz條件下超聲15min。
[0014] b. 3-氨丙基=己氧基硅烷的修飾；將清洗后的巧片浸入3-氨丙基=己氧基硅烷 的甲醇溶液中，靜置反應(yīng)比，用甲醇和去離子水反復(fù)沖洗3次后于110°C下烘干化；
[0015] C.聚苯己締橫酸鋼的修飾；將烘干的巧片浸入聚苯己締橫酸鋼水溶液中，靜置反 應(yīng) 90min ;
[0016] d.金納米椿的修飾；將修飾有聚苯己締橫酸鋼的巧片浸入步驟（1)中制備的金納 米椿溶液中，靜置反應(yīng)90min。
[0017] 3)核酸適體的固定；將得到的巧片浸入末端修飾有琉基的核酸適體溶液中，靜置 反應(yīng)2化。
[001引所述的過氧化氨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)> 30%，所述的3-氨丙基=己氧基硅烷的甲醇溶液 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %，所述的聚苯己締橫酸鋼水溶液的濃度為50g/l，所述的核酸適體溶液 的濃度為0.1 mM。
[0019] 本發(fā)明所述的生物傳感巧片用于檢測鼠傷寒沙口氏菌的應(yīng)用，所述的生物傳感巧 片采用手提式光纖光譜儀進(jìn)行檢測，使用透射模式檢測巧片，結(jié)合樣品前后的光譜，計算獲 得鼠傷寒沙口氏菌的濃度。
[0020] 本發(fā)明的有益效果為；1)快速檢測鼠傷寒沙口氏菌。整個檢測過程可W在一個小 時內(nèi)完成。而傳統(tǒng)的鼠傷寒沙口氏菌檢測方法常常需要經(jīng)過較長的細(xì)菌培養(yǎng)及樣品前處理 過程；2)核酸適體直接結(jié)合細(xì)菌，無需對細(xì)菌進(jìn)行破碎等前處理；3)檢測設(shè)備簡單，只需要 一臺手提式光譜儀即可。適合攜帶到現(xiàn)場對食品及環(huán)境樣品進(jìn)行檢測。
【附圖說明】
[0021] 圖1是檢測水樣中鼠傷寒沙口氏菌含量的光譜圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明實施例檢測鼠傷寒沙口氏菌的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；
[0023] 圖3是本發(fā)明實施例檢測甲型副傷寒沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增 李斯特菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌及鼠傷寒沙口氏菌的影響圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實質(zhì)對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0025] 實施例1生物傳感巧片的制備
[0026] 一種基于核酸適體的快速檢測鼠傷寒沙口氏菌的生物傳感巧片，具體通過W下步 驟制備：
[0027] 1)金納米椿的制備；義用晶種生長法制備，具體制備方法如下：
[0028] A.將十六烷基S甲基漠化錠（CTAB)溶液巧血，0. 2M)加入15血的玻璃瓶中，放在 30 °C的水浴鍋中，磁力攬拌。
[0029] B.往玻璃瓶中加入4. 75血的水和0. 25血0. 01M的HAuCL溶液。
[0030] C.調(diào)節(jié)磁力攬拌機(jī)轉(zhuǎn)速為12(K)r/min，將新制冷凍的0. 6血NaBH加入到上述溶 液中，溶液呈棟黃色。
[0031] D.持續(xù)攬拌兩分鐘后，停止攬拌，將磁力攬椿子從溶液中取出，將此反應(yīng)液靜置于 30°C水浴中30min備用。（制備得到的金核溶液必須在化使用）
[003引 E.將CTAB溶液（12. 5血，0. 2M)加入25mL的比色管中，再加入9. 675血的水，使 CTAB溶解完全。
[003引 F.往上述溶液中加入0. 15血0. 01 MgN03溶液，混合均勻，靜置5min，隨后加入 l.OmL lOmM 的 HAuCL溶液。
[0034] G.劇烈上下振搖反應(yīng)液后，并加入1. 6血0. 01M的抗壞血酸（VC)，混合均勻后，加 入50yL的金核。劇烈震蕩20s后，室溫靜置化。
[0035] 2)金納米椿在巧片（此處選取22mmX 22mm的蓋玻片作為基質(zhì)）上的固定，包括W 下四個步驟：
[0036] A.蓋玻片的清洗：將蓋玻片浸入體積比為3 : 1的濃硫酸（98%