專利名稱：：一種基因芯片的tsa-納米金標(biāo)記銀染檢測法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因芯片的檢測方法，具體的說，涉及一種大幅度提高基因芯片檢測靈敏度的TSA(TyramineSignalAmplification,酪氨信號放大)一金標(biāo)銀染可視化檢測方法。
背景技術(shù)：
：基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列，是90年代以來高科技領(lǐng)域最為重大的科技進(jìn)展之一，是微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)與生命科學(xué)交叉結(jié)合的高新技術(shù)?；蛐酒腔诤怂峄パa(bǔ)雜交的原理而研制的，是在固相基質(zhì)上按特定的排列方式固定大量呈網(wǎng)格狀密集排列的基因探針，待分析樣品通過與芯片中已知堿基順序的DNA片段互補(bǔ)雜交，從而確定樣品中的核酸序列和性質(zhì)，對基因表達(dá)的量和特性進(jìn)行分析，是高效地大規(guī)模獲取相關(guān)生物信息的重要手段?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、并行化、自動化的特征，在基因表達(dá)譜研究、單核苷酸多態(tài)性分析、疾病分子檢測和大規(guī)模藥物篩選等生物醫(yī)學(xué)的眾多研究領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景?；蛐酒南嚓P(guān)技術(shù)包括靶標(biāo)和探針樣品的處理和標(biāo)記技術(shù)、芯片的制備技術(shù)、雜交和檢測技術(shù)、以及雜交圖像的分析技術(shù)等。目前基因芯片的檢測普遍采用熒光檢測方法，即將熒光材料如熒光素(FITC)、青色素(Cy3、Cy5)直接或間接標(biāo)記在DNA或RNA分子上，熒光信號采用激光共聚焦掃描檢測。熒光檢測法的靈敏度高，與同位素標(biāo)記法相比，避免了使用對人體有害的放射性物質(zhì)；但是熒光檢測自身存在難以克服的缺陷，如熒光信號易飽和、易淬滅、穩(wěn)定性差等，而面臨的最大問題是檢測儀器價(jià)格昂貴，從而嚴(yán)重限制了生物芯片的推廣應(yīng)用，尤其是在中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用。金標(biāo)銀染技術(shù)是一種靈敏特異的可視化檢測方法，源自現(xiàn)代照相技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)和免疫金技術(shù)。金標(biāo)是將納米級的金顆粒物理吸附或共價(jià)連接在生物大分子上，這種標(biāo)記具有很高的標(biāo)記效率和穩(wěn)定性，但是顆粒太小給信號檢測帶來了困難；銀染技術(shù)也叫自顯影技術(shù)，通過還原銀在金標(biāo)記位點(diǎn)的特異性沉積，大幅提高信號檢測的靈敏度，使金標(biāo)銀染技術(shù)成為了一種肉眼可見或在光學(xué)顯微鏡下的低放大率可視化方法。20多年來，金標(biāo)銀染技術(shù)被廣泛用于原位雜交和免疫組化研究；近幾年，該技術(shù)在基因芯片研究中的應(yīng)用已有報(bào)道。金標(biāo)銀染技術(shù)使芯片實(shí)現(xiàn)可視化檢測，避免了熒光檢測使用昂貴的掃描儀器，大大降低了檢測成本?；蛐酒慕饦?biāo)銀染檢測方法己經(jīng)獲得專利授權(quán)(ZL專利號02113147.3)。作為一種可視化檢測方法，金標(biāo)銀染法的檢測靈敏度目前還不能滿足疾病分子檢測的更高要求，尤其是對于待測樣本中極少量或單個(gè)細(xì)菌的檢測。如何進(jìn)一步提高可視化檢測的靈敏度是生物芯片推廣應(yīng)用中面臨的重要課題。TSA方法也叫CARD(CatalyzedReporterDeposition,催化報(bào)道分子沉積)技術(shù)，是由Bobrow等人于1989年首次提出的。信號放大分子酪氨是一個(gè)酚基化合物，可以作為辣根過氧化物酶(HRP)的作用底物。TSA的原理是在HRP催化下，大量連接半抗原的酪氨分子的沉積。1992年，Adams將TSA首先引入免疫組化，用于抗原或抗體的檢測。與常規(guī)的生物素一鏈酶親和素方法相比，該技術(shù)在理論上可以將檢測靈敏度提高IOOO倍?，F(xiàn)在，TSA技術(shù)在免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附分析以及原位雜交等諸多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對目前生物芯片的金標(biāo)銀染檢測方法的靈敏度需要進(jìn)一步提高的的問題，提供一種大幅度提高金標(biāo)銀染法的檢測靈敏度的技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是將TSA技術(shù)與金標(biāo)銀染相結(jié)合，雜交好的芯片首先進(jìn)行TSA處理，通過HRP催化酪氨分子的大量沉積以及生物素與鏈酶親合素的特異結(jié)合，將大量的納米金顆粒連接到靶標(biāo)分子上，再通過銀染反應(yīng)得到清晰的可視化信號。本方法可以大幅度提高芯片可視化檢測的靈敏度。具體地說，基因芯片的TSA—納米金標(biāo)記銀染檢測法，其特點(diǎn)在于包括如下步驟1.待測基因的純化，擴(kuò)增與標(biāo)記基因純化方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社.作者，J.薩姆布魯克；基因擴(kuò)增方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或者反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR);核酸標(biāo)記方法是對PCR的下游引物采用末端標(biāo)記法引入生物素，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。2.芯片的制備與雜交設(shè)計(jì)待檢基因的探針，點(diǎn)制基因芯片；將上述待檢基因的PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交。為了提高雜交反應(yīng)的效率，雜交時(shí)使用雜交液與PCR產(chǎn)物混合。3.TSA過程雜交好的芯片首先點(diǎn)加鏈酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)，通過鏈酶親和素與靶標(biāo)連接的生物素特異結(jié)合，在靶標(biāo)上引入HRP:然后點(diǎn)加生物素標(biāo)記的酪氨(Biotin-Tyramine)，通過HRP的催化作用使大量的酪氨沉積在反應(yīng)位點(diǎn)周圍。Biotin-Tyramine試劑依據(jù)文獻(xiàn)制備將Tyramine.HCI與Biotin-NHS分別溶于DMF，然后以一定的比例混合室溫反應(yīng)，反應(yīng)液用乙醇稀釋成指定濃度，4。C保存。4.金標(biāo)銀染過程芯片點(diǎn)加鏈酶親和素標(biāo)記的納米金(Streptavidin-Gold),再次通過Streptavidin與Biotin的特異結(jié)合將納米金連接到靶標(biāo)分子上；然后點(diǎn)加銀染試劑，利用銀染試劑的氧化還原反應(yīng)形成的銀顆粒沉積在納米金上，形成肉眼可見的雜交信號。5.信號處理過程雜交信號可以用普通的光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描檢測，并可以采用圖像分析軟件獲取信號的灰度值，進(jìn)行定量分析。本方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1.本方法可以對細(xì)菌或病毒進(jìn)行高靈敏度的可視化檢測，與單步金標(biāo)銀染法相比，檢測靈敏度提高10倍到100倍。2.本方法的樣品標(biāo)記處理采用末端引物標(biāo)記生物素的方法，具有成本低廉、試劑有效期長、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。3.本方法的信號顯示方法是銀顆粒，結(jié)果易于保存、對比、以及標(biāo)準(zhǔn)化；同時(shí)，與酶顯色法相比，該方法具有要求的環(huán)境條件低、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。4.本方法使用的Biotin-Tyramine試劑，具有制備方法簡單、免除純化分離、性能穩(wěn)定，易于保存的優(yōu)點(diǎn)。圖1為分別采用TSA—金標(biāo)銀染與單步金標(biāo)銀染檢測痢疾桿菌的芯片可視化信號掃描圖。圖2為分別采用TSA—金標(biāo)銀染與單步金標(biāo)銀染檢測大腸桿菌0157的芯片可視化信號掃描圖，比較的是PCR模板取一系列稀釋梯度時(shí)兩種檢測方法的雜交信號的強(qiáng)度。圖3為分別采用TSA—金標(biāo)銀染與單步金標(biāo)銀染檢測大腸桿菌0157的芯片可視化信號的信號強(qiáng)度比較圖。具體實(shí)施方式實(shí)施實(shí)例1用基因芯片檢測痢疾桿菌的TSA—金標(biāo)銀染的檢測過程1.自制重要病原微生物檢測基因芯片2.按試劑盒提供的試劑用十二垸基硫酸鈉(SDS)煮沸法進(jìn)行基因抽提取40微升痢疾桿菌的菌液加10微升DNA提取液，混合均勻后煮沸20分鐘，以每分鐘13000轉(zhuǎn)離心1分鐘，取上清液作為PCR擴(kuò)增的模板。3.根據(jù)芯片所用基因片斷進(jìn)行基因擴(kuò)增，其引物采用芯片試劑盒附帶的引物，其中反向引物的5'端標(biāo)記生物素。表l:用于擴(kuò)增痢疾桿菌基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>按芯片指定的條件進(jìn)行PCR溫度循環(huán)94°C，5分鐘；94°C，30秒；55°C，30秒；72°C,30秒；72°C，5分鐘；35循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后立即將產(chǎn)物變性94。C，5分鐘，然后-2(TC冷凍保存。4.將點(diǎn)制的基因芯片依次置于0.2e/。的SDS溶液和蒸餾水中洗滌并涼干，在芯片的每個(gè)區(qū)點(diǎn)加IO微升的PCR產(chǎn)物稀釋液(PCR產(chǎn)物用雜交液稀釋10倍)，將芯片置于潮濕的雜交盒中，于5(TC雜交1小時(shí)，使生物素標(biāo)記的DNA樣品與芯片上的特異性探針結(jié)合；然后將芯片用A、B、C清洗液(A:1X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水(SSC)+0.2Q/。SDS，B:0.2XSSC，C:0.1XSSC)依次洗滌并晾干。5.TSA過程芯片每個(gè)區(qū)點(diǎn)加10微升的Streptavidin-HRP稀釋液(1:1500，lxPBS-BSAl%稀釋)，然后將芯片置于37'C溫育30分鐘，取出后用PBST洗液(lxPBS+0.05。/。Tween20)洗滌并晾干；每個(gè)區(qū)點(diǎn)加10微升的Biotin-Tyramine稀釋液(1:200，lxPBS-BSAl%+0.5%H2O2稀釋)，37'C溫育30分鐘，取出后用PBST洗液洗滌并晾千。6.芯片的每個(gè)區(qū)點(diǎn)加IO微升的Streptavidin-Gold稀釋液(:50，lxPBS-BSAl。/。稀釋)，37'C溫育30分鐘，取出后依次用PBST洗液和去離子水洗滌并晾干；將銀染試劑A液和B液混合，每個(gè)區(qū)立即避光點(diǎn)加20微升的A、B混合液，經(jīng)大約20分鐘顯色結(jié)束，用去離子水清洗除去芯片表面的銀染試劑，晾干。7.雜交信號用肉眼可見清晰的灰色或黑色圓點(diǎn)，使用普通光學(xué)掃描儀掃描記錄，可以運(yùn)用多種芯片雜交信號分析軟件對雜交信號進(jìn)行定量分析。用基因芯片檢測痢疾桿菌的單步金標(biāo)銀染的檢測過程是將上述步驟的第5步省略，其他步驟完全相同。比較PCR產(chǎn)物分別取不同稀釋倍數(shù)時(shí)兩種檢測方法的雜交信號的強(qiáng)度，計(jì)算出相應(yīng)的灰度值見表1和表2。表2.痢疾桿菌的PCR產(chǎn)物系列稀釋梯度下金標(biāo)銀染的信號灰度值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3.痢疾桿菌的PCR產(chǎn)物系列稀釋梯度下TSA-金標(biāo)銀染的信號灰度值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施實(shí)例2用基因芯片檢測大腸桿菌0157的TSA—金標(biāo)銀染和單步金標(biāo)銀染的檢測過程。與檢測痢疾桿菌的過程相同。表4:用于擴(kuò)增大腸桿菌0157基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種基因芯片的檢測方法，其特征在于包括TSA過程。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于方法為TSA—金標(biāo)記銀染檢測法。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于包括以下步驟-(1)待測基因的純化、擴(kuò)增，對擴(kuò)增的下游引物以末端標(biāo)記法引入生物素進(jìn)行核酸標(biāo)記；(2)芯片的制備與雜交；(3)TSA過程;(4)金標(biāo)記銀染過程；(5)信號處理。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(3)TSA過程為在雜交好的芯片上點(diǎn)加鏈酶親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，通過鏈酶親和素與耙標(biāo)連接的生物素特異結(jié)合，在靶標(biāo)上引入HRP;然后點(diǎn)加生物素標(biāo)記的酪氨，通過HRP的催化作用使大量的酪氨沉積在反應(yīng)位點(diǎn)周圍。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(4)金標(biāo)記銀染過程為芯片點(diǎn)加鏈酶親和素標(biāo)記的納米級金顆粒，通過鏈酶親和素與生物素的特異結(jié)合將金顆粒連接到靶標(biāo)分子上；然后點(diǎn)加銀染試劑，利用銀染試劑的氧化還原反應(yīng)形成的銀顆粒沉積在納米金上，形成肉眼可見的雜交信號。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(5)信號處理采用光學(xué)掃描儀進(jìn)行掃描檢測。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于步驟(5)信號處理采用圖像分析軟件獲取信號的灰度值，進(jìn)行定量分析。全文摘要本發(fā)明涉及的是一種基因芯片檢測方法，特別是一種大幅度提高基因芯片的金標(biāo)銀染檢測靈敏度的可視化檢測方法。該檢測法主要包括以下步驟將待檢測樣品的基因標(biāo)記生物素分子用于與基因芯片雜交。雜交后的芯片首先TSA處理，通過酶的催化作用使大量的酪氨沉積在反應(yīng)位點(diǎn)周圍；再加入鏈酶親和素標(biāo)記的納米金，將納米級的金顆粒連接到靶標(biāo)分子上；使用銀染試劑對雜交后的基因芯片進(jìn)行顯色；觀察分析信號。本發(fā)明提供的方法是在單步金標(biāo)銀染檢測的基礎(chǔ)上增加一步TSA過程，TSA使用的Biotin-Tyxamine試劑制備方法簡單、免除純化、性能穩(wěn)定、易于保存。本方法與單步金標(biāo)銀染檢測法相比，基因芯片的檢測靈敏度可以提高10-100倍。文檔編號G01N21/77GK101162201SQ20061013583公開日2008年4月16日申請日期2006年10月11日優(yōu)先權(quán)日2006年10月11日發(fā)明者戚紅卷,王升啟,金大智,陳蘇紅申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所