一種基于單克隆抗體的檢測食品中沙門氏菌屬的特異性雙抗體夾心法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種定量檢測食品中沙門氏菌屬的雙抗體夾心法，屬于免疫分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌(Salmonella)是一種全球性的食源性致病菌。生物學(xué)上沙門氏菌是一類兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，無芽孢，一般無莢膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。動物性食品如禽肉、蛋類、乳品容易污染沙門氏菌。人體攝入含菌食物后會引起急性腸胃炎，傷寒，免疫力低下的兒童等人群中甚至出現(xiàn)敗血癥等癥狀。
[0003]沙門氏菌有2000多種血清型，臨床中常見的血清型主要是腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌等。良好規(guī)范的生產(chǎn)操作過程和危害分析與關(guān)鍵點控制(HACCP)等管理體系的應(yīng)用可以很大程度上減少食源性致病菌的發(fā)生。然而對原料和生產(chǎn)過程、產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)測也是保障食品生物安全的重要手段。
[0004]目前檢測沙門氏菌的方法主要有生化培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測方法、分子檢測方法。傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)法是檢測沙門氏菌的國標(biāo)方法，盡管權(quán)威可靠，但一般需要5-10天得到結(jié)果，且操作過程繁瑣，不能適應(yīng)快速檢測的要求；分子檢測方法是基于沙門氏菌脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)建立起來的。目前發(fā)展為傳統(tǒng)PCR、實時熒光定量PCR(RT-PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)。與傳統(tǒng)PCR相比，RT-PCR具有實現(xiàn)定量檢測目標(biāo)DNA、特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。LAMP方法具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方面不亞于常規(guī)PCR技術(shù)，不依賴專門的儀器設(shè)備，可以現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于實時熒光定量PCR。然而，有文獻(xiàn)報道LAMP方法在檢測牛乳中的沙門氏菌時，會出現(xiàn)假陰性的問題。這可能是與引物受到樣品基質(zhì)影響所引起的。同樣常規(guī)PCR和實時熒光PCR也面臨著檢測成本高、對操作人員技術(shù)要求較高的問題。
[0005]ELISA憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣的特點成為食源性致病菌的常規(guī)檢測方法。目前ELISA方法檢測沙門氏菌面臨的困難就是難以制備在菌屬水平上識別沙門氏菌的單克隆抗體，因此建立的方法特異性很強，不能檢測沙門氏菌屬內(nèi)的其它沙門氏菌。之前我們實驗室的專利申請，申請?zhí)?01310506513.5、發(fā)明名稱“一種基于單克隆抗體的檢測食品中鼠傷寒沙門氏菌的雙抗體夾心法”，用LPS和鼠傷寒沙門氏菌菌體混合作為免疫原，制備了鼠傷寒沙門氏菌特異性的單克隆抗體并建立了檢測鼠傷寒沙門氏菌的夾心法ELISA方法，LOD為500cfu/mL。然而，LPS和沙門氏菌菌體混合免疫起免疫作用的主要是菌體LPS的O特異性側(cè)鏈(LPS是非胸腺依賴抗原，單獨一般只引起體液免疫)，沙門氏菌的核心多糖由于空間位阻難以引起有效的免疫應(yīng)答，因此篩選到的單抗和建立的夾心ELISA特異性較強，只特異性針對檢測鼠傷寒沙門氏菌，不能滿足實際樣品需要檢測沙門氏菌屬特異性的需求。
[0006]面對這一難點，我們通過高碘酸鈉法(Na14)將弱免疫原性的LPS與載體蛋白偶聯(lián)制備了 LPS完全抗原。該完全抗原為胸腺依賴抗原相比LPS免疫原性增強并且可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG類抗體，更重要的是制備的血清對沙門氏菌屬內(nèi)的沙門氏菌均有交叉反應(yīng)。比較光滑型LPS與RaLPS人工抗原免疫的小鼠血清的交叉反應(yīng)后我們發(fā)現(xiàn)普通光滑型LPS制備的人工抗原即可產(chǎn)生與RaLPS人工抗原同樣的效果，這可能是因為光滑型LPS與RaLPS均含有沙門氏菌核心多糖(LPS core structure)的原因。光滑型LPS在制備免疫原方面具有成本更低的優(yōu)勢，因此，本發(fā)明中采用LPS合成了人工抗原作為免疫原免疫小鼠并進(jìn)行融合篩選，成功制備了特異性識別沙門氏菌屬的單克隆抗體并建立了菌屬水平上檢測沙門氏菌的雙抗體夾心法檢測，為快速檢測食品中沙門氏菌提供了可靠的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007](一)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于建立一種在菌屬水平上檢測沙門氏菌屬的酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，用于食品中沙門氏菌屬的批量、快速檢測。
[0008](二)技術(shù)方案
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明建立了一種基于單克隆抗體的檢測食品中沙門氏菌屬的特異性雙抗體夾心法，該方法包括對檢測方法的優(yōu)化。
[0009]其中，單克隆抗體是采用LPS-BSA人工抗原作為免疫原免疫7周齡的BALB/c小鼠并經(jīng)雜交瘤技術(shù)融合、篩選得到的。
[0010]其中，用于配對的抗體是通過優(yōu)化參數(shù)下夾心法配對，并通過多次試驗篩選確定的，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點。
[0011]其中，建立的夾心法優(yōu)化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，檢測抗體稀釋液，檢測抗體稀釋濃度。
[0012]本發(fā)明方法的檢測分析原理是:
酶標(biāo)板上包被了包被抗體8G3，該抗體可特異性捕獲沙門氏菌屬內(nèi)的沙門氏菌；洗板3次，洗去未結(jié)合的抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多余結(jié)合位點；洗板3次，加入樣品和對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入檢測抗體8G3-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色lOmin。如果樣品有足夠的沙門氏菌，那么沙門氏菌被包被抗體捕獲并與檢測抗體8G3-HRP結(jié)合，并催化底物在450nm產(chǎn)生吸收值(P/N彡2.1)，并被判定為陽性；如果樣品沙門氏菌濃度太低(P/N < 2.1)那么樣品不被捕獲或者捕獲數(shù)量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性。
[0013]抗體8G3，即細(xì)胞株0，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCC N0.9804。
[0014]步驟為:
(1)沙門氏菌屬交叉型LPS單克隆抗體細(xì)胞株的制備
用合成的沙門氏菌LPS-BSA人工抗原為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)免疫、融合，篩選采用不同血清群的沙門氏菌和Ra LPS測試細(xì)胞株的交叉反應(yīng)并挑選具有較強交叉反應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，最終得到了 12株交叉型的沙門氏菌屬特異性單克隆抗體；
(2)單克隆抗體的配對篩選 12株沙門氏菌屬特異性單克隆抗體純化后分別標(biāo)記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標(biāo)記成功后進(jìn)行夾心法配對，配對參數(shù)如下:包被抗體8G3 4 μ g/mL ;包被液為pH9.6、
0.0lM的碳酸鹽緩沖液；標(biāo)品濃度5X 10~7CFU/mL ;標(biāo)品稀釋液pH7.2,0.0lM的PBS ;檢測抗體8G3-HRP稀釋1000倍使用，在此條件下，實驗成功得到了 10對P/N >5的配對；
(3)沙門氏菌屬特異性ELISA方法的建立
選擇檢測限穩(wěn)定、靈敏的配對，用包被抗體8G3和檢測抗體8G3-HRP建立了沙門氏菌屬特異性的夾心ELISA分析方法；具體參數(shù)如下:
包被抗體8G3包被濃度:4 μ g/mL,
包被液:pH9.6,0.0lM碳酸鹽緩沖液，
標(biāo)品稀釋液:含3.3mM EDTA的ρΗ7.2、0.0lM的Tris-HCl溶液，
檢測抗體濃度:2 μ g/mL，
反應(yīng)時間:包被、封閉:37°C，2h ;標(biāo)準(zhǔn)品:37°C，Ih ;檢測抗體37°C, Ih ;顯色1min ；
該ELISA對沙門氏菌屬內(nèi)的甲型副傷寒沙門氏菌(A群)、鼠傷寒沙門氏菌(B群)、阿貢那沙門氏菌(B群)、乙型副傷寒沙門氏菌(B群)、湯普遜沙門氏菌(Cl群)、布洛克利沙門氏菌(C2群)、肯塔基沙門氏菌(C3群)、腸炎沙門氏菌(D群)、都柏林沙門氏菌(D群)、傷寒沙門氏菌(D群)、鴨沙門氏菌(E群)、亞利桑那沙門氏菌(Arizona亞屬)均有交叉反應(yīng)，對應(yīng)的檢測限(P/N 彡 2.1)分別為:1.5X10~6CFU/mL、l.5X 10~6CFU/mL、6.3X 10~6CFU/mL、
1.3X10~7CFU/mL、3.1 X 10~6CFU/mL、3.1 X 10~6CFU/mL、6.3 X 10~6CFU/mL、6.3X10~6CFU/mL、2.5X10~7CFU/mL、2.5X 10~7CFU/mL、6.3X 10~6CFU/mL、2.5X10~7CFU/mL ；與 E.col1、E.coli 0157:H7、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌無交叉反應(yīng)。
[0015](三)有益效果
本發(fā)明提供的沙門氏菌雙抗體夾心檢測方法基于沙門氏菌屬特異性的LPS單克隆抗體，建立的夾心法可以在菌屬水平上檢測沙門氏菌。同時穩(wěn)定性好、成本低，能同時檢測大量樣品，適合食品行業(yè)大規(guī)模、高通量、快速、靈敏的檢測要求，具有推廣和應(yīng)用價值。
[0016]生物材料樣品保藏:單克隆細(xì)胞株0，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，筒稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所，保藏編號:CGMCC N0.9804，保藏日期2014年10月15日。
【附圖說明】
[0017]圖1沙門氏菌屬特異性單克隆抗體8G3的交叉反應(yīng)。
[0018]圖2沙門氏菌屬特異性雙抗體夾心法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0019]以下通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0020]一、儀器:
TGL - 40B臺式低速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠
KFLOff純水機，凱佛隆公司
ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠
96孔8X 12可拆酶標(biāo)板，廈門怡佳美實驗器材有限公司 MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠
二、試劑:
四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，上海晶純實業(yè)有限公司其他試劑均為分析純試劑
三、步驟
1、單克隆抗體的制備
1)實驗動物:選5只7周齡的BA