專利名稱：一種檢測沙門氏桿菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測沙門氏桿菌DNA或RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增 技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于 疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫等領(lǐng)域都具有十分重要的 意義。以往在這方面較為準(zhǔn)確靈敏的檢測方法有熒光標(biāo)記法、放射性標(biāo)記等方法，這些方法 都需要復(fù)雜的操作和特殊的設(shè)備，應(yīng)用范圍很窄。1993年P(guān)E公司的Dr.Kary B.Mullis發(fā) 明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR。隨后PCR技術(shù)大規(guī)模的應(yīng) 用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進(jìn)入了新的時代，Dr. Mull is為此還獲得了 1993 年的諾貝爾化學(xué)獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、操作較簡單等優(yōu)點(diǎn)，但由于其 反應(yīng)進(jìn)行和產(chǎn)品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術(shù)的使用一直被限定在專業(yè)的實(shí)驗室 和醫(yī)院里。2001年日本榮研化學(xué)株式會社研制出了一種新型DNA擴(kuò)增方式，環(huán)介導(dǎo)等溫核酸 擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA的高效快速擴(kuò)增，該方法反應(yīng)條件簡單，DNA擴(kuò) 增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。但是對LAMP擴(kuò)增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī) 的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴(kuò)增所帶來的假陽性問題，而且需 要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。沙門氏桿菌(Salmonella)是一大群寄生于人類和動物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu) 造相似的革蘭氏陰性桿菌，統(tǒng)稱為沙門氏菌屬。1880年Eberth首先發(fā)現(xiàn)傷寒桿菌，1885 年Salmon分離到豬霍亂桿菌，由于Salmon發(fā)現(xiàn)本屬細(xì)菌的時間較早，在研究中的貢獻(xiàn)較 大，遂定名為沙門氏菌屬。目前至少有67種0抗原和2000個以上血清型，所致疾病稱沙 門氏菌病。根據(jù)其對宿主的致病性，可分為三類①對人致??；②對人和動物均致??；③ 對動物致病。與人類關(guān)系密切的沙門氏菌有傷寒沙門氏菌(S. typhi)，甲、乙、丙型副傷 寒沙門氏菌(S. paratyphiA/B/C)，鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)，豬霍亂沙門氏菌 (S. choleraesuis)，腸炎沙門氏菌(S. enteritidis)等十余種。目前針對沙門氏桿菌缺乏 簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測沙門氏桿菌專有的入侵蛋白irwA基 因片段經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，從而判定沙門氏桿菌的存在 與否。本發(fā)明試劑盒結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的 靈敏度，是一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低廉、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng) 用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的 沙門氏桿菌病毒檢測。
本發(fā)明試劑盒包括兩部分1.標(biāo)記有可以識別沙門氏桿菌特定序列的分子探針的納米金顆粒；2.可以擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢 測樣品中的沙門氏桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。該試劑盒的工作原理為1.納米金顆粒標(biāo)記有能識別沙門氏桿菌特定序列的分子探針，分子探針被固定在 納米金顆粒的表面。 2.待檢測樣品中的沙門氏桿菌DNA分子或沙門氏桿菌RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增 技術(shù)大量復(fù)制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程后大量復(fù)制，沙門氏桿菌的目標(biāo)片段被放大109倍，產(chǎn)生的 擴(kuò)增產(chǎn)物DNA具有多重重復(fù)序列。3.混合納米金顆粒和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系，沙門氏桿菌經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò) 增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識別沙門氏桿菌特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所 示)，進(jìn)而引發(fā)納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可 以判斷待測樣品是否具有沙門氏桿菌DNA或RNA。
四

標(biāo)記有分子探針的納米金顆粒與沙門氏桿菌經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的 產(chǎn)物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體。
五具體實(shí)施例方式本發(fā)明試劑盒包括2管溶液，一管中是標(biāo)記有可以識別沙門氏桿菌特定序列的分 子探針的納米金顆粒溶液50 yl，一管中是250 yl可以擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌 DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增 體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20nm的納米金顆粒，濃度為1. 2nM，納米金顆粒表 面標(biāo)記有巰基修飾的DNA探針。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系成分如下0. 2 iiM F3禾口 B3弓丨物，1.6iiM FIP和BIP引 物，0. 4Mbetaine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，lOmM MgS04,1. 4mM dNTPs, 1 X ThermoPol reactionbuffer(New England Biolabs, Ipswich, MA),80 U Bst DNA polymerase(New England Biolabs) ,6. 25 U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)。巰基修飾的DNA探針序列5' -TGTGAACTTTATTGGCAAAAAAAA-SH-3‘引物序列沙門氏桿菌的F3引物5 ‘ -GCGAAGCGTACTGGAAAGG-3‘沙門氏桿菌的B3引物5 ‘ -TCAACAATGCGGGGATCTG-3‘沙門氏桿菌的FIP引物
4
5 ‘ -ATGATGCCGGCAATAGCGTCACAAAGCCAGCTTTACGGTTCC-3‘沙門氏桿菌的BIP引物5 ‘ -GGATGACCCGCCATGGTATGGACCATCACCAATGGTCAGC-3‘操作過程如下1.向裝有環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系的管中加入10 iU提取的核酸或者血液樣品。2.將裝有混合物的管放入60°C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時混合后的溶液為紅色。4. 60°C水浴反應(yīng)15分鐘。觀察反應(yīng)后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有沙門氏桿菌感染特異性 RNA或沙門氏桿菌DNA ；如果溶液變?yōu)闇\紫色，則判定樣本中含有沙門氏桿菌感染特異性的 RNA或沙門氏桿菌DNA。此種情況下，如果樣品是血液樣品，那么提供血樣的人已經(jīng)被沙門 氏桿菌所感染。
權(quán)利要求
一種用納米金顆粒檢測沙門氏桿菌經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(1)標(biāo)記有可以識別沙門氏桿菌特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該試劑盒的工作原理為(1)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢 測樣品中的沙門氏桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢 測樣品中的沙門氏桿菌RNA ;(2)納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜 交；(3)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導(dǎo)致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣品 是否含有沙門氏桿菌DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分 是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別沙門氏桿菌的特定序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2，待檢測樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對象可以是沙門氏 桿菌DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā) 生在溶液中或者固體表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶 液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學(xué)儀器檢 測。
8.根據(jù)權(quán)利要求3，分子探針是指可以識別環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能 分子，這些分子包括DNA，RNA，PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反 應(yīng)時間等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測沙門氏桿菌DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準(zhǔn)確、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的沙門氏桿菌檢測。本發(fā)明試劑盒包括兩部分(1)標(biāo)記有可以識別沙門氏桿菌特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測樣品中的沙門氏桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
文檔編號C12Q1/68GK101824480SQ201010174460
公開日2010年9月8日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者孫國明 申請人:天津朝?？萍加邢薰?br>