專利名稱：乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定hbv－dna試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒及其制備方法，屬于分子生物學(xué)與免疫學(xué)診斷試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)是肝炎的主要致病因子，在全世界乙型肝炎病毒攜帶者約1.5億人。乙肝核心抗原(HBcAg)存在于乙肝病毒顆粒中，而不是以游離狀態(tài)存在于血液中，是乙肝病毒活動(dòng)的直接指標(biāo)。但長(zhǎng)期以來(lái)，臨床醫(yī)生是根據(jù)“兩對(duì)半”五種試劑盒檢驗(yàn)結(jié)果判斷乙肝患者的病情，根據(jù)HBV DNA PCR熒光定量試劑盒對(duì)血清乙肝病毒DNA測(cè)定了解藥物療效。但“兩對(duì)半”試劑不能很好的反映乙肝病毒的存在狀況，不能定量；HBV DNA熒光定量PCR試劑盒雖能定量HBV DNA拷貝數(shù)，但不能反映病毒真實(shí)狀態(tài)和患者免疫反應(yīng)情況，且價(jià)格昂貴操作復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠定量測(cè)定HBV DNA拷貝數(shù)并且真實(shí)反映患者免疫情況的乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV DNA試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒，保存于4℃，包括(1)熒光定量HBV-DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品6支，DNA含量分別為2×103、2×104、2×105、2×106、2×107、2×108copies/ml，保存于-20℃；(2)HBV表面抗體(HBsAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條(48孔或96孔)；(3)HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條(48孔或96孔)；(4)開殼劑(體積百分比濃度)5～15％的乙基苯基聚乙二醇40(NP-40)溶液；(5)酶標(biāo)記核心抗體HBV核心抗體(HBcAb)單抗偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶，保存于-20℃；(6)底物顯色劑A液(體積百分比濃度)1～3％的H2O2，B液(質(zhì)量百分比濃度)0.15％四甲基聯(lián)苯胺；(質(zhì)量百分比濃度)8～13％的海藻糖保護(hù)劑；(7)陽(yáng)性對(duì)照核心抗原(HBcAb)陽(yáng)性血清，保存于-20℃；(8)陰性對(duì)照正常人血清，含濃度(體積百分比濃度)為0.5～1.5‰的PC300，保存于-20℃；(9)終止液2N H2SO4；(10)洗滌液PBS-吐溫20。
本發(fā)明的原理是利用ELISA夾心法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)血清的核心抗原OD值和待測(cè)血清的核心抗原OD值，然后以標(biāo)準(zhǔn)血清DNA含量為縱坐標(biāo)，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)血清核心的OD值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線；通過(guò)待測(cè)血清核心抗原的OD值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得血清中相對(duì)的HBV DNA含量。從而根據(jù)HBcAg酶聯(lián)免疫測(cè)定的OD值就能判斷治療乙肝病人藥物的效果及病情的變化。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種上述試劑盒的制備方法。
乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒的制備方法，包括下列步驟(步驟順序可以前后調(diào)整，不影響效果)(1)制備熒光定量HBV-DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品采用熒光定量PCR方法，將HBV大三陽(yáng)血清或小三陽(yáng)血清分別制備成DNA含量為2×103、2×104、2×105、2×106、2×107和2×108copies/m的血清標(biāo)準(zhǔn)品；于-20℃保存(2)用HBV表面抗體(HBsAb)多抗包被酶標(biāo)板稱取適量HBV表面抗體(HBsAb)多抗，加入到pH值為9.6的碳酸緩沖液中至多抗最終濃度為5-12微克/毫升，每反應(yīng)孔加100微升，加蓋后置4℃過(guò)夜甩干；用(體積百分比濃度)10％的正常牛血清，加入反應(yīng)孔110微升，4℃過(guò)夜，甩干，干燥后，真空包裝，于4℃保存；(3)用HBV核心抗體(HBcAb)多抗包被酶標(biāo)板稱取適量HBV核心抗體(HBcAb)多抗，加入到pH值為9.6的碳酸緩沖液中至多抗最終濃度為5-10微克/毫升，每反應(yīng)孔加100微升，加蓋后置4℃過(guò)夜甩干；用10％的正常牛血清，加入反應(yīng)孔110微升，4℃過(guò)夜，甩干，干燥后，真空包裝，于4℃保存；(4)配制開殼劑配制5-15％的乙基苯基聚乙二醇40(NP-40)溶液；(5)制備酶標(biāo)記核心抗體將辣根過(guò)氧化物酶與HBV核心抗體(HBcAb)單抗用過(guò)碘酸鈉偶聯(lián)，10000轉(zhuǎn)/分離心10-15分鐘，得沉淀，將沉淀融于0.2M的磷酸緩沖液，對(duì)磷酸緩沖液透析4～8小時(shí)，得標(biāo)記物，于-20℃保存；(6)制備底物顯色劑于4℃保存A液用0.1M檸檬酸緩沖液配制3％的雙氧水溶液；B液用0.1M檸檬酸緩沖液及8-13％的海藻糖配制0.15％的四甲基聯(lián)苯胺溶液；(7)制備陽(yáng)性對(duì)照核心抗原(HBcAg)和HBV DNA同為陽(yáng)性的血清，60℃放置1小時(shí)，除菌過(guò)濾，測(cè)定OD值大于0.35，于-20℃保存；(8)制備陰性對(duì)照取OD值小于0.03的正常人血清，加保護(hù)劑PC300(PROCLIN300，購(gòu)自美國(guó)SIGAMA公司)，最終濃度在0.5～1.5‰PC300，于-20℃保存?zhèn)溆茫?9)制備洗滌液配制0.15MPBS pH7.4-0.05％吐溫20，于4℃保存；(10)制備終止液用濃硫酸配制2N H2SO4，于4℃保存；(11)半成品的分裝將各種試劑按48人份或96人份用量分裝到滴瓶或1.5毫升離心管中；(12)成品的組裝將半成品組裝成乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)HBV DNA試劑盒，放于4℃保存。
所述HBV表面抗體(HBsAb)多抗的制備及純化方法是用乙肝表面抗原免疫羊，得抗表面抗原多抗血清；用硫酸氨分級(jí)沉淀處理表面抗原多抗血清，得多抗粗品；用離子交換柱分離純化多抗粗品得BV表面抗體(HBsAb)多抗純品。
所述HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗的制備方法是(1)用乙肝核心抗原(HBcAg)免疫兔，得抗HBcAg多抗血清；用乙肝核心抗原免疫Balb/C小鼠得陽(yáng)性鼠脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選高效價(jià)(效價(jià)大于1∶2000以上即可選用)陽(yáng)性細(xì)胞，用該陽(yáng)性細(xì)胞株制備小鼠腹水；(2)抗HBcAg多抗血清和小鼠腹水分別用硫酸氨或正辛酸常規(guī)方法處理，得HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗粗品；(3)將HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗粗品通過(guò)DEAE陰離子離子交換層析，得HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗純品。
單克隆抗體的制備方法為本領(lǐng)域的公知技術(shù)，本發(fā)明制備的HBV核心抗體(HBcAb)單抗并不針對(duì)特定的抗原結(jié)合位點(diǎn)，凡是效價(jià)1∶2000以上的HBV核心抗體(HBcAb)單抗均可與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)制成酶標(biāo)記抗體，并能取得本發(fā)明的效果。而且制備效價(jià)超過(guò)1∶2000的HBV核心抗體(HBcAb)單抗的過(guò)程并不需要花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過(guò)有限次數(shù)的實(shí)驗(yàn)即可篩選到令人滿意的雜交瘤細(xì)胞株。因此，本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了充分的公開，無(wú)須對(duì)某個(gè)雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行特定保藏以重現(xiàn)本發(fā)明的內(nèi)容。同理，無(wú)論是采用哪個(gè)細(xì)胞株分泌的HBV核心抗體(HBcAb)單抗來(lái)制備酶標(biāo)記抗體，均不得用于仿制本發(fā)明。進(jìn)一步說(shuō)，使用或者購(gòu)買他人合法制備或銷售的HBV核心抗體(HBcAb)單抗用于制備酶標(biāo)記抗體，也不得用于仿制本發(fā)明。
本發(fā)明的試劑盒在使用時(shí)可如下操作一.檢測(cè)1.取出HBV表面抗體多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條，蒸餾水洗2次，拍干。
2.設(shè)空白對(duì)照1孔，陰性、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，每孔加入陰陽(yáng)血清各100ul(空白孔不加)，定量HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)血清6孔，其余各孔加入待檢標(biāo)本100ul，用封片紙封好，置45℃溫育30分鐘。
3.棄去孔內(nèi)液體，用蒸餾水洗7次，拍干。
4.加開殼劑每孔加入開殼劑3滴(空白孔不加)置45℃溫育30分鐘。
5.取出HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條，蒸餾水洗2次，拍干。
6.用100ul加樣器吸取HBV表面抗體多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條上的開殼液50ul轉(zhuǎn)移到檢測(cè)HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，每吸一份樣品要更換一個(gè)吸頭。然后，每孔加入酶標(biāo)記核心抗體(HRP-HbcAgMcAb結(jié)合物)1滴(50ul)(空白孔不加)，震蕩混勻1分鐘，封板，置45℃溫育30分鐘。
7.棄去孔內(nèi)液體，用蒸餾水洗7次，拍干。
8.每孔加入底物顯色劑A液、B液各1滴，混勻，室溫放置10～20分鐘。
9.每孔加入終止液1滴，混勻，立即上酶標(biāo)儀測(cè)OD值。
二.結(jié)果判讀以HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從各待測(cè)血清OD值就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出血清的HBV DNA含量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的試劑盒能非常專一而準(zhǔn)確的通過(guò)檢測(cè)乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定血清HBV DNA的含量。具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定等特點(diǎn)。比PCR檢測(cè)快速的多，乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)HBV DNA試劑盒不僅能檢測(cè)核心抗原，而且能定量測(cè)定HBV DNA拷貝數(shù)，因此本試劑盒對(duì)判斷病人是否有乙肝病毒復(fù)制，對(duì)確定乙肝感染病程預(yù)后及藥物療效具有十分重要的指導(dǎo)意義。PCR檢測(cè)法需要貴重的儀器設(shè)備，試劑昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員要求很高，收費(fèi)高。本試劑盒整個(gè)實(shí)驗(yàn)中不需要貴重儀器設(shè)備，試劑便宜，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員要求低，收費(fèi)低廉，能適應(yīng)各級(jí)醫(yī)院及臨床檢驗(yàn)中心。本發(fā)明是一種對(duì)HBV感染、復(fù)制和乙肝病人診斷、治療和預(yù)后判斷新的量化檢測(cè)方法。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，凡是根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容或者原理，實(shí)施的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV DNA試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為HBcAg ELLSA測(cè)定的OD值，縱坐標(biāo)為定量HBV DNA的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV DNA試劑盒的制備一.備并純化抗HbsAg多抗用HbsAg(購(gòu)自北京美迪科生物技術(shù)有限公司)免疫兔子(購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)，得抗血清；在抗血清中加入飽和硫酸氨至終濃度為33％，并攪拌1小時(shí)；4000g離心15分鐘，去上清；沉淀用與上述相同體積的飽和硫酸氨重新溶解并到沉淀；4000g離心15分鐘，棄上清，用適當(dāng)磷酸緩沖液溶解并透析，得粗品多抗，再經(jīng)DEAE柱層析去掉雜蛋白(DEAE纖維層析柱購(gòu)自PHAMACIAL公司)，用PB緩沖液預(yù)先平衡DEAE柱，然后進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，通過(guò)免疫沉淀或瓊脂擴(kuò)散確定該蛋白峰含有HbsAg多抗，用磷酸緩沖液透析8-10小時(shí)得HbsAg多抗。效價(jià)1-3萬(wàn)。
二.制備并純化HBcAg多抗和單抗用HBcAg(購(gòu)自中國(guó)人民解放軍302醫(yī)院免疫研究所)，免疫兔子(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)，得抗血清，在抗血清中加入飽和硫酸氨至終濃度為33％，并攪拌1小時(shí)；4000g離心15分鐘，去上清；沉淀用與上述相同體積的飽和硫酸氨重新溶解并到沉淀；4000g離心15分鐘，棄上清，用適當(dāng)磷酸緩沖液溶解并透析，得粗品多抗，再經(jīng)DEAE柱層析去掉雜蛋白(DEAE纖維層析柱購(gòu)自PHAMACIAL公司)，收集蛋白峰，通過(guò)免疫沉淀或瓊脂擴(kuò)散確定該蛋白峰含有HbcAg多抗，用磷酸緩沖液透析8-10小時(shí)得HbcAg多抗。
用HBcAg免疫Balb/C小鼠(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)，分三次免疫，每次相隔2個(gè)星期，用ELISA法檢測(cè)抗原特異性抗體；然后獲得免疫脾細(xì)胞，將此脾細(xì)胞與預(yù)先準(zhǔn)備好的骨髓腫瘤細(xì)胞以5∶1～10∶1比例混合，加入20～25mlRPMI-1640培養(yǎng)液(購(gòu)自美國(guó)INVITROGENE公司)，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清，得細(xì)胞沉淀并使其分散，加入1毫升30-50％的聚乙醇8000，得融合細(xì)胞，于HAT培養(yǎng)基(美國(guó)INVITROGENE公司)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)板孔的上清夜中可用ELISA或瓊脂糖擴(kuò)散法檢測(cè)到雜交瘤細(xì)胞分泌的特異性抗體。通過(guò)進(jìn)一步篩選克隆，建立分泌高效價(jià)特異性抗體的單克隆細(xì)胞株，于液氮中保存。用培養(yǎng)好的分泌高效價(jià)特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞注入到BALB/c小鼠的腹腔，得腹水；采用常用的正辛酸法純化；得單抗。
用上述方法得純品多抗和單抗。效價(jià)多抗1-3萬(wàn)，單抗4-5萬(wàn)。
三.制備HbsAg多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條1.包被稱取適量HbsAg多抗，加入到pH值為9.6的碳酸緩沖液中至最終HbsAg多抗?jié)舛仍?～12微克/毫升，每反應(yīng)孔加100微升，加蓋后置4℃過(guò)夜，甩干；2.封閉用10％的正常牛血清，加入反應(yīng)孔110微升，4℃過(guò)夜，甩干，再在吸水紙上拍干，待干燥后，真空包裝，于4℃保存。
四.制備HBcAg多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條1.包被稱取適量HbcAg多抗，加入到pH值為9.6的碳酸緩沖液中至HBcAg多抗最終濃度為5-10微克/毫升，每反應(yīng)孔加100微升，加蓋后置4℃過(guò)夜甩干；2.封閉用10％的正常牛血清，加入反應(yīng)孔110微升，4℃過(guò)夜，甩干，再在吸水紙上拍干，待干燥后，真空包裝，于4℃保存。
五.制備酶標(biāo)HbcAb單抗為本領(lǐng)域常規(guī)方法將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)(購(gòu)自上海生化所)與HbcAb單抗用過(guò)碘酸鈉偶聯(lián)，(HRP和HbcAb單抗的用量各是4mg和8mg)10000轉(zhuǎn)/分離心10～15分鐘分鐘，得沉淀，將沉淀融于0.2M的磷酸緩沖液，并對(duì)磷酸緩沖液透析4～8小時(shí)，得標(biāo)記物。效價(jià)大于1500，于-20℃保存。
采用棋盤滴定法確定酶標(biāo)抗體的最價(jià)工作濃度大于1∶3000。
六.制備熒光定量HBV-DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品用熒光定量PCR定量的HBV DNA血清(血清來(lái)自淮南肝病研究所)，制備成為標(biāo)準(zhǔn)品為2×103、2×104、2×105、2×106、2×107、2×108copies/ml，共6支，于-20℃保存。
七.制備陽(yáng)性對(duì)照HBcAg和HBV DNA同為陽(yáng)性的血清(血清來(lái)自北京右安醫(yī)院)，60℃放置1小時(shí)，除菌過(guò)濾，用本試劑盒測(cè)定OD值大于0.35，分裝，于-20℃保存，備用。
八.制備陰性對(duì)照用本試劑盒測(cè)定正常人血清OD值小于0.03，加保護(hù)劑PC300，最終濃度在0.5～1.5‰，分裝于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 九.配制底物顯色液A液用0.1M檸檬酸緩沖液配制3％的雙氧水溶液。
B液用0.1M檸檬酸緩沖液及8-13％的海藻糖配制0.15％的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液。
十.配制終止液用濃硫酸配制成2N硫酸液即可。
十一.半成品和成品的組裝上述試劑按要求量48人份或96人份用量進(jìn)行分裝，分裝到滴瓶中或1.5毫升離心管中，既為半成品，抽檢合格，組裝成乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)HBV DNA試劑盒。組裝成成品再抽檢，合格品放于4℃保存。
實(shí)施例2HBcAg定量測(cè)定HBV DNA的使用方法一.檢測(cè)1.從試劑盒中取出HBV表面抗體多抗預(yù)包被反應(yīng)條板，在室溫放置一段時(shí)間，至板條溫度與室溫一致，蒸餾水洗2次，拍干。
2.反應(yīng)孔中分別加各濃度HBV DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)血清、陰性血清及陽(yáng)性血清各100微升，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白1孔，加緩沖液100微升，45℃反應(yīng)30分鐘。
3.棄去孔內(nèi)液體，用蒸餾水洗7次，拍干。
4.加開殼劑每孔加入開殼劑3滴(空白孔不加)置45℃溫育30分鐘(注意千萬(wàn)不能將此液倒掉)。
5.取出HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條，蒸餾水洗2次，拍干。
6.用100ul加樣器吸取HBV表面抗體多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條上的開殼液50ul轉(zhuǎn)移到檢測(cè)HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條的對(duì)應(yīng)孔內(nèi)，每吸一份樣品要更換一個(gè)吸頭。然后，每孔加入酶標(biāo)記核心抗體(HRP-HbcAgMcAb結(jié)合物)1滴(50ul)(空白孔不加)，震蕩混勻1分鐘，封板，置45℃溫育30分鐘。
7.棄去孔內(nèi)液體，用蒸餾水洗7次，拍干。
8.每孔加入底物顯色劑A液、B液各1滴，混勻，室溫放置10～20分鐘。
9.每孔加入終止液1滴，混勻，立即上酶標(biāo)儀測(cè)OD值。
二.結(jié)果判讀以HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，從各待測(cè)血清OD值就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出血清的HBV DNA含量。
1.核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV DNA試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定用熒光定量PCR定量的HBV DNA血清，制備成為標(biāo)準(zhǔn)品為2×103、2×104、2×105、2×106、2×107、2×108copies/ml，共6支。用本試劑盒檢測(cè)的6種標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)含量為縱坐標(biāo)，繪制成核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBVDNA試劑盒的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
2.試劑盒臨界(cut off)值的確立根據(jù)陰陽(yáng)性血清OD值，建立OD值與人群的正態(tài)分布，所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。我們找來(lái)已測(cè)定的450份陰性血清用兩家進(jìn)口試劑、兩家國(guó)產(chǎn)試劑，對(duì)450份陰性血清進(jìn)行鑒定，確定后從中選出400份陰性血清用我們自己的試劑盒進(jìn)行鑒定，測(cè)出最高值為0.08、最低值為0.01，因此我們定出界限值為2.1×陰性對(duì)照平均值(N)如N值低于0.05按0.05計(jì)算，高于0.05按實(shí)際值計(jì)算，界限值±10％為可疑，如界限值＝2.1×0.05＝0.105，0.105+0.011～0.105-0.011為可疑區(qū)。即0.116～0.094為可疑區(qū)。0.105～0.116為陽(yáng)性可疑區(qū)，0.094～0.105為陰性可疑區(qū)?？梢蓸?biāo)本應(yīng)重復(fù)，如重復(fù)試驗(yàn)仍為可疑，陽(yáng)性可疑報(bào)陽(yáng)性，陰性可疑報(bào)陰性。
實(shí)施例3HBcAg ELISA定量測(cè)定HBV DNA應(yīng)用與熒光定量PCR檢測(cè)HBVDNA比較一.臨床標(biāo)本來(lái)源本發(fā)明人從淮南肝病研究所和北京佑安醫(yī)院收集152份陽(yáng)性血清，其中大三陽(yáng)79例、小三陽(yáng)73例，和43全陰性血清；共195份血清。然后用本發(fā)明方法和商品化的熒光定量HBV DNA PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)這些血清進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。
二.測(cè)定方法HBcAg ELISA定量測(cè)定血清HBV DNA按使用說(shuō)明書(試劑盒自制)進(jìn)行操作(方法同實(shí)施例2)，熒光定量HBV DNA PCR測(cè)定按廣州中山達(dá)安基因科技股份公司生產(chǎn)的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)同一血樣195份，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明，該兩種方法檢測(cè)的結(jié)果具有很好的一致性。
三.結(jié)果
采用本發(fā)明方法和達(dá)安基因公司的熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)收集的195份血清同時(shí)進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在79份大三陽(yáng)血清中，本發(fā)明方法檢測(cè)的陽(yáng)性為73例，熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性為78例，檢測(cè)符合率達(dá)93.4％，血清HBV DNA定量準(zhǔn)確性達(dá)91.2％；在73份小三陽(yáng)血清中，本發(fā)明方法檢測(cè)出42例，熒光定量PCR檢測(cè)出46例，檢測(cè)符合率達(dá)91.3％，血清HBV DNA定量準(zhǔn)確性92.7％；在43份陰性血清中，本發(fā)明方法和熒光定量PCR方法檢測(cè)的結(jié)果都為陰性，特異性符合率為100％。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明方法和熒光定量PCR檢測(cè)方法具有顯著的相關(guān)性(P＜0.01)。
綜上所述，本發(fā)明方法能非常特異的通過(guò)核心抗原ELISA檢測(cè)而定量測(cè)定出血清HBV DNA，與目前的熒光定量PCR方法檢測(cè)HBV DNA具有高度一致性，檢測(cè)符合率和定量準(zhǔn)確性都達(dá)到91％以上，符合實(shí)際臨床檢驗(yàn)要求，既能測(cè)定核心抗原還能定量HBV DNA，因而本發(fā)明對(duì)判斷病人是否有病毒復(fù)制，對(duì)確定乙肝感染病程預(yù)后和用藥后的療效具有重要的指導(dǎo)意義。而且本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用性強(qiáng)；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需貴重設(shè)備儀器，試劑盒價(jià)格低廉，適合各基層醫(yī)療單位。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒，其特征在于該試劑盒包括(1)熒光定量HBV-DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品6支，DNA含量分別為2×103、2×104、2×105、2×106、2×107、2×108copies/ml；(2)HBV表面抗體(HBsAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條；(3)HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條；(4)開殼劑5～15％的乙基苯基聚乙二醇40(NP-40)溶液；(5)酶標(biāo)記核心抗體HBV核心抗體(HBcAb)單抗偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶；(6)底物顯色劑A液1～3％的H2O2，B液0.15％四甲基聯(lián)苯胺；8～13％的海藻糖保護(hù)劑；(7)陽(yáng)性對(duì)照核心抗原(HBcAb)陽(yáng)性血清；(8)陰性對(duì)照正常人血清；(9)終止液2N H2SO4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括(10)洗滌液PBS-吐溫20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV DNA試劑盒，其特征在于所述HBV表面抗體多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條為48孔或96孔。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV DNA試劑盒，其特征在于所述HBV核心抗體多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條為48孔或96孔。
5.權(quán)利要求2-4中任何一項(xiàng)所述的乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒的制備方法，包括下列步驟(1)制備熒光定量HBV-DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品采用熒光定量PCR方法，將HBV大三陽(yáng)血清或小三陽(yáng)血清分別制備成DNA含量為2×103、2×104、2×105、2×106、2×107和2×108copies/m的血清標(biāo)準(zhǔn)品；(2)用HBV表面抗體(HBsAb)多抗包被酶標(biāo)板稱取適量HBV表面抗體(HBsAb)多抗，加入到pH值為9.6的碳酸緩沖液中至多抗最終濃度為5-12微克/毫升，每反應(yīng)孔加100微升，加蓋后置4℃過(guò)夜，甩干；用10％的正常牛血清，加入反應(yīng)孔110微升，4℃過(guò)夜，甩干，干燥后，真空包裝，于4℃保存；(3)用HBV核心抗體(HBcAb)多抗包被酶標(biāo)板稱取適量HBV核心抗體(HBcAb)多抗，加入到pH值為9.6的碳酸緩沖液中至多抗最終濃度為5-10微克/毫升，每反應(yīng)孔加100微升，加蓋后置4℃過(guò)夜甩干；用10％的正常牛血清，加入反應(yīng)孔110微升，4℃過(guò)夜，甩干，干燥后，真空包裝，于4℃保存；(4)配制開殼劑配制5-15％的乙基苯基聚乙二醇40(NP-40)溶液；(5)制備酶標(biāo)記核心抗體將辣根過(guò)氧化物酶與HBV核心抗體(HBcAb)單抗用過(guò)碘酸鈉偶聯(lián)，10000轉(zhuǎn)/分離心10-15分鐘，得沉淀，將沉淀融于0.2M的磷酸緩沖液，對(duì)磷酸緩沖液透析4～8小時(shí)，得標(biāo)記物，于-20℃保存；(6)制備底物顯色劑A液用0.1M檸檬酸緩沖液配制3％的雙氧水溶液；B液用0.1M檸檬酸緩沖液配制0.15％的四甲基聯(lián)苯胺溶液含8-13％的海藻糖；(7)制備陽(yáng)性對(duì)照核心抗原(HBcAg)和HBV DNA同為陽(yáng)性的血清，60℃放置1小時(shí)，除菌過(guò)濾，測(cè)定OD值大于0.35，于-20℃保存；(8)制備陰性對(duì)照取OD值小于0.03的正常人血清，加保護(hù)劑PC300，最終濃度在0.5～1.5‰ PC300于-20℃保存?zhèn)溆茫?9)制備洗滌液配制0.15MPBS PH7.4-0.05％吐溫20；(10)制備終止液用濃硫酸配制2N H2SO4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒的制備方法，其特征在于所述HBV表面抗體(HBsAb)多抗的制備及純化方法是用乙肝表面抗原免疫羊，得抗表面抗原多抗血清；用硫酸氨分級(jí)沉淀處理表面抗原多抗血清，得多抗粗品；用離子交換柱分離純化多抗粗品得BV表面抗體(HBsAb)多抗純品。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒的制備方法，其特征在于所述HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗的制備方法是(1)用乙肝核心抗原(HBcAg)免疫兔，得抗HBcAg多抗血清；用乙肝核心抗原免疫Balb/C小鼠得陽(yáng)性鼠脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞，篩選效價(jià)高于1∶2000的陽(yáng)性細(xì)胞，用該陽(yáng)性細(xì)胞株制備小鼠腹水；(2)抗HBcAg多抗血清和小鼠腹水分別用硫酸氨或正辛酸常規(guī)處理，得HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗粗品；(3)將HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗粗品通過(guò)DEAE陰離子離子交換層析，得HBV核心抗體(HBcAb)多抗和HBV核心抗體(HBcAb)單抗純品。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV-DNA試劑盒的制備方法，其特征在于所述制備方法還包括(11)半成品的分裝將各種試劑按48人份或96人份用量分裝到滴瓶或1.5毫升離心管中；(12)成品的組裝將半成品組裝成乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)HBV DNA試劑盒，放于4℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定HBV－DNA試劑盒及其制備方法，屬于分子生物學(xué)與免疫學(xué)診斷試劑領(lǐng)域。該試劑盒包括(1)熒光定量HBV－DNA血清標(biāo)準(zhǔn)品6支，(2)HBV表面抗體(HBsAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條；(3)HBV核心抗體(HBcAb)多抗預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)條；(4)開殼劑；(5)酶標(biāo)記核心抗體；(6)底物顯色劑；(7)陽(yáng)性對(duì)照；(8)陰性對(duì)照；(9)終止液。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能非常專一而準(zhǔn)確的通過(guò)檢測(cè)乙肝核心抗原酶聯(lián)免疫定量測(cè)定血清HBV DNA的含量。具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定等特點(diǎn)。本試劑盒整個(gè)實(shí)驗(yàn)中不需要貴重儀器設(shè)備，試劑便宜，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和人員要求低，收費(fèi)低廉，能適應(yīng)各級(jí)醫(yī)院及臨床檢驗(yàn)中心。
文檔編號(hào)G01N33/576GK101046477SQ20071009892
公開日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者陳禹保 申請(qǐng)人:陳禹保, 北京中亞國(guó)瑞生物經(jīng)濟(jì)研究所