專利名稱：用于保護(hù)生物學(xué)活性分子和綴合標(biāo)記物的非糖類有機(jī)化合物及其方法
用于保護(hù)生物學(xué)活性分子和綴合標(biāo)記物的 非糖類有機(jī)化合物及其方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求了 2005年6月27日登記的美國臨時(shí)專利申請(qǐng) 60/694,604的優(yōu)先權(quán)，因此全文引入該申請(qǐng)作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本申請(qǐng)涉及試驗(yàn)。發(fā)明背景多種與蛋白關(guān)聯(lián)使用的緩沖劑和穩(wěn)定劑都是可以商購獲得的。這些 溶劑和緩沖劑可以用在多種方法和測(cè)試中，其中包括免疫測(cè)試。在千燥 的免疫層析測(cè)試試驗(yàn)條件下，許多可以使用的緩沖劑和穩(wěn)定劑在保護(hù)和 保持生物學(xué)活性分子和綴合標(biāo)記物的活性方面都會(huì)失效。 一些免疫層析 測(cè)試試驗(yàn)材料的保存期限非常短，并且由于在干燥條件下的存儲(chǔ)期間分 子活性的退化，其經(jīng)常在短時(shí)期內(nèi)就會(huì)喪失效力或者變得完全失效。雖 然已經(jīng)出現(xiàn)了生產(chǎn)更有效且更持久的免疫層析測(cè)試試驗(yàn)材料的趨勢(shì)，但 是仍然期望能進(jìn)一步改善活性分子和綴合標(biāo)記物活性的效力和持續(xù)性。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了使用非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)保護(hù)和保持生物學(xué)活性分 子和綴合標(biāo)記物活性方法。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)與 一種或多種非糖類有機(jī)相 容溶質(zhì)一起沉積時(shí)，沉積在免疫層析測(cè)試(ICT)試驗(yàn)干燥載體上的生 物學(xué)活性分子的活性可以保持、保護(hù)和持續(xù)保持更長的時(shí)間。非糖類有 ;fe/L相容溶質(zhì)可以用在與免疫測(cè)試?yán)鏘CT測(cè)試相關(guān)的地方，還可以用在 需要例如在溶液相、在干燥狀態(tài)或者在重組狀態(tài)中保護(hù)和保持生物學(xué)活 性分子和綴合標(biāo)記物活性的任何應(yīng)用中。非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)可以與任 何測(cè)試方法相結(jié)合，在所述測(cè)試方法中使用干燥的測(cè)試帶作為沉積可遷 移和/或固定化的生物學(xué)活性分子和/或綴合標(biāo)記物的載體。


圖1表明2%w/v的ecotine、 L-組氨酸、牛石黃酸和L-蘇氨酸組合物 對(duì)用于疾疾ICT裝置的不含蔗糖的結(jié)合襯墊干燥緩沖劑具有穩(wěn)定作用。 雖然在干燥襯墊緩沖劑配方中不含蔗糖，但對(duì)于在4CTC和55。C兩種溫 度下儲(chǔ)存的結(jié)合襯墊觀測(cè)到相同的靈敏性。圖2圖解了 4%w/v的單獨(dú)的L-組氨酸沒有使用于癡疾ICT裝置的 不含蔗糖的結(jié)合襯墊干燥緩沖劑具有穩(wěn)定性。發(fā)明詳述1、介紹當(dāng)與 一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)一起沉積時(shí)，特別是當(dāng)沉積到 免疫層析測(cè)試試驗(yàn)的干燥載體上時(shí)，生物學(xué)活性分子的活性通?？梢员?持、保護(hù)和持續(xù)保持更長的時(shí)間。在一方面，提供了一種方法，其包括a) 將一種或多種生物學(xué)活性分子沉積到 一個(gè)表面上；b) 將一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)沉積到該表面上；和c ) 干燥所述表面上沉積的 一 種或多種生物學(xué)活性分子和沉積的 一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)；其中所述一種或多種非糖類有機(jī)相容 溶質(zhì)在干燥和重組狀態(tài)下保護(hù)和保持了所述一種或多種生物學(xué)活性分 子的活性。在另一方面，提供了一種方法，其包括a) 提供一個(gè)樣品；b) 提供至少一部分包含一種或多種生物學(xué)活性分子和一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)的測(cè)試帶，其中所述一種或多種非糖類有機(jī)相容 溶質(zhì)在干燥和重組狀態(tài)下保護(hù)和保持了所述一種或多種生物學(xué)活性分子的活性；c) 將樣品與測(cè)試帶接觸；和d) 檢觀'J樣品中所關(guān)心分析物的存在或者測(cè)定其量。 在另一方面，提供了一種方法，其包括a) 提供一種或多種生物學(xué)活性分子；和b) 提供一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)；其中所述一種或多種非 糖類有機(jī)相容溶質(zhì)保持了所述一種或多種生物學(xué)活性分子的活性。本發(fā)明進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)將隨著說明的進(jìn)行而得以顯現(xiàn)。為了獲 得對(duì)本發(fā)明范圍的完整的理解，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)到，可以將本發(fā)明的 多個(gè)方面結(jié)合以產(chǎn)生合意的發(fā)明實(shí)施方式。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的含義都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。當(dāng)術(shù)語以單數(shù)提供時(shí)，發(fā)明人同時(shí)也考慮到了該術(shù)語的復(fù)數(shù)。本文所使用的命名法和如下所述 的操作步驟是本領(lǐng)域公知且常用的。術(shù)語"氨基酸"意圖包括所有分子，無論是天然的還是合成的，所 述分子同時(shí)包括氨基官能團(tuán)和酸官能團(tuán)二者并且能夠被包括到天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性的氨基酸包括天然存在的氨基酸；其類 似物、衍生物和同系物；具有派生側(cè)鏈的氨基酸類似物；以及所有上述 物質(zhì)中的任意一種的全部立體異構(gòu)體。在本文中依照IUPAC-IUB的建議 對(duì)天然氨基酸的名稱進(jìn)行了縮寫。術(shù)語"抗體"是指免疫球蛋白，其保持有特異性結(jié)合能力的衍生物， 以及具有與免疫球蛋白結(jié)合功能區(qū) 一致或大體一致的結(jié)合功能區(qū)的蛋 白。這些蛋白可以由天然來源獲得，或者可以部分或完全地通過合成來 制備?？贵w可以是單克隆或多克隆的。抗體可以是任意免疫球蛋白類別 中的成員，包括任意的人類類別IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。在示例 性的實(shí)施方式中，與本文所描述的方法和組合物一起使用的抗體是IgG 類的衍生物。術(shù)語"抗體片段"是指抗體的任何小于全長的衍生物。在示例性的要部分?？贵w片段的例子包括，但不限于，F(xiàn)ab、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、 Fv、 dsFv雙功能抗體和Fd片段。抗體片段可以通過任何方式產(chǎn)生。例 如，抗體片段可以通過完整抗體的裂解作用由酶或化學(xué)方法產(chǎn)生，其還 可以由基因編碼部分抗體序列而重組產(chǎn)生，或者其可以完全或部分地通 過合成產(chǎn)生。抗體片段可以任選地為單鏈抗體片段?；蛘撸銎慰?以包含連接在一起的多個(gè)鏈，例如通過二硫化物連接基連接的。所述片 段也可以任選地為多分子復(fù)合物。功能性抗體片段一般包含至少約50 個(gè)氨基酸，更一般地包含至少約200個(gè)氨基酸。術(shù)語"生物學(xué)活性分子"是指為活性有機(jī)體的一部分的任何活性有 機(jī)分子，其可以是天然的、合成的或者是它們的組合。術(shù)語"包含"和"含有"是以包括、開放的含義使用的，其意思是 指可能包括其它元素。本文所使用的術(shù)語"包括"意思是指"包括但不限于"。"包括"和 "包括但不限于"可以互換使用。術(shù)語"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"是指將可檢測(cè)的標(biāo)示物任選共價(jià)或非共 價(jià)地結(jié)合或附著到分子中，所述分子例如是多肽，如抗體。標(biāo)記多肽的 各種方法是本領(lǐng)域所公知的，并且是可以使用的。用于多肽的標(biāo)記的例子包括，但不限于，以下物質(zhì)放射性同位素、熒光標(biāo)記、重原子、酶 標(biāo)記或指示基因、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、生物素基團(tuán)、通過二級(jí)指針辨認(rèn)的預(yù) 先確定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對(duì)序列、二級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、 金屬結(jié)合功能區(qū)、抗原表位標(biāo)簽)。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記物附著有 各種長度的隔離臂以減少潛在的位阻。術(shù)語"非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)"是指非糖并且能溶解于有機(jī)溶液中的 任何分子。術(shù)語"測(cè)試帶"是指可以在其之上進(jìn)行試驗(yàn)的色語樣介質(zhì)。術(shù)語"樣品"是指可能含有分析物的任何液體樣品。 2、在干燥和重組狀態(tài)下保持生物學(xué)活性分子活性的方法本發(fā)明提供了非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)在保護(hù)和保持生物學(xué)活性分子 和綴合標(biāo)記物的活性方面的用途。下述方法適用于具有多孔載體的免疫 層析測(cè)試帶，例如硝化纖維測(cè)試帶，所述測(cè)試帶是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明提供了一種在干燥和重組狀態(tài)下保持生物學(xué)活性分子活性 的方法，其包括將一種或多種生物學(xué)活性分子沉積在一個(gè)表面上?？梢?使用任何合適的方法來將所述的一種或多種生物學(xué)活性分子沉積在所 述表面上。所述的一種或多種生物學(xué)活性分子可以是任何合適的生物學(xué) 活性分子，例如，能夠特異性結(jié)合一種或多種所關(guān)心的分析物的生物學(xué) 活性分子。本發(fā)明的合適的分子包括，例如，多克隆或單克隆的抗體或 抗體片段。所述表面可以是適于進(jìn)行免疫測(cè)試的任何類型的表面，例如， 硝化纖維測(cè)試帶。在某些實(shí)施方式中，所述表面或測(cè)試帶是碎黃向流動(dòng)(lateral flow) 裝置的一部分。在橫向流動(dòng)裝置中，將含有所關(guān)心的目標(biāo)分析物的樣品 加入到橫向流動(dòng)裝置的施加孔中。測(cè)試樣品沿著測(cè)試帶或所述表面向含 有可遷移結(jié)合試劑的區(qū)域流動(dòng)，所述的可遷移結(jié)合試劑設(shè)置在干燥狀態(tài)的區(qū)域中，例如，設(shè)置在襯墊中。當(dāng)樣品前沿到達(dá)該區(qū)域時(shí)，可遷移的 標(biāo)記的結(jié)合試劑從襯墊中釋放出來，然后與可能存在于測(cè)試樣品中的目 標(biāo)分析物進(jìn)行相互作用。樣品中的目標(biāo)分析物與可遷移的結(jié)合試劑結(jié)合 并且繼續(xù)向檢測(cè)區(qū)流動(dòng)。檢測(cè)區(qū)包含固定化的未標(biāo)記的特異性結(jié)合試 劑，例如，在襯墊上，以用于結(jié)合分析物/可遷移結(jié)合試劑復(fù)合物。樣品 中分析物的存在是通過觀測(cè)標(biāo)記的結(jié)合試劑/分析物復(fù)合物在檢測(cè)區(qū)域 中結(jié)合的程度(如果有的話)而確定的。結(jié)果可以通過觀測(cè)色度的方式 進(jìn)行視覺評(píng)定，顏色的強(qiáng)度與測(cè)試樣品中目標(biāo)分析物的濃度成正比。在 一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記的試劑、分析物(如果存在)和固定化的未標(biāo)記 的特異性結(jié)合試劑在"夾層"反應(yīng)中共同作用。其結(jié)果是，如果樣品中 存在分析物，則標(biāo)記的試劑就被結(jié)合在檢測(cè)區(qū)域中。兩種結(jié)合試劑必須 對(duì)分析物上不同的表位具有特異性。該類橫向流動(dòng)裝置的例子公開于Davis等人的U.S. 6,352,862中，在 此將其全文引入作為參考。所述方法還可以包括將一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)沉積在一 個(gè)表面上。所述一種或多種生物學(xué)活性分子和一種或多種非糖類有機(jī)相 容溶質(zhì)在載體表面或表面上的沉積，可以以任何合適的方式進(jìn)行，所述 方式例如同時(shí)或分別沉淀。本發(fā)明的一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)可 以是適于本發(fā)明目的的任何非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)，所述目的就是在不存 在一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)時(shí)有效地使一種或多種生物學(xué)活性 分子的活性保持、保護(hù)較長的時(shí)間。本發(fā)明的一種或多種非糖類有機(jī)相 容溶質(zhì)包括，例如，氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、谷氨 酸鈉、賴氨酸、氨基丁酸(aminobutricacid)、?；撬?，胺例如甜菜堿、 肌氨酸、N-氧化三甲胺，或滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(osmolytes)或者其它合適的 溶質(zhì)侈寸^口2-茶盼、ectoine、 hydroxyectoine、甘、油、脫氧斗亥4唐才盡酉臾、單石舞 酸腺苷、PCR引物、精胺、亞精胺、Brij58、聚乙烯亞胺、聚組氨酸、 polythymadilic acid、乙酰-L-肉堿、L-carline、氨乙基亞磺酸和阿魏酸。所述方法還可以包括對(duì)表面上沉積的一種或多種生物學(xué)活性分子 和沉積的一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)進(jìn)行干燥。本領(lǐng)域已知的任何 合適的干燥方法都可以用來干燥所述沉積的 一種或多種生物學(xué)活性分 子和一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)。所述方法的一個(gè)重要的方面是一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)在干燥和重組狀態(tài)下保護(hù)和保持一種或多種生物學(xué)活性分子的活性的能力。3 、檢測(cè)樣品中所關(guān)心分析物的存在或測(cè)定其量的方法本發(fā)明進(jìn)一步提供了非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)在保護(hù)和保持生物學(xué)活 性分子和綴合標(biāo)記物的活性方面的用途及其方法。本文所提供的方法適 用于具有多孔載體的免疫層析測(cè)試帶例如硝化纖維測(cè)試帶，例如橫向流 動(dòng)裝置，如先前部分所詳細(xì)描述的，所述測(cè)試帶數(shù)目眾多、工藝不同并 且是本領(lǐng)域公知的。例如，通常，用于測(cè)定樣品中所關(guān)心的分析物的存在或數(shù)量的免疫 測(cè)試裝置包括， 一個(gè)樣品施加元件，其與結(jié)合襯墊液體相通，所述結(jié)合 襯墊與具有測(cè)試結(jié)果區(qū)和對(duì)照區(qū)的硝化纖維測(cè)試帶液體相通。免疫測(cè)試 裝置還可以在與樣品施加襯墊反方向的末端包括一個(gè)末梢接收器，用于 在測(cè)試完成之后吸收任何過量的液體。所述樣品施加襯墊是一個(gè)多孔的襯墊，其能夠吸收待測(cè)樣品并將吸 收的樣品通過毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)移到結(jié)合襯墊處。結(jié)合襯墊包括一種或多種 千燥的標(biāo)記的分子或試劑例如抗體，其能夠與 一 種或多種所關(guān)心的分析 物進(jìn)行特異性地結(jié)合從而形成分析物標(biāo)記的試劑復(fù)合物。結(jié)合襯墊還可 以包括一種或多種穩(wěn)定化化合物，其能夠?qū)τ蓾穸群蜏囟人鸬臈l件 變化感發(fā)熱穩(wěn)定性以及穩(wěn)定性。結(jié)合襯墊是一種多孔襯墊，其能夠吸收 從樣品施加襯墊處轉(zhuǎn)移來的樣品并且通過毛細(xì)管作用將所述樣品轉(zhuǎn)移 到硝化纖維帶上。硝化纖維帶能夠吸收來自結(jié)合襯墊的樣品并且通過毛 細(xì)管作用將所述樣品向下游轉(zhuǎn)移到領(lǐng)'J試結(jié)果區(qū)和對(duì)照區(qū)。免疫測(cè)試裝置 的測(cè)試結(jié)果區(qū)包括一種或多種固定化分子或試劑，例如抗體，其能夠與 一種或多種所關(guān)心的分析物或分析物標(biāo)記的試劑復(fù)合物的任意部分進(jìn) 行特異性地結(jié)合。免疫測(cè)試裝置的對(duì)照區(qū)包括一種或多種固定化分子或 試劑，例如抗體，其能夠與一種或多種標(biāo)記的試劑進(jìn)行特異性地結(jié)合。當(dāng)將液體試樣施加到裝置的樣品施加襯墊上時(shí)，所述樣品通過毛細(xì) 管作用穿過樣品施加襯墊、結(jié)合襯墊和硝化纖維襯墊。當(dāng)樣品穿過結(jié)合 襯墊時(shí)，所述樣品溶解了干燥的標(biāo)記分子或試劑，并且如果樣品中存在 所關(guān)心的分析物，則所溶解的標(biāo)記分子或試劑就會(huì)與所關(guān)心的分析物結(jié) 合從而形成分析物標(biāo)記的試劑復(fù)合物，相反，如果樣品中不存在所關(guān)心 的分析物，則沒有復(fù)合物形成。然后，將正試驗(yàn)情況中的分析物標(biāo)記的試劑復(fù)合物，或負(fù)試驗(yàn)情況中的單獨(dú)的標(biāo)記試劑，遷移到并且穿過硝化 纖維帶，接著經(jīng)過裝置的測(cè)試結(jié)果區(qū)和對(duì)照區(qū)。如果樣品中存在所關(guān)心 的分析物，則分析物標(biāo)記的試劑復(fù)合物與測(cè)試結(jié)果區(qū)的固定化試劑相結(jié) 合從而形成可;^測(cè)的線，而如果樣品中不存在所關(guān)心的分析物，則沒有 分析物標(biāo)記的試劑復(fù)合物形成，因此在測(cè)試結(jié)果區(qū)就不發(fā)生結(jié)合。無論 樣品中是否存在用于形成復(fù)合物的所關(guān)心的分析物，標(biāo)記的試劑都會(huì)與 對(duì)照區(qū)的固定化試劑相結(jié)合從而形成可檢測(cè)的線，表示測(cè)試已經(jīng)完成。 任何過量的液體樣品在測(cè)試完成后均可以被所述裝置的末梢接收器吸 收。本發(fā)明提供了檢測(cè)樣品中所關(guān)心分析物的存在或測(cè)定其量的方法， 其包括提供懷疑含有所關(guān)心分析物的樣品的步驟。所述樣品可以是任何 樣品，例如生物學(xué)液體或環(huán)境樣品。所迷方法還可以包括提供一種免疫 層析測(cè)試帶，所述測(cè)試帶包含有一種或多種生物學(xué)活性分子和一種或多 種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)。免疫層析測(cè)試帶優(yōu)選與如上所述的免疫測(cè)試式裝置相連，所述裝置 是用于檢測(cè)樣品中所關(guān)心分析物的存在或測(cè)定分析物的數(shù)量的。本發(fā)明 的方法還可以包括將懷疑含有所關(guān)心的分析物的樣品與免疫層析測(cè)試 帶接觸的步驟。所迷方法還可以包括檢測(cè)所關(guān)心的分析物的存在或測(cè)定其量的步 驟。對(duì)所關(guān)心分析物的存在的檢測(cè)或?qū)ζ鋽?shù)量的測(cè)定可以通過能夠達(dá)到 該目的的任何合適的方法進(jìn)行，例如，使用標(biāo)記的抗體或抗體片段，其 中標(biāo)記物包括一種或多種，例如，乳膠、染料、金溶膠、放射性或焚光 標(biāo)記物。本發(fā)明的一個(gè)重要的方面包括一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)在 干燥和重組狀態(tài)下保護(hù)和保持一種或多種生物學(xué)活性分子的活性的能 力，所述干燥和重組狀態(tài)特別是例如任何上述裝置中的結(jié)合襯墊或含有 可遷移且干燥的結(jié)合試劑以及檢測(cè)區(qū)中的結(jié)合試劑的其它區(qū)域。本發(fā)明 的一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)可以選自，例如，氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、賴氨酸、氨基丁酸(aminobutric acid)、牛磺酸，胺例如甜菜堿、肌氨酸、N-氧化三甲胺，或滲透調(diào)節(jié)物 質(zhì)(osmolytes )或者其它合適的〉容質(zhì)例如2-萘S^、 ectoine、 hydroxyectoine、 甘油、脫氧核糖核酸、單磷酸腺苷、PCR引物、精胺、亞精胺、Brij58、聚乙烯亞胺、聚組氨酸、polythymadilic acid、乙酰-L-肉石咸、L-瓜氨酸 (L-catruline )、氨乙基亞磺酸和阿魏酸。實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了 一般性的描述，通過參照以下實(shí)施例可以更加 容易地理解本發(fā)明，包括這些實(shí)施例的目的僅僅是為了例證說明本發(fā)明 實(shí)施方式的某些方面，其并不打算以任何方式限定本發(fā)明。除非另有說 明，否則所有的標(biāo)題都是為了方便讀者，而不是用于限定標(biāo)題后正文的含義。實(shí)施例1: RSC的捕獲根據(jù)本實(shí)施例，建造并使用檢測(cè)RSV抗原的ICT裝置。含有1.0 mg/ml單克隆抗-RSV ( Binax Inc., Portland ME)和8% (w/v)?；撬?(Sigma, St Louis MO )(保護(hù)的)，或者只含有1.0 mg/ml單克隆抗-RSV (Binax Inc., Portland ME )(未保護(hù)的)的捕獲抗體溶液在制得之后就立 即進(jìn)行劃線涂布。將所述捕獲溶液劃線涂布到層壓在聚酯薄膜上的硝化 纖維(HFIIOUBBS,Millipore, Bedford, MA)材料上，并在48。C下干燥 兩分鐘。然后按照裝置的一般設(shè)計(jì)用金標(biāo)記的抗-RSV構(gòu)建所述裝置。 在隨后的幾天內(nèi)(時(shí)間零點(diǎn))對(duì)一部分完成的裝置進(jìn)行分析，將其余的 裝置密封在箔袋中并在55。C下存儲(chǔ)。將對(duì)RSV抗體呈陽性(靈敏、低靈敏和中等靈敏)和陰性的樣品 施加到裝置的萃取襯墊上，15分鐘后對(duì)它們進(jìn)行分析以檢測(cè)RSV抗原。 對(duì)于未穩(wěn)定化和穩(wěn)定化劃線涂布捕獲溶液二者的陽性對(duì)照來說，初始測(cè) 試均產(chǎn)生了相似的響應(yīng)。在所有情況下，陰性對(duì)照均未產(chǎn)生陽性信號(hào)。 在55。C下經(jīng)過一周以后，未保護(hù)的裝置未能檢測(cè)到靈敏對(duì)照。三周以后 對(duì)于未保護(hù)的裝置來說，低靈敏對(duì)照僅產(chǎn)生了微弱的信號(hào)，而保護(hù)的裝 置產(chǎn)生了幾乎與該保護(hù)裝置在第一周運(yùn)行時(shí)相當(dāng)?shù)捻憫?yīng)。最后，兩個(gè)月 后，未保護(hù)的裝置對(duì)三種陽性對(duì)照幾乎都沒有反應(yīng)。保護(hù)的裝置仍能夠 檢測(cè)到低和中等靈敏對(duì)照中的RSV抗原。實(shí)施例2:肺炎鏈球菌的捕獲根據(jù)本實(shí)施例，建造并使用^企測(cè)肺炎鏈球菌(S. )抗原的ICT裝置。含有1.25 mg/ml親合純化兔抗肺炎鏈球菌抗體(Binax Inc.， Portland ME )和5 % ( w/v ) hydroxyectoine ( Fluka Production, GmbH )(保護(hù)的)，或者僅含有1.25 mg/ml親合純化兔抗肺炎鏈球菌抗體(Binax Inc., Portland ME)(未保護(hù)的)的捕獲抗體溶液在制得之后就立即進(jìn)行 劃線涂布。將捕獲溶液劃線涂布到層壓在聚酯薄膜上的硝化纖維(SR, Millipore, Bedford, MA)材料上，并在50°C下干燥兩分鐘。然后按照裝 置的一般設(shè)計(jì)用金標(biāo)記的兔抗肺炎鏈球菌抗體構(gòu)建所述裝置。在隨后的 幾天內(nèi)(時(shí)間零點(diǎn))對(duì)一部分完成的裝置進(jìn)行分析，將其余的裝置密封 在箔袋中并在55'C下存儲(chǔ)。將對(duì)肺炎鏈球菌抗體呈陽性(靈敏，低靈敏和中等靈敏)和陰性的 樣品施加到裝置的患者藥簽(swab)上，接著加入追加溶液，15分鐘后 對(duì)它們進(jìn)行分析以檢測(cè)肺炎鏈球菌抗原。在所有情況下，陰性對(duì)照均未 產(chǎn)生陽性信號(hào)。在55。C下經(jīng)過一周之后，未保護(hù)的裝置產(chǎn)生的信號(hào)是用 hydroxyectoine穩(wěn)定化的裝置的一半。 一個(gè)月后，未保護(hù)的裝置未能檢 測(cè)到低靈敏的對(duì)照，而保護(hù)的裝置仍能夠檢測(cè)到靈敏的對(duì)照。兩個(gè)月之 后的結(jié)果與一個(gè)月時(shí)的結(jié)果類似。實(shí)施例3'.絲蟲的捕獲根據(jù)本實(shí)施例，建造并使用檢測(cè)RSV抗原的ICT裝置。含有1.5 mg/d 單克隆抗-A IgM ( Binax Inc., Portland ME )和5 % ( w/v ) 4青胺(Fluka Production, GmbH )(保護(hù)的)，或者僅含有1.5 mg/ml單克隆抗 -Z). IgM ( Binax Inc., Portland ME )(未保護(hù)的)得捕獲抗體溶液在制得之后就立即進(jìn)行劃線涂布。將捕獲溶液劃線涂布到層壓在聚酯薄 膜上的硝化纖維(HFI IOUBBS, Millipore, Bedford, MA)材料上，并在5crc下干燥兩分鐘。然后按照裝置的一般設(shè)計(jì)用金標(biāo)記的抗-D. ,w脂力:v 構(gòu)建所述裝置。在緊接下來的時(shí)間內(nèi)(時(shí)間零點(diǎn))對(duì)一部分完成的裝置進(jìn)行分析，將其余的裝置密封在箔袋中并且存儲(chǔ)在55。C下。將對(duì)D. ,mm"w抗體呈陽性(低和中等靈敏)和陰性的全血樣品施 加到裝置的萃取襯墊上，15分鐘后對(duì)它們進(jìn)行分析以檢測(cè)Z). 抗 原。對(duì)于未穩(wěn)定化和穩(wěn)定化劃線涂布捕獲溶液二者的陽性對(duì)照來說，初 始測(cè)試均產(chǎn)生了相似的響應(yīng)。在所有情況下，陰性對(duì)照均未產(chǎn)生陽性信 號(hào)。在55。C下經(jīng)過一周以后，未保護(hù)的裝置未能檢測(cè)到低靈敏的對(duì)照，而穩(wěn)定化的裝置產(chǎn)生了與初始測(cè)試相當(dāng)?shù)男盘?hào)。 一個(gè)月以后，未保護(hù)的 裝置未能檢測(cè)到低或中等靈敏的陽性對(duì)照，而保護(hù)的裝置能夠檢測(cè)到低 和中等靈敏的陽性對(duì)照。兩個(gè)月以后，未保護(hù)的裝置仍對(duì)陽性對(duì)照沒有 反應(yīng)。保護(hù)的裝置能夠檢測(cè)到中等靈敏對(duì)照中的D.朋脂^抗原。實(shí)施例4: RSV的捕獲根據(jù)本實(shí)施例，建造并使用用于檢測(cè)RSV抗原的ICT裝置。將含 有1.0mg/ml單克隆抗-RSV(BinaxInc., Portland ME )和1.25% (w/v) 單磷酸腺苷(Sigma, St Louis , MO )(保護(hù)的)的捕獲抗體溶液在制備之 后就立即進(jìn)行劃線涂布。將捕獲溶液劃線涂布到層壓在聚酯薄膜上的硝 化纖維(HFIIOUBBS,Millipore， Bedford, MA)材料上，并在48。C下干 燥兩分鐘。然后按照裝置的 一般設(shè)計(jì)用金標(biāo)記的抗-RSV構(gòu)建所述裝置。 在隨后的幾天內(nèi)(時(shí)間零點(diǎn))對(duì)一部分已經(jīng)完成的裝置進(jìn)行分析，將其 余的裝置密封在箔袋中并且存儲(chǔ)在55。C下。將對(duì)RSV抗體呈陽性(靈敏，低靈敏和中等靈敏)和陰性的樣品 施加到裝置的萃取襯墊上，15分鐘后對(duì)它們進(jìn)行分析以檢測(cè)RSV抗原。 用具有穩(wěn)定化RSV抗體的裝置進(jìn)行的初始測(cè)試在靈敏、低靈敏和中等 靈敏三個(gè)陽性對(duì)照的每一個(gè)中均檢測(cè)到了 RSV抗原。在所有情況下， 陰性對(duì)照均未產(chǎn)生陽性信號(hào)。在55。C下經(jīng)過一周以后，每種對(duì)照類型所 產(chǎn)生的信號(hào)都與初始測(cè)試的相同。在55。C下經(jīng)過兩個(gè)月之后，所述裝置 仍能夠在靈敏、低靈敏和中等靈敏的對(duì)照中檢測(cè)到RSV抗原。實(shí)施例5:癡疾的免疫層析測(cè)試使用非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)來穩(wěn)定硝化纖維和金上的抗體。0.1 %的聚 組氨酸濃度能夠使醛縮酶重組體得到穩(wěn)定化。在30。C下存儲(chǔ)的樣品顯示 具有至少29天的穩(wěn)定性，但其以前僅能穩(wěn)定2天。實(shí)施例6: 2% W/V的ectoineL-組氨酸、牛石黃酸和L-蘇氨酸的混合物使 含/不含蔗糖的結(jié)合襯墊干燥緩沖劑具有穩(wěn)定性按照SOP配方制備5X的結(jié)合干燥緩沖劑，除了不含SOP中的25 %w/v的蔗糖。通過加入5X的干燥緩沖劑將對(duì)照、抗惡性瘧原蟲(P /a/c,/^raw)和抗間日疾原蟲(尸.vzvox)金顆粒的混合物調(diào)節(jié)到IX,并且使每種ectoineL-組氨酸、?；撬岷蚅-蘇氨酸達(dá)到2%w/v。對(duì)SOP結(jié) 合襯墊基質(zhì)進(jìn)行劃線涂布、干燥并在干燥瓶中在4 °C和55 °C兩種溫度下 存儲(chǔ)19個(gè)月和11天。將瓶子移至室溫下，達(dá)到平衡，并將各個(gè)溫度下 的襯墊插入到癡疾尿的浸量尺形式的裝置中。在每個(gè)裝置上均對(duì)相同的 重組間日疾原蟲抗原和組織培養(yǎng)懸浮惡性瘧原蟲抗原的混合物進(jìn)行試 驗(yàn)。無論千燥襯墊緩沖劑配制物中是否存在蔗糖，在4。C和55。C兩種溫 度下存儲(chǔ)的結(jié)合襯墊上觀測(cè)到相等的靈敏度。實(shí)施例7: 4 % W/V的單獨(dú)的L-組氨酸沒有使含/不含蔗糖的結(jié)合襯墊干 燥緩沖劑具有穩(wěn)定性按照SOP配方制備5X的結(jié)合干燥緩沖劑，除了不含SOP中的25 。/。w/v的蔗糖。通過加入5X的干燥緩沖劑將對(duì)照、抗惡性瘧原蟲和抗 間日癡原蟲金顆粒的混合物調(diào)節(jié)到IX,并且達(dá)到4%w/v。將SOP結(jié)合 襯墊基質(zhì)劃線涂布、干燥并在干燥瓶中在4。C和55。C兩種溫度下存儲(chǔ)19 個(gè)月和11天。將瓶子移至室溫下，達(dá)到平衡，并將各個(gè)溫度下的襯墊 插入到疾疾尿的浸量尺形式的裝置中。每個(gè)裝置上對(duì)相同的重組間日瘧 原蟲抗原和組織培養(yǎng)懸浮惡性癡原蟲抗原的混合物進(jìn)行試驗(yàn)。觀測(cè)到存 儲(chǔ)在4 。C下的結(jié)合襯墊比存儲(chǔ)在55 。C下的結(jié)合襯墊的靈敏度高許多。另 外，大量的結(jié)合物在試驗(yàn)后仍保留在55。C材料的結(jié)合襯墊基質(zhì)中。等同形式本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，或者僅使用常規(guī)試驗(yàn)就能夠確定，本 文所描述的本發(fā)明實(shí)施方式的多種等價(jià)形式。這樣的等價(jià)形式也試圖包 括在下述權(quán)利要求內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種方法，其包括a) 將一種或多種生物學(xué)活性分子沉積到一個(gè)表面上；b) 將一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)沉積到所述表面上；和c) 干燥所述表面上沉積的一種或多種生物學(xué)活性分子和沉積的一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)，其中所述一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)在干燥和重組狀態(tài)下保持了所述一種或多種生物學(xué)活性分子的活性。
2、 權(quán)利要求1的方法，其中同時(shí)將所述一種或多種生物學(xué)活性分 子和所述一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)沉積到所述表面上。
3、 權(quán)利要求2的方法，其中每一種所述一種或多種生物學(xué)活性分 子中均選自抗體、標(biāo)記的抗體、抗體片段和標(biāo)記的抗體片段，并且所 述一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)包含單氨基酸。
4、 權(quán)利要求2的方法，其中每一種所述一種或多種生物學(xué)活性分 子均選自抗體、標(biāo)記的抗體、抗體片段和標(biāo)記的抗體片段，并且所述 一種或多種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)包含約1到約10個(gè)氨基酸的單氨基酸 鏈。
5、 權(quán)利要求3的方法，其中每一種所述一種或多種生物學(xué)活性分 子均選自固定化的抗體、固定化的抗體片段、可遷移的標(biāo)記抗體和可 遷移的標(biāo)記抗體片段，并且所述表面包含測(cè)試帶部分。
6、 權(quán)利要求5的方法，其中所述測(cè)試帶是免疫層析性的。
7、 權(quán)利要求5的方法，其中所述測(cè)試帶部分是結(jié)合襯墊。
8、 權(quán)利要求5的方法，其中所述測(cè)試帶部分是檢測(cè)區(qū)。
9、 權(quán)利要求5的方法，其中所述免疫層析帶包含有橫向流動(dòng)裝置。
10、 權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種生物學(xué)活性分子選自 抗體、標(biāo)記的抗體、抗體片段和標(biāo)記的抗體片段，并且所述一種或多種 非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)包含一種或多種胺。
11 、權(quán)利要求2的方法，其中所述一種或多種生物學(xué)活性分子選自 抗體、標(biāo)記的抗體、抗體片段和標(biāo)記的抗體片段，并且所述一種或多種 非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)包含滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)或其它相容的溶質(zhì)。
12、 一種方法，其包括a) 提供一個(gè)樣品；b) 提供至少一部分包含一種或多種生物學(xué)活性分子和一種或多 種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)的測(cè)試帶，其中所述一種或多種非糖類有機(jī)相容 溶質(zhì)在干燥和重組狀態(tài)下保護(hù)和保持了所述一種或多種生物學(xué)活性分子的活性；c) 將所述樣品與所述測(cè)試帶接觸；和d ) 檢觀'J樣品中分析物的存在或者測(cè)定其量，其中所述 一 種或多種 非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)在干燥和重組狀態(tài)下保護(hù)和保持了所述一種或多 種生物學(xué)活性分子的活性。
13、 權(quán)利要求12的方法，其中所述測(cè)試帶部分是結(jié)合襯墊。
14、 權(quán)利要求12的方法，其中所述測(cè)試帶部分是檢測(cè)區(qū)。
15、 權(quán)利要求12的方法，其中所述測(cè)試帶是免疫層析性的。
16、 權(quán)利要求12的方法，其中所述測(cè)試帶包含有橫向流動(dòng)裝置。
17、 權(quán)利要求12的方法，其中所述一種或多種非糖類有機(jī)相容溶 質(zhì)各自選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、賴氨酸、 氨基丁酸、牛磺酸、胺、甜菜堿、肌氨酸、N-氧化三甲胺、2-萘酚、ectoine、 hydroxyectome、甘油、脫氧核糖核酸、單磷酸腺苷、PCR引物、精胺、 亞精胺、BnJ5 8、聚乙烯亞胺、聚組氨酸、polythymadilic acid、乙酰-L-肉堿和L-瓜氨酸。
18、 一種測(cè)試帶，其限定了一個(gè)流路并且包含 一個(gè)干燥形式的多孔元件，其包含用于結(jié)合分析物的標(biāo)記的結(jié)合試劑，和 至少一種非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)， 一個(gè)與所述多孔元件分隔但液體接觸的多孔帶，所述多孔帶包含檢 測(cè)區(qū)，禾口沿著流路設(shè)置的結(jié)合試劑，其是用來結(jié)合分析物和/或分析物與標(biāo)記 的結(jié)合試劑的復(fù)合物其中所述結(jié)合試劑是在包含分析物的液體使標(biāo)記的結(jié)合試劑發(fā)生 移動(dòng)時(shí)用來在檢測(cè)區(qū)中捕獲分析物和/或分析物與標(biāo)記的結(jié)合試劑的復(fù) 合物，并且所述非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、 谷氨酸鈉、賴氨酸、氨基丁酸、?；撬帷?、甜菜堿、肌氨酸、N-氧化 三甲胺、2-萘酚、ectoine、 hydroxyectoine、甘油、脫氧核糖核酸、單磷酸腺苷、PCR引物、精胺、亞精胺、BnJ5 8、聚乙烯亞胺、聚組氨酸、 polythymadilica cid、 乙酰-L-肉石威和L-瓜氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了如下方法，其包括使用非糖類有機(jī)相容溶質(zhì)保護(hù)和保持生物學(xué)活性分子和綴合標(biāo)記物活性。所述方法特別適用于與免疫測(cè)試相關(guān)的方面，例如免疫層析測(cè)試試驗(yàn)，并且可以結(jié)合入任何測(cè)試方法中，其中在所述測(cè)試方法中使用干燥的測(cè)試帶作為沉積可遷移和/或固定化的生物學(xué)活性分子和/或綴合標(biāo)記物的載體。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101253407SQ200680031421
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月27日
發(fā)明者A·H·戴維斯, B·C·雷恩曼, E·R·皮亞西奧, R·N·皮亞西奧, W·J·帕林 申請(qǐng)人:比納克斯公司