專利名稱：梅毒抗體與乙型肝炎表面抗原膠體金法聯(lián)合檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥品生物制品類，體外診斷試劑的范疇。用一滴血就可以檢測患者是否感染梅毒或乙肝病毒，是一種新組合快速檢測試劑。
背景技術(shù)：
膠體金標記及檢測技術(shù)目前已經(jīng)比較成熟。現(xiàn)有已經(jīng)商品化的試劑是梅毒或乙肝表面抗原分別檢測，但沒有聯(lián)合檢測試劑的報道。
眾所周知，目前我國梅毒及乙肝發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，以及我國獻血政策的改革，血液中心街頭采血車對義務(wù)獻血人員的體檢顯得非常重要，這就要求能夠有一種簡便、快速、特異性強、準確率高、少量末梢血(50μL)就可以檢測幾種發(fā)病率較高疾病的試劑。我們發(fā)明的這種聯(lián)合檢測試劑可以克服單品種檢測試劑的局限性，滿足血液中心街頭采血車對義務(wù)獻血員篩查以及家庭自助檢測等快速檢測的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過將梅毒抗原、抗乙肝表面抗原單克隆抗體通過特殊的噴點設(shè)備分別噴點固定在購自millipore公司的硝酸纖維素膜上，再將已預(yù)先用膠體金標記好的基因重組梅毒抗原及表面抗原單抗按比例混合，選用最佳金標結(jié)合物保護液、及金結(jié)合物吸收墊，采用雙抗原夾心及雙抗體夾心法原理(三條線)，分別檢測人血液中的梅毒抗體或乙肝表面抗原。本試紙條靈敏度高，特異性好?？梢酝ㄟ^中國藥品生物制品檢定所制定的梅毒抗體及乙肝表面抗原國家標準。
本發(fā)明的優(yōu)勢在于兩種疾病的聯(lián)合檢測，填補了國內(nèi)在這方面的空白。由于兩種疾病可以同時檢測，用肉眼進行結(jié)果判讀，實驗結(jié)果簡單明了，不需要特殊儀器。為家庭自助檢測疾病及血液中心街頭義務(wù)獻血員篩查及其他一些需要快速檢測的機構(gòu)提供了一種方便快捷準確的檢測方法。


附圖1 試劑條組裝示意圖附圖2本試劑條實驗結(jié)果模式A試紙條外觀模擬圖(使用前)，B梅毒陽性檢測結(jié)果，C乙型肝炎表面抗原陽性檢測結(jié)果，D梅毒、乙肝表面抗原均陽性檢測結(jié)果，E陰性檢測結(jié)果，F(xiàn)無效實驗(使用后，出現(xiàn)這樣的結(jié)果必須重復(fù)實驗)具體實施方式
由本發(fā)明申請單位獨家生產(chǎn)該產(chǎn)品制備程序1檢測試劑條的制備1.1檢測線和對照線包被檢測線I包被液配制用0.01MPH8.0磷酸鹽緩沖液，將基因工程重組的TP抗原配制成1.0mg/ml待用。
檢測線II包被液配制用0.01MPH8.0磷酸鹽緩沖液，將已事先純化合格的鼠抗-HBs抗原配制成3.0mg/ml待用。
對照線包被液配制用0.01MPH8.0磷酸鹽緩沖液，將羊抗鼠抗-HBs配制為3.0mg/ml待用。
檢測線I、II劃線將事先配制好的檢測線I包被液、檢測線II包被液分別裝入分液機的指定裝置內(nèi)(BioDot蛋白微量噴點系統(tǒng))，在硝酸纖維素膜上按0.1μl/mm的量劃上兩條檢測線I、II。(膜的規(guī)格為25mm×310mm)。
對照線劃線取事先配制好對照線包被液裝入BioDot噴膜機中(蛋白微量噴點系統(tǒng))，在硝酸纖維素膜上按0.1μl/mm的量劃上對照線。(膜的規(guī)格為25mm×310mm)。
包被37℃2小時。
封閉將溫育后的硝酸纖維素膜放入封閉液中浸泡30分鐘，再用蒸餾水洗兩次，在37℃真空干燥器內(nèi)干燥16小時，真空度0.1。
封裝在干燥室內(nèi)(濕度＜20％)，將干燥好的硝酸纖維素膜裝入鋁箔袋內(nèi)，封口。外加干燥劑防潮。
1.2膠體金-TP抗原、抗-HBs結(jié)合物墊的制備。
原理根據(jù)金標技術(shù)特性，將膠體溶液中納米級的金顆粒與純化的基因重組TP抗原及抗-HBs單克隆抗體分別穩(wěn)定結(jié)合，形成紫紅色的金標記TP抗原、抗-HBs抗體結(jié)合物，金顆粒的直徑為40-50nm。
金標抗原濃度和pH的選擇采用交叉配比法，TP抗原最適標記濃度為100μg/ml，pH為8.0?？?HBs的最適標記濃度為60μg/ml，pH值為8.5。
膠體金的準備取購自SIGMA公司AuCL4產(chǎn)品稀釋為0.01％的水溶液，煮沸，攪動下準確加入1％檸檬酸三鈉水溶液0.7ml，金黃色的氯金酸水溶液在2分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15分鐘，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積。
偶聯(lián)將以上事先制備好的膠體金溶液先用0.2MK2CO3調(diào)節(jié)pH值至最適范圍，再按最適標記濃度比例加入TP抗原或抗-HBs抗體，分別標記，室溫攪拌30分鐘。
封閉加入10％PEG20000使終濃度為1％，攪拌20分鐘。
混合將上述已標記合格的TP或抗-HBs金結(jié)合物按1∶1的比例混合。
包被取10mm×310mm玻璃纖維在上述混合液中浸泡5~10分鐘。
干燥將標記后玻璃纖維放入真空干燥器內(nèi)干燥20小時，真空度0.1。
封裝在干燥室內(nèi)(濕度＜20％)，將已干燥好的玻璃纖維裝入事先裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，機器封口。
1.3組裝(如下圖所示)備料在干燥室內(nèi)(濕度＜20％)，將已劃好線的硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合物墊、吸水濾紙(樣品墊、吸收墊)、帶粘合劑的空白塑料卡片等按生產(chǎn)工藝要求裁切成一定的規(guī)格和尺寸。
粘貼按生產(chǎn)工藝要求(見附圖1)將各組分粘貼在白色塑料板上。
裁切用切條機將組裝好的反應(yīng)板切成3(±0.2)mm寬的試劑條。
裝袋取一個鋁箔袋，裝入1條試紙條和一枚1克重的干燥劑，機器封口。
2.試紙條的檢定2.1半成品檢定2.1.1外觀檢查白色包被反應(yīng)膜平整、干凈無污點、無裂縫，膠帶無開膠，試紙條寬度在3(±0.2)mm，無切斜現(xiàn)象。
2.1.2物理檢查包被反應(yīng)膜的液體移行速度應(yīng)大于25mm/分鐘。
2.1.3 TP抗體的鑒定2.1.3.1陽性樣品符合率用TP抗體診斷試劑用國家參考品中的10份陽性參比血清檢定，不得出現(xiàn)假陰性。
2.1.3.2陰性樣品符合率用TP抗體診斷試劑用國家參考品中的20份陰性參比血清檢定，不得出現(xiàn)假陽性。
2.1.4乙肝表面抗原的鑒定2.1.4.1陽性樣品符合率用乙肝表面抗原檢測試劑用國家參比品中的3份強陽性參比血清檢測，結(jié)果不得出現(xiàn)假陰性。
2.1.4.2陰性樣品符合率用乙肝表面抗原檢測試劑用國家參比品中的20份陰性參比血清檢測，結(jié)果不得出現(xiàn)假陽性。
2.1.4.3靈敏度檢測用HBsAg國家參比品中的靈敏度血清檢測，最低檢出限量應(yīng)小于等于1ng/ml
2.1.5穩(wěn)定性試驗37℃放置20天后檢測以上各項內(nèi)容，應(yīng)符合上述各項標準。
2.2成品檢定2.2.1外觀檢查外觀完整、無漏裝組份、效期和產(chǎn)品批號清楚準確。
2.2.2物理檢查同2.1.2。
2.2.3 TP抗體鑒定同2.1.3。
2.2.4乙肝表面抗原鑒定同2.1.4。
2.2.5穩(wěn)定性檢測同2.1.5。
3.成品的貯存和效期成品貯存在4~25℃干燥條件下(不得凍存)，效期為18個月。
權(quán)利要求
申請保護范圍梅毒抗體與乙肝表面抗原聯(lián)合檢測試劑，其特征在于兩種疾病聯(lián)合檢測，一滴血可以讀到兩個檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥品生物制品類，體外診斷試劑的范疇。用一滴血就可以檢測出患者是否感染梅毒或乙肝病毒，是一種新的檢測方法組合。本發(fā)明是將目前發(fā)病率較高的梅毒抗體和乙肝表面抗原兩種疾病的檢測手段合并在同一條檢測試紙上，利用免疫層析技術(shù)，將已純化的梅毒重組抗原及抗－HBs單克隆抗體利用自動微量噴點設(shè)備，固定在已預(yù)處理合格的硝酸纖維素膜上，再將已用膠體金標記的梅毒重組抗原及抗－HBs單克隆抗體按一定比例混合，制備成金結(jié)合物墊，再輔以恰當(dāng)?shù)臉悠诽幚韷|，組合成為試紙條(組裝方式見附圖)。采用雙抗原夾心及雙抗體夾心法原理，快速檢測人全血或血清、血漿中的梅毒抗體或乙型肝炎表面抗原?？朔艘郧胺珠_檢測方法的很多弊端，一滴血就可以檢測兩種疾病，3分鐘后可以判斷結(jié)果，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結(jié)果。準確、快速、操作簡單，可單人份使用。適用于家庭自助檢測及血液中心街頭獻血員篩查等需要快速檢測的用途。填補了國內(nèi)空白。
文檔編號G01N33/549GK1627073SQ200310112559
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者熊曉云, 耿永堯, 張文, 陳立炎 申請人:深圳益生堂生物企業(yè)有限公司