專利名稱：檢測陰道分泌物中羊水的裝置和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及準確檢測陰道中少量羊水的診斷方法。具體地，本發(fā)明涉及采用特異選擇的能與胎盤α1-微球蛋白特異性結合的單克隆抗體。更為具體的是，本發(fā)明涉及選擇一對抗-PAMG-1抗體(“基礎對”)，該對抗體為檢測孕婦陰道分泌物中最低背景濃度的PAMG-1提供了足夠的靈敏性。此外，本發(fā)明涉及包含PAMG-1抗體的固相免疫檢測系統(tǒng)，其中將兩種或更多種抗-PAMG-1抗體的組合固定在裝置的固相支持物上，從而精確建立預定的靈敏度閾值水平。
背景技術：
在大約10％的孕婦中會發(fā)生胎膜(羊膜囊)過早破裂，如果得不到及時治療，將造成大約10％的圍產(chǎn)期死亡。術語PROM(胎膜早破)涉及在足月或不足月分娩開始的24小時前或更多小時前發(fā)生的膜自發(fā)破裂。PPROM指的是早產(chǎn)膜早破。大約有30-50％這樣的過早破裂發(fā)生在懷孕37周之前。在這樣的情況下，由于PROM與胎兒肺系統(tǒng)發(fā)育障礙和子宮內(nèi)感染風險的顯著增加相關，胎膜破裂的確切診斷是非常重要的。這樣的感染在子宮內(nèi)滲透會使產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期發(fā)病率及死亡率上升大約10個百分點。在懷孕38至40周及時診斷破裂是極為重要的，因為一旦檢測出PROM，就應該盡可能快地誘發(fā)分娩。破裂診斷在懷孕37周前也很重要，因為它使得能夠防止羊膜內(nèi)感染和對胎兒肺發(fā)育進行刺激。
目前診斷膜破裂沒有“金標準”。PROM是一個動態(tài)過程，因此膜破裂和診斷狀態(tài)的實施之間的間隔、“高”滲漏的出現(xiàn)、間歇滲漏、與種群相關的PROM發(fā)生率的變化以及能干擾檢測結果的材料都是如不解決將造成不準確的報道的因素。這些不準確性可能在解釋旨在揭示用于鑒別PROM的最佳手段的研究時導致錯誤。
PROM的診斷傳統(tǒng)上依賴于患者報告液體從陰道流出。物理檢查能夠給出明確的診斷；然而，在檢查中有時候也存在結果的內(nèi)在不一致或者摸棱兩可。這種情況造成對驗證性診斷試驗的需要(Lockwood C.J.et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.，1994，v.171，No 1，pp.146-150)。目前所采用的一些用于檢測陰道中羊水的方法都存在不足，例如羊齒試驗(fern test)(M.L.Friedman and T.W.McElin，“破裂胎膜的診斷”，American Journalof Obstetrics and Gynecology 1969，Vol.100，pp.544-550)。該方法基于觀察羊水在載玻片上干燥后形成的所謂樹狀圖形而進行羊水檢測。然而，該方法不夠準確，因為它是以陰道中羊水高度揮發(fā)的特性為基礎的。其產(chǎn)生的錯誤結果可達30％之多。
也有人提出通過采用一些染料尼羅藍，丫啶橙，溴百里酚藍，硝嗪(Nitrazine)等來檢測胎膜的破裂(M.L.Friedman and T.W.McElin，見上文)。該方法不夠便捷，而且由于陰道中羊水的易揮發(fā)的化學性質(zhì)及對其的某些可能混合而具有缺點。例如，陰道感染可能會影響上述檢測的結果。對目前流行的Nitrazine和Ferning檢測的早期研究表明，這些檢測具有很高的不準確率，自膜破裂后一個小時以上這種不準確率隨時間延長愈發(fā)增高，且在24小時后變成不確定的。該研究表明，在PROM延長的情況下，這些檢測并未比簡單的臨床評估提供了更好的診斷信息(Gorodeski I.G，Haimovitz L.，Bahari C.M.，Journal Perinat.Med，1982，v.10，No6，pp286-292)。更近一些的檢測數(shù)據(jù)為(Trovo S.et al.，Minerve Ginecol.1998，v.50，No12，pp.519-512)Nitrazine檢測顯示的靈敏度為70％，特異性為97％，準確度90％；
Ferning檢測顯示的靈敏度為70％，準確度為93％。
近來有人提出基于羊水中蛋白質(zhì)的免疫化學分析來檢測胎膜的破裂。停泊式免疫化學分析(Docked immunochemical analysis)利用以下羊水蛋白質(zhì)來檢測膜破裂α-胎蛋白，催乳素，纖連蛋白，以及胰島素樣生長因子結合蛋白1，見B.L.Rochelson等“快速檢測——可能應用于膜的早熟破裂診斷中”，Obstetrics and Gynecology，1983，v.62，pp.414-418；P.R.Koninckx等“陰道液中催乳素的濃度一種診斷膜破裂的新方法”，British J.Obstetr.Gynecol.，1981，v.88，pp.607-610；P.Hellemans等“在羊膜破裂早期檢測中應用ROM Check免疫測定的初步結果”，Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.，1992，v.43(3)，pp.173-179；Rutanen，E.M.等“宮頸/陰道分泌物中胰島素樣生長因子結合蛋白-1的檢測在胎膜破裂診斷中與ROM Check膜免疫檢測相比較”，Clin.Chim.Acta.，1993，v.214，pp.73-81。Rutanen，E.M.，等后來研發(fā)了一種采用倒置色譜膜的色譜檢測(FI-84863；美國專利US5554504)。
這些基于α-胎蛋白(AFP)和催乳素(PRL)的方法是不可靠的，因為AFP和PRL蛋白的血液/羊水比率很容易發(fā)生明顯變化。AFP和PRL僅僅在懷孕的第二個三個月期在羊水中以高濃度存在。足月時兩種蛋白的羊水/血清蛋白濃度比率均僅為大約3至4。
另一種基于陰道分泌物中胎兒纖連蛋白檢測的方法也不令人滿意。例如即使在胎膜不破裂的情況下，胎兒纖連蛋白也可能存在(P.Hellemans，等“在羊膜破裂早期檢測中利用ROM Check免疫檢測的初步結果”，Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.，1992，v.43(3)，pp.173-179；C.Lockwood，等“在宮頸和陰道分泌物中胎兒纖連蛋白可作為早產(chǎn)的預報物”，NewEngland Journal of Medicine，1991，v.325，pp.669-674)，因此產(chǎn)生了假陽性結果。
所有這些以檢測α-胎蛋白、催乳素和纖連蛋白為基礎的胎膜破裂檢測方法是不準確的，因為在這些蛋白質(zhì)的羊水濃度以及這些蛋白的羊水與血清相對濃度的調(diào)控上存在可變的因素。
對于最新的IGFBP-1檢測，關于其特異性和準確度，存在矛盾數(shù)據(jù)。一種快速試條檢測(strip test)(OY Medix Biochemica的PROM檢測，F(xiàn)inland，也稱為Amni-check，MAST Diagnostica，Germany)，已經(jīng)被研發(fā)出來用于檢測陰道分泌物中IGFBP-1的存在(Rutanen EM，KarkkainenTH，Lehtovirta J.，Uotila JT，Hinkula MK，Hartikainen AL.“在胎膜破裂診斷中胰島素樣生長因子結合蛋白-1的快速試條檢測的評價”，Clin ChimActa 1996，Sep30；v.253(1-2)，pp.91-101)。E.Rutanen報道了該測定法的檢測限度的設定應該使宮頸分泌物中低于400ng/ml(低于孕婦血清中IGFBP-1水平的95％)的IGFBP-1濃度保持陰性。然而，在出血的情況下，要對檢測結果進行謹慎的解釋，因為直接來自胎盤床的血可能比來自宮頸血管的血液含有更多量的IGFBP-1。
按照該測定法，所有來自臨床確診為PROM的婦女的樣本(n＝55)均顯示陽性結果，而來自無癥狀婦女的75份樣本中有71份為陰性。在這組樣本中，檢測的靈敏度為100％而特異性為94.7％。這一事實可以用該檢測的第一步中采用的單克隆抗體的特異性不足(交叉反應)來解釋。
在對181名懷疑有PROM但最初檢查PROM結果不確定的患者中，該檢測的結果為64例陽性，117例陰性。64例陽性患者中50人(78.1％)在妊娠37周之前分娩，其中42人(65.6％)在取樣之后2周之內(nèi)分娩。具有陰性結果的117名患者中5人由于與PROM無關的原因選擇了剖宮產(chǎn)。在其他的112名患者中，102人(91.1％)足月分娩，另外10人(8.9％)在37周之前分娩，其中7人(6.3％)在取樣后2周之內(nèi)分娩(E.Rutanen等，1996)。遺憾的是，沒有有關PROM確診的婦女中此PROM檢測的靈敏度和特異性的數(shù)據(jù)。
在W.Wolitmann的研究中，Amni-check被用于檢測來自臨床未確定PROM的婦女的150份羊水樣本和50份陰道分泌物樣本中的IGFBP-1。該檢測具有97％的靈敏度和100％的特異性(Woltmann W.等，Z..Gebursh.Neonatal，1995，v.199，pp.243-244)。
V.Ragosh評價了在75份陰道分泌物樣本中Amni-check檢測的診斷準確度。該檢測顯示了100％的靈敏度和83％的特異性。研究者報道了假陽性率高度取決于分娩活動。在子宮收縮的婦女中，該檢測具有59％的特異性(Ragosch，V.等，Geburtsh.U.Frauenheililk.，1996，Vol.56，pp.291-296)。
在E.Darj和S.Lyrenas進行的一項研究中(Acta Obstet.Gynecol.Scand.，1998，v.77，pp.295-297)，PROM檢測在臨床確診患者(具有明顯膜破裂的婦女或具有完整膜的婦女)中具有95.7％的靈敏度和93.1％的特異性。然而，在懷疑有PROM的患者中，PROM檢測的靈敏度和特異性僅僅分別為70.8％和88.2％。這種差異能夠通過該檢測的截斷值(400ng/ml)來解釋，該值使得不可能檢測未確診患者陰道分泌物中少量的羊水(例如，在小破裂的情況下)。
因此，膜完整的婦女的顯著的陰道IGFBP-1背景水平和檢測中的高截斷閾值會對檢測的靈敏度和特異性造成損害，從而影響未確診患者中該檢測的準確性。血清和/或炎癥分泌物的混合也會影響檢測的準確性(見上述E.Darj et S.Lyrenas的數(shù)據(jù))。該檢測的作者沒有研究此問題。
為了避免部分上述缺點，采用針對胰島素樣生長因子的兩個結合位點的兩種單克隆抗體來檢測未結合的胎盤α1-微球蛋白級分(美國專利US5968758、5597700、5891722、5877029)。
在這些專利中，未結合的PAMG-1和IGFBP-1這兩種蛋白質(zhì)的同一性是毫無根據(jù)假定的。而事實上，這樣的假定只能建立在這些蛋白質(zhì)的一級結構和基因比較的基礎上。
在上述的專利中，不可能建立起這種檢測的靈敏度閾值，以便獲得可能的最高程度準確度(99％或以上)。這些檢測的共同問題是待測物質(zhì)的背景水平和背景濃度的可變性。例如，孕婦陰道分泌物中的另一種蛋白質(zhì)IGFBP-1的背景水平在0.5至90ng/ml這樣一個大的范圍內(nèi)變化(見Rutanen的研究)。第二個重點是含有待測物質(zhì)的炎癥分泌物或血清在陰道分泌物中混合的可能性。這可能導致假陽性結果。
D.Petrunin首先對蛋白質(zhì)PAMG-1進行了描述(Petrunin D.等，Akusherstvo i Ginekologia，1977，No.1，p.64，in Russian；還可參見PMID65924，MEDLINE的PubMed索引“免疫化學鑒別器官特異性人胎盤α-球蛋白及其在羊水中的濃度”，Akusherstvo i Ginekologia(Moscow)1977Jan，Vol.1，p，64))。獲得了針對已純化和分離的該蛋白質(zhì)的抗體，并且可采用免疫化學方法在妊娠的不同階段檢測羊水(包括取自陰道的羊水)中該蛋白質(zhì)的含量。還檢測了該蛋白質(zhì)在胎兒和成人的血液及不同器官中的濃度。
在隨后幾年中，直至1990年，這一研究小組繼續(xù)發(fā)表了關于此蛋白質(zhì)研究的新結果(Petrunin，D.等，“在妊娠期間四種胎盤蛋白的比較研究”，Akusherstvo i Ginekologia，1988，No.1，pp.50-52；Zaraisky，E.等，VoprosyMed.Khemii，1980，No 5，pp.131-132；Tatarinov，Y.等，Uspekhi Sovr.Biologii 1990，Vol.109，pp.369-373；Boltovskaya，M.等，Bulletin ofExperimental Biology and Medicine，1991，No.7，pp.397-400；Nasimova，S.V.等，Bulletin of Experimental Biology and Medicine，1993 Sep；Vol.116，No.9，pp.302-304(所有這些文獻均為有英文摘要的俄文文獻))。D.Petrunin獲得了有關PAMG-1分離方法的發(fā)明證書(#SU-1614184A1，優(yōu)先權年份為1988年)。
在1988-1989年，有幾篇論文詳細地公開了相似的蛋白質(zhì)-胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP)的部分或全部序列，它獲自羊水、胎盤或人肝細胞瘤(Bell S等，1988；Luthman H.等，1989；Julkunen等，1988；Lee，Y.等，1988)。該基因定位于人的第7號染色體的7p14-7p12片段上。在1991年之前，研究者給這種蛋白起了不同的名稱α1-PEG、PP-12、IGFBP、BP-25等。
在1980-1982年間，Bohn從胎盤分離出一種蛋白并稱之為PP-12。在他的文章中，對比了PP-12與較早發(fā)現(xiàn)的PAMG-1蛋白，并討論了它們之間的異同。
與其他研究文章相對比的是Bell等(1988)發(fā)表的一篇文章，他發(fā)現(xiàn)了α1-PEG蛋白的N-末端肽的多態(tài)性，即在第11和第12位的位置，并得出結論——事實上有兩種不同的蛋白而不是一種。
S.Bell再一次引用他自己的關于羊水中兩種不同的α1-PEG蛋白的文章。該文章接受了1990年系統(tǒng)命名委員會的決定(關于IGF結合蛋白的系統(tǒng)命名的報道，Journ.Clin.Endocr.And Metabol.1990，70，#3，P.817)，它確定蛋白質(zhì)AFBP、PP-12、α1-PEG、GH-蛋白、結合蛋白28、26、25、JB-1是相同的，并給予它們通用名稱hIGFBP-1。
一種所謂的游離PAMG-1被用于檢測胎膜破裂。然而，如上所述，并未建立高準確度的檢測法(＞99％)。這一目標后來通過我們的新方法和裝置得以實現(xiàn)，見本申請的描述。本發(fā)明采用選擇一對單克隆抗體以提供足夠的靈敏度來檢測陰道分泌物中極低濃度PAMG-1的方法，并且還涉及選擇一些其它的抗PAMG-1抗體，將它們與上述的兩種抗體組合起來，從而可以精確建立試條裝置靈敏度的預定閾值。這轉而有可能使檢測結果的假陽性率最小化。
本發(fā)明始自D.Petrunin的先期研究，他分離并描述了胎盤α-微球蛋白，并采用免疫化學方法對其在羊水、血液和一些組織中的濃度進行了徹底測量。該出版物屬于任何研究者都應會考慮的公知領域。PAMG-1的分離方法受官方發(fā)明人證書(#SU-1614184A1，優(yōu)先權年份為1988)，即前蘇聯(lián)的同族專利的保護。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及檢測妊娠期間陰道分泌物中少量羊水的方法。
本發(fā)明涉及在孕婦陰道分泌物中檢測高于羊膜蛋白PAMG-1最小背景濃度的PAMG-1(其指示羊水的存在)的方法。
在一個具體的實施方案中，用于檢測PAMG-1蛋白的方法是利用一對特異選擇的單克隆抗體來檢測陰道分泌物中最低背景濃度的PAMG-1蛋白質(zhì)。該對抗體與至少一種另外的抗PAMG單克隆抗體聯(lián)合使用，以便精確建立給定的檢測靈敏度閾值。
本發(fā)明還考慮于一個試條裝置中聯(lián)合使用PAMG-1捕獲抗體，從而能更精確地設定陰道分泌物中羊膜蛋白PAMG-1的檢測方法的靈敏度閾值。該方法比只采用一對選定的抗體可以對靈敏度和動力學范圍提供更大的控制。
研究發(fā)現(xiàn)，該方法的最適靈敏度閾值水平接近5ng/ml，因為可能由炎癥引起的陰道分泌物中PAMG-1的上限水平不會超過3ng/ml，而在另一方面，在健康孕婦的陰道分泌物中PAMG-1的常規(guī)背景水平是大約0.2ng/ml。待測物質(zhì)的背景水平和閾值濃度之間的顯著差異使得假陰性和假陽性結果最小化。在一個實施方案中，識別羊膜PAMG-1的第一步發(fā)生在試條裝置的襯墊(pad)部分，在此處特異選擇且已標記的抗體定位于其上。反應的第二步驟發(fā)生在試條裝置的測試區(qū)(test region)，此處固定有所選擇的抗體對中的第二抗體和優(yōu)選的至少一種另外的抗PAMG-1抗體。
總而言之，我們公開了用于檢測孕婦陰道中少量羊水的方法和裝置。優(yōu)選地，該方法基于抗胎盤α1-微球蛋白(PAMG-1)的單克隆抗體對的選擇。選擇的目的首先是檢測在陰道分泌物中PAMG-1的最低背景濃度。有了該信息，任何能檢測高于該閾值水平的PAMG-1的分析技術都能夠被用來檢測陰道分泌物中的羊水。基于該信息，可以制造基于使用相同抗體對和另外的抗體的裝置，以便降低并準確設定裝置的靈敏度閾值，從而使假陰性和假陽性結果的可能性最小化。
捕獲抗體及其片段的各種組合，或者任何其他分子的組合均是可以的，只要其具有與本文所述特性相同的特性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，該方法包括將含有PAMG-1蛋白質(zhì)的樣本與單克隆抗體，即所選抗體對中的第一抗體接觸，該抗體選擇性地檢測PAMG-1。該方法還包括形成抗體-PAMG-1復合物的抗體，以及通過抗體對中的另一個標記了的單克隆抗體檢測該抗體-PAMG-1復合物的步驟。它最后包括定量測量羊膜未破裂的孕婦陰道中的最低背景濃度PAMG-1。該方法常用于ELISA類試驗中。
在本發(fā)明的另一實施方案中，裝置使含有PAMG-1蛋白質(zhì)的樣本與標記了的單克隆抗體，即所選抗體對中的第一抗體接觸，該抗體選擇性地檢測PAMG-1。它進而包括形成抗體-PAMG-1復合物的抗體、該復合物的水平流動、以及通過另一個識別PAMG-1的單克隆抗體檢測此抗體-PAMG-1復合物的步驟，由此裝置的靈敏度閾值采用另外的抗體設定在5-7ng/ml左右，從而具有比采用識別PAMG-1的單克隆抗體對所能獲得的準確度要高的準確度。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明裝置的示意性縱剖面圖，所說裝置可以用于檢測PAMG-1的存在以便診斷胎膜破裂。
圖2是圖1裝置的平面圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明通過檢測在陰道分泌物中極低濃度的胎盤α1-微球蛋白而解決了上述有關準確檢測陰道分泌物中的羊水的問題。由于PAMG-1的低背景濃度水平(在孕婦陰道分泌物中大約為0.2ng/ml)，該方法被證明是有利的。本發(fā)明的關鍵點在于選擇單克隆抗體以檢測低濃度的該蛋白，這樣允許對這些蛋白的值進行定量，從而反過來使得可以采用任何分析技術來檢測PAMG-1水平。PAMG-1以低濃度存在于陰道分泌物中是可以預見的，因為毛細血管壁對血液蛋白的通透性取決于蛋白質(zhì)翻譯后的修飾及其與其它分子的相互作用(Marinaro J.A.等O-糖基化延緩了人IGF結合蛋白6從循環(huán)中的清除；Eur J Endocrinol 2000年5月；142(5)512；Schneeberger E.E.蛋白質(zhì)和小泡在毛細管內(nèi)皮中的轉運；Fed Proc 1983年5月，15；42(8)2419-2424；Minshall RD等小泡形成和在內(nèi)皮細胞中的運輸以及內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)；Histochem Cell Biol 2002年2月；117(2)105-12；Del Vecchio PJ等單層內(nèi)皮對大分子的通透性；Fed Proc 1987年6月；46(8)2511-5；Siflinger-Birnboim A等單層內(nèi)皮的選擇性對提高通透性的影響；Microvasc Res 1998年11月；36(3)216-27；Ghinea N，Milgrom EALH/CG受體的新功能激素在靶器官中橫穿內(nèi)皮屏障的胞轉作用；Semin Reproduct Med 2001；19(1)97-101)。經(jīng)過翻譯后修飾的或與另外的分子建立非共價鍵的PAMG-1分子是最少滲透進入陰道分泌物中的分子。這樣的分子在陰道分泌物中的濃度應該很低，除非羊膜囊破裂。PAMG-1分子的異質(zhì)性也可能是可變剪接的結果。Bell等提出了羊水中兩種接近但不相同的蛋白α1-PEG的數(shù)據(jù)。α1-PEG與PAMG-1相似。不同分子滲透進入陰道分泌物中的滲透性高低取決于毛細血管壁的選擇通透性和選擇性分泌過程。成功的免疫檢測試驗要求檢測在陰道分泌物中低背景濃度的PAMG-1分子。
成功選擇出了能進行這樣檢測的一對單克隆抗體。所檢測的PAMG-1分子的確切特征對于本發(fā)明的目的來說并不重要，重要的是在陰道中它必須以低濃度存在。該參數(shù)足以將靈敏度閾值設定在低水平，從而保持檢測閾值和陰道分泌物中PAMG-1背景水平之間的顯著差異。這種最佳閾值的選擇允許過濾掉檢測中潛在的假陰性和假陽性結果。
具體地，對胎盤α1-微球蛋白的單克隆抗體(MAb)進行了研究，該研究以該Mab在本發(fā)明另一MAb的MAb-PAMG-1-綴合物系統(tǒng)中的反應性為基礎(實施例4，表6)。特別地，采用M271-M52已發(fā)現(xiàn)了最高效價。然而，采用抗體對MAb271-MAb52以及常規(guī)ELISA技術，申請人未能在陰道分泌物中檢測到任何PAMG-1濃度。研發(fā)出了用于抗體對MAb271-MAb52的高靈敏度ELISA技術(實施例5，表7)，并且用其測量陰道樣本(實施例6，表8)以及孕婦宮頸和陰道分泌物(實施例7，表9)中低濃度的PAMG-1(皮克級)。在ELISA中，第一層由高度特異性的MAb271形成。辣根過氧化物酶綴合物含有MAb52，用不含任何抑制劑的緩沖液稀釋。
從實施例7、表9中可以看出，沒有懷孕并發(fā)癥的孕婦宮頸和陰道分泌物中PAMG-1的濃度范圍為0.05至0.22ng/ml。人們可以從這一數(shù)據(jù)中看出-正常PAMG-1(8例)濃度位于某一穩(wěn)定水平附近。在陰道和宮頸中PAMG-1的相對穩(wěn)定性可用于指示方法參數(shù)的穩(wěn)定性和收集樣本的方式的標準化。
-在宮頸分泌物中PAMG-1正常濃度的平均水平是大約151pg/ml，在陰道分泌物中為大約110pg/ml；-在與血管障礙(貧血、胎兒發(fā)育遲緩)無關的妊娠病理學的情況下，也可觀察到接近正常水平的PAMG-1；-血液混合伴隨著宮頸中PAMG-1濃度的升高，觀測到290pg/ml水平，而正常濃度為151pg/ml；-PAMG-1水平在早產(chǎn)或妊娠中毒癥狀存在時會提高，這可能由于胎膜對蛋白質(zhì)的通透性提高所致；-如果出現(xiàn)羊水滲漏，PAMG-1水平急劇升高(升高10-50倍)。
如以下實施例所示，選擇了一對單克隆抗體M271和M52用于進一步研發(fā)本發(fā)明方法和裝置以及試劑盒。
因此，本發(fā)明涉及特別是所選擇的具有PAMG-1結合親和力的單克隆抗體對、包括具有PAMG-1結合親和力的抗體的生物學組合物、采用本發(fā)明抗體檢測PAMG-1的試劑盒、以及用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的細胞系。本發(fā)明還涉及檢測PAMG-1以及胎膜破裂的裝置和方法，其基于陰道分泌物中PAMG-1的存在所指示的陰道中羊水的存在。
如這里將要更加詳細描述的，本發(fā)明部分基于單克隆抗體對的研究，該對抗體允許檢測孕婦陰道分泌物中PAMG-1的最低背景濃度。首先，陰道分泌物中PAMG-1的最低背景濃度和它在羊水中的高濃度使得可以將裝置的靈敏度閾值設定在低水平并由此使得可以檢測陰道分泌物中極少量的羊水，其次，這使得可以以最佳方式，具體地在胎膜未破裂的孕婦陰道分泌物中典型的PAMG-1最低背景濃度水平和羊水中典型的高水平PAMG-1之間，設置裝置的靈敏度閾值。另外的一種或多種PAMG-1單克隆抗體可以允許更準確地將裝置的靈敏度閾值建立在預定水平，如用于半定量分析。而且，因為在陰道分泌物中羊水的存在是胎膜破裂的指示，在陰道分泌物中檢測PAMG-1也能用于檢測胎膜破裂。所有這些結合起來使得檢測PROM和PPROM的試驗具有最少的假結果。
根據(jù)本發(fā)明，PAMG-1特異性抗體可以摻入到用于檢測PAMG-1及進而基于陰道分泌物中PAMG-1的存在而檢測胎膜破裂的物質(zhì)組合物、試劑盒、裝置以及方法中。
PAMG-1蛋白PAMG-1是一種存在于孕婦血清、羊水和陰道分泌物中以及所有人的血清中的蛋白質(zhì)。在未孕婦女(0-60ng/ml)和孕婦(5-120ng/ml)血清中存在PAMG-1，此處的檢測濃度取決于在檢測中所采用的單克隆抗體對(實施例1，表1及2)。眾所周知，采用針對相同蛋白的不同抗體對，會得到該蛋白的不同測定濃度。因此，在Diamandi A.等的類似研究中(參見Diamandi A.等“胰島素樣生長因子結合蛋白3的免疫檢測”，Journalof Clinical Endocrinology and Metabolism，2000年6月，Vol.85，No.6，pp.2327-2333)，三種ELISA變體顯示了IGFBP-3的三種不同濃度，DiamandiA.等將其歸因于每種抗體對挑揀特異的翻譯后修飾的蛋白分子的能力。研究發(fā)現(xiàn)，PAMG-1在羊水中的濃度明顯比血清中高(2000-75000ng/ml)。
PAMG-1于1977年由D.Petrunin從羊水中分離，并且起初被稱為特異性的胎盤α1-球蛋白(D.Petrunin等“人胎盤器官特異性α1-球蛋白的免疫鑒別及其在羊水中的含量”，Akusherstvo i Ginekologiya，1977，N 1，pp.64-65，Moscow，USSR(見實施例2))。
一種相似但不相同的蛋白，被標識為PP12(胎盤蛋白12)，隨后由Bohn等從胎盤和胎膜中分離并純化。(“新胎盤特異性蛋白(PP12)的分離和表征”，Arch.Gynecol.，980，Vol.229，pp.279-291)。S.Bell等報道了與PP12不同的子宮內(nèi)膜PEG-1蛋白的分離，該蛋白在N端15個氨基酸的肽中有兩個氨基酸替代(氨基酸N11，12)(S.Bell等，American Journalof Reproductive Immunology，1989，Vol.20，pp.87-96)。
為了進一步表征從羊水中鑒定的這些蛋白的特征，進行了一系列檢測以確定PAMG-1的分子量。采用免疫印記法測定了PAMG-1的分子量，發(fā)現(xiàn)其為32KD(千道爾頓，KD是原子質(zhì)量單位)(Boltovskaya，M.N.等“采用單克隆抗體的胎盤α1-微球蛋白[PAMG-1]組織化學和臨床診斷研究”，Bulletin of Experimental.Biology and Medicine，1991，No.10，pp.397-400)。申請人隨后假定PAMG-1涉及IGFBP蛋白家族(見美國專利US5968758)。
PAMG-1可以以不同的異構體存在，即經(jīng)過不同的翻譯后修飾。抗體可以對一種異構體比對另一種異構體具有不同的特異性，這可有利地用于本發(fā)明的檢測試驗中。
PAMG-1的抗體起初，采用了PAMG-1單特異性抗體(例如，Tatarinov，Y.等，UspekhiSovr.Biologii，1990，Vol.109，pp.369-373)。隨后，獲得僅能識別那些無IGF-1和IGF-2的PAMG-1的抗體(美國專利US5891722)。
這里，術語“抗體”指的是具有本申請中所述結合親和力的任何蛋白，而與獲得蛋白的方法無關。例如，蛋白質(zhì)可以是單克隆抗體或其片段，或具有本申請中所述結合特異性的任何分子。
根據(jù)本發(fā)明，從體液分離的、重組產(chǎn)生的或化學合成的PAMG-1多肽，以及其片段或者其它衍生物或類似物，包括融合蛋白，都可以用作免疫原來生產(chǎn)識別PAMG-1多肽的抗體。這些抗體包括但不限于多克隆抗體，單特異性抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，以及Fab表達文庫。本發(fā)明的抗PAMG-1抗體可具有交叉反應性，例如，它們可以識別不同物種的PAMG-1。多克隆抗體具有更大的交叉反應的可能性。作為選擇，本發(fā)明的抗體可以是對單一形式的PAMG-1特異的。優(yōu)選地，該抗體對人PAMG-1是特異性的。
可采用本領域已知的各種方法來生產(chǎn)PAMG-1多肽或其衍生物或類似物的多克隆抗體。為了生產(chǎn)抗體，可通過對各種宿主動物注射PAMG-1多肽或其衍生物(例如，片段或融合蛋白)進行免疫，這些動物包括但不限于兔，小鼠，大鼠，綿羊，山羊等。在一個實施方案中，PAMG-1多肽或其片段可以綴合至免疫原性載體上，例如，牛血清白蛋白(BSA)或匙孔槭血藍蛋白(KLH)。可采用各種佐劑來提高免疫應答，其取決于宿主種類，包括但不限于弗氏佐劑(完全的和不完全的)，礦物凝膠例如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂，pluronic polyols，聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔槭血藍蛋白，二硝基酚，以及可能有用的人類佐劑例如BCG(卡介苗)以及小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
為了制備抗PAMG-1多肽或其片段、類似物或衍生物的單克隆抗體，可以采用通過培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術。這些技術包括但不限于最初由Kohler和Milstein建立的雜交瘤技術(Nature 1975，256495-497)，以及trioma技術、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，Immunology Today 1983，472；Cote等，Proc.Natl.Acda.Sci.U.S.A.1983，802026-2030)，以及生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96，1985)。在本發(fā)明的另一實施方案中，單克隆抗體可以在無菌動物中生產(chǎn)(國際專利公開號WO89/12690，1989年12月28日公布)。事實上，根據(jù)本發(fā)明，可采用已建立的“嵌合抗體”生產(chǎn)技術(Morrison等，J.Bacteriol.1984，159870；Neuberger等，Nature 1984，312604-608；Takeda等，1985，Nature 314452-454)，該技術將來自針對PAMG-1多肽的小鼠特異性抗體分子的基因與來自具有合適生物活性的人抗體分子的基因剪接在一起；這種抗體也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種人或人源化嵌合抗體優(yōu)選用于人類疾病或病癥的治療中(在下文描述)，因為人或人源化抗體比異種抗體有小得多的可能性引起免疫應答，尤其是針對它們自身的變態(tài)反應。
根據(jù)本發(fā)明，可采用生產(chǎn)單鏈抗體的技術(Huston的美國專利US5476786和5132405；US4946778)來生產(chǎn)PAMG-1多肽特異性單鏈抗體。事實上，這些基因可以遞送至體內(nèi)表達。本發(fā)明的另一實施方案利用構建Fab表達文庫的技術(Huse等，Science 1989，246P1275-1281)，從而方便快捷地鑒別出具有針對PAMG-1多肽或其衍生物或類似物的期望特異性的單克隆Fab片段。
包含抗體分子獨特型的抗體片段可以通過已知技術生產(chǎn)。例如，這樣的片段包括但不限于可以由胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab)2片段；可以通過還原F(ab)2片段的二硫橋而產(chǎn)生的Fab片段，以及可以采用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
在抗體的生產(chǎn)中，對期望抗體的篩選可以通過本領域的公知技術完成，例如，放射免疫檢測試驗，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測試驗)，“夾心”免疫檢測試驗，免疫放射分析試驗，凝膠擴散沉淀反應，免疫擴散試驗，原位免疫檢測試驗(例如，采用膠體金，酶或放射性同位素標記)，蛋白質(zhì)印跡，沉淀反應，凝集試驗(例如，凝膠凝集試驗，血細胞凝集試驗)，補體結合試驗，免疫熒光檢測試驗，蛋白A檢測試驗，以及免疫電泳檢測試驗等。在一個實施方案中，通過檢測第一抗體上的標記來檢測抗體的結合。在另一實施方案中，通過檢測與第一抗體結合的第二抗體或試劑來檢測第一抗體。在又一實施方案中，第二抗體被標記。許多在免疫試驗中檢測結合的方法在本領域中是已知的，并且包含于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，為了選擇識別PAMG-1多肽特異表位的抗體，可以分析產(chǎn)生的雜交瘤的產(chǎn)物與含有該表位的PAMG-1多肽片段的結合。為了選擇對特定動物物種的PAMG-1多肽具特異性的抗體，可以基于與從該動物物種的細胞表達或分離出來的PAMG-1多肽的陽性結合進行選擇。
根據(jù)本發(fā)明的特異性抗體根據(jù)本發(fā)明的雜交瘤細胞系通過以下方法產(chǎn)生。首先，用PAMG-1免疫具有脾和淋巴結B細胞的小鼠。然后產(chǎn)生雜交瘤以永生化B細胞。該B細胞可以是脾和/或淋巴結B細胞。然后，那些產(chǎn)生具有PAMG-1結合親和力的單克隆抗體的雜交瘤用ELISA法鑒別第一層PAMG-1；第二層雜交瘤上清液；以及第三層辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠抗體綴合物。然后，這些鑒別出來的雜交瘤在體外或腹水中培養(yǎng)，并且分離其所生產(chǎn)的單克隆抗體。在一個具體實施方案中，抗體來自保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Induxtrial MicroorganismsDepository)，保藏號分別為VKPM H-92，VKPM H-93，VKPM H-94的雜交瘤N52，N271以及N42。
根據(jù)本發(fā)明的組合物本發(fā)明還涉及一系列包括兩種或更多種根據(jù)本發(fā)明的抗體的組合物。在一個實施方案中，組合物包括一對抗體和結合于其中一個抗體上的可檢測標記?？刹捎酶鞣N可檢測標記，包括但不限于染色的顆粒、酶、熒光染料以及放射性同位素?？蓹z測標記的一個具體實例是平均大小為20至30nm的金染色顆粒?？蓹z測標記的另一例子是辣根過氧化物酶?？蓹z測標記與抗體結合的方法見于例如，Harlow，E.及Lane，D.，Methods InEnzymology，1981，Vol.73，pp.3-46；“Antibodies a Laboratory Manual”，Gold Spring Harbor Laboratory，1988，pp.322，323及343；和Pierce Catalog，pp.T9-T17(1996)。合適的酶包括但不限于，堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。其它可用于本發(fā)明中的標記物或標記包括膠體金、帶色乳膠珠、磁珠、熒光標記(例如，異硫氰酸熒光素(FITC))，藻紅素(PE)、得克薩斯紅(TR)、羅丹明、游離或螯合的鑭系元素鹽(特別是Eu3+)，幾種熒光團)、化學發(fā)光分子、放射性同位素(125I，32P，35S，螯合的Tc等)或磁共振成像標記。其他標記包括熒光淬滅和熒光轉移標記，例如，用于均相及固相檢測中。而且，根據(jù)本發(fā)明的標記可以是表位、結合配偶體，或者是與另一種分子相互作用的“柄”，例如生物素-鏈霉親合素；谷胱甘肽-GST；六組氨酸-鎳等。本發(fā)明也考慮采用第二抗體作為標記，該第二抗體本身被可檢測地標記(例如，在所采用的抗PAMG-1抗體對具有來自兩種不同動物物種的Fc部分的情況下)。
在另一實施方案中，組合物還包括兩種或更多種定位在本發(fā)明的試條裝置的測試區(qū)的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明還涉及檢測PAMG-1的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的一對抗體其中之一對PAMG-1高度特異。在此試劑盒的一個變體中，一個或另一個抗體帶有與抗體結合的可檢測標記。在另一實施方案變體中，所選擇抗體對中的一個或另一個抗體結合于固相支持物上。在該變體中，所選擇抗體對中的固定抗體帶有可檢測的標記。在另一實施方案中，組合物包括三種或更多單克隆抗體，其中之一可移動并且可檢測，從而該組合允許調(diào)整免疫色譜分析試驗的靈敏度閾值。
在一個特定實施方案中，具有最高結合親和力的抗PAMG-1抗體可移動，并置于裝置的襯墊區(qū)域中以用于起始的樣本接觸。另一抗體置于裝置的測試區(qū)域中。作為選擇，其它具有PAMG-1高結合親和力的單克隆抗體，即使其親和力達不到最高親和力，也可以以不同組合配制以固定在裝置的測試區(qū)域中，從而建立或調(diào)整本發(fā)明裝置的預定靈敏度閾值。這可以通過常規(guī)實驗完成，如實施例11所示。不同的抗體組合物可以將本發(fā)明裝置的信號檢測閾值建立在預定水平。
檢測PAMG-1的方法和裝置本發(fā)明確立了對于檢測導致羊水滲漏進入陰道的胎膜破裂，PAMG-1，特別是羊水中存在的量比正常陰道液中存在的量多得多的PAMG-1，是一種有用的分析物。換句話說，它允許對膜，即羊膜囊的早熟破裂進行診斷。本發(fā)明進一步確立了用于檢測正常情況、各種陰道炎癥狀以及真實膜破裂情況下PAMG-1的截斷值。在鑒定了該分析物和指示膜破裂的相對水平后，本領域技術人員就可以有利地采用已知的任何檢測蛋白質(zhì)的分析技術來確定患者是否發(fā)生了膜早熟破裂。
免疫檢測試驗，特別是免疫色譜試驗是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選技術，而免疫試驗將在以下詳細描述。這些試驗具有特異性、準確度、速度和經(jīng)濟上的優(yōu)勢。
本發(fā)明也可以采用其他方法來檢測和定量PAMG-1，但這些方法可能需要昂貴的設備并且受限于實驗室條件。一種這樣的技術是質(zhì)譜分析法，例如，采用具有延遲引出(delayed exraction)和在飛行時間室具有反射器(reflectron)的基質(zhì)輔助的激光解吸(MALDI)飛行時間(TOF)質(zhì)譜分析法(MS)。優(yōu)選的MALDI分析試驗采用硅陣列。一種用于MALDI的陣列的例子是在氧化硅上的200μm環(huán)形凝膠墊，具有350μm的中心距。在凝膠墊之間的疏水表面(防水表面)為MALDI提供了更加聚焦的基質(zhì)/蛋白點，從而提高了定量信號。例如，采用Packard Bioscience system所產(chǎn)生的點，直徑可小于200μm。Piezo系統(tǒng)可以將大約300pL的MALDI基質(zhì)(例如，DHB，芥子酸)遞送至親和捕獲劑-肽點的確切位置，從而產(chǎn)生均一的肽/基質(zhì)晶體。在MALDI-MS(例如，Perseptive Voyager)中該晶體的解吸/電離(Karas等，Ion Processes，1987，v.78，pp.53-68或Zenobi等，Mass Spectrom.Rev.1998，v.17，pp.337-366)產(chǎn)生質(zhì)譜，其中肽峰的高度與包含該肽的蛋白質(zhì)的量相關。
一種可供選擇用于本發(fā)明的技術是毛細管電泳色譜，其可用于定量少量樣本中的分析物。
而且，定量生物化學技術，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜，以及類似技術都可單獨或結合起來使用，以檢測并定量樣本中PAMG-1的量。
檢測PAMG-1的免疫學方法和裝置本領域已知的檢測抗體與抗原的免疫特異性結合的各種方法都可用于檢測根據(jù)本發(fā)明的結合。一種涉及復合物分析的檢測抗原抗體相互作用的早期方法是通過凝膠中的沉淀進行的。對分析物-檢測抗體結合對的另一檢測方法包括利用放射性碘化的檢測抗體或與IgG有反應性的放射性碘化的蛋白質(zhì)，如蛋白A。這些早期的方法對本領域技術人員來說是公知的，如在Methods in Enzymology，1980，v.70，pp.166-198所綜述的。通過選擇可以產(chǎn)生高于這里所公開的PROM閾值的陽性結果的抗體和條件，可以在本發(fā)明的實施中采用這些技術。
后來的方法僅僅采用一種抗體來確定樣本中待分析物的存在，該方法包括競爭性結合試驗。在這一技術中，抗體(最常見地被固定在固相支持物上)暴露于懷疑包含分析物的樣本及已知數(shù)量的標記的分析物。隨后這兩種分析物，即標記的分析物和樣本中的分析物，競爭抗體上的結合位點。檢測游離的標記分析物或結合的標記分析物，由此從該檢測中得出樣本中競爭性分析物的數(shù)量。該方法的更完全的說明見于“抗原抗體反應的基本原則”，Elvin A.Labat，(Methods In Enzymology，70，3-70，1980)。在這一例子中，標記的分析物可采用放射性同位素或酶標記。
近來，免疫試驗利用雙抗體法來檢測分析物的存在。這些技術也可見于上述Methods In Enzymology中。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，每一標記物的存在分別通過采用針對待檢測的標記物的一對抗體來確定?？贵w對的其中之一在這里被作為“檢測抗體”而所述抗體對中的另一個被稱作“捕獲抗體”。因此，本發(fā)明的一個實施方案采用雙抗體夾心方法來檢測陰道液樣本中PAMG-1。在該方法中，分析物被夾在檢測抗體和捕獲抗體之間，捕獲抗體不可逆地固定在固相支持物上。檢測抗體帶有可檢測的標記，以便鑒定抗體-分析物三明治的存在，從而確定分析物的存在。
固相支持物的常規(guī)早期形式包括板，管或聚苯乙烯珠，所有這些在放射免疫和酶免疫試驗領域都是公知的。近來，許多多孔材料，例如尼龍、硝化纖維素、醋酸纖維素、玻璃纖維和其他多孔聚合物也用作固相支持物。
這樣，在一個特定實施方案中，本發(fā)明的裝置包括用于實施免疫色譜試驗的手段(“免疫色譜試驗裝置”)。該裝置包括用于引導液體的固相手段。如這里所用，術語“引導液體的固相手段”指的是允許液體遷移通過的固相支持物(例如，通過毛細作用)。具有這一性質(zhì)的典型產(chǎn)品是硝化纖維素膜，其能通過本領域已知的方法制備。
許多免疫色譜試驗手段和格式在本領域是已知的，并且能用于本發(fā)明的實施。在試條或流過裝置(flow-through device)中用膜作為固相支持物的免疫色譜分析試驗已充分建立，用于臨床實驗室或者用于替代的(即非實驗室)現(xiàn)場測試中。免疫色譜試驗裝置的常用形式是裝在塑料支架中的膜(纖維素的或非纖維素的)。塑料支架使膜保持合適的外形，以便確保整個裝置的正確功能。試驗裝置的基本結構有許多變體。例如，Litman等(美國專利US5156952和5030558)公開了用于確定樣本中極小量分析物存在的分析試驗方法和裝置。Ullman等(美國專利US5137808和4857453)公開了一種容納測試試驗膜的裝置，其中膜本身含有液體試劑以幫助樣本流動。Dafforn等(美國專利US4981768)公開了一種具有用于施加樣本和額外液體的窗口的裝置。Corti等(歐洲專利申請89118378.2)，Greenquist等(美國專利4806312)和Berger等(美國專利5114673)也公開了分析試驗裝置。
優(yōu)選地，免疫色譜試驗裝置包括指示試驗正確進行的對照。該對照可以是在固相支持物上位于比檢測區(qū)距樣本施加點更遠的點上的特異結合反應物，它在分析物存在或不存在的情況下與標記的試劑結合，從而指示可移動受體與液體樣本遷移了足夠的距離從而可以給出有意義的結果。
適合用于免疫色譜試驗的標記(label)包括酶、熒光團、發(fā)色團、放射性同位素、染料、膠體金、膠體碳、乳膠顆粒以及化學發(fā)光劑。在采用對照標志分子時，受體和對照標志分子可以使用相同或不同的標記。
本發(fā)明的一個實施方案采用流過型(Flow-through type)免疫試驗裝置。Valkirs等(美國專利4632901)公開了一種裝置，其包括對抗原分析物具特異性的抗體，其中該抗體結合于多孔膜或濾膜上，而將液體樣本加到該多孔膜或濾膜。當液體流過膜時，靶分析物與抗體結合。樣本加入后加入標記了的抗體。標記的抗體的可見檢測指示了樣本中存在靶分析物。
Kromer等公開了流過裝置的另一例子(EP-A0229359)，其描述了一種試劑遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括由分散在水溶性聚合物中的試劑或其成分所飽和的基質(zhì)，該聚合物用于控制試劑的溶解速率，以便將其遞送至位于該基質(zhì)之下的反應基質(zhì)。
在遷移型分析試驗中，固相支持物，例如膜，由進行試驗所需要的試劑浸透。提供分析物檢測區(qū)，在此標記的分析物被結合且讀取試驗結果。例如，見Tom等(美國專利4366241)以及Zuk(EP0143574A)。遷移試驗裝置通常含有與帶色標記物，例如膠體金或碳結合的試劑，從而允許試驗結果可視檢測而無需添加其它物質(zhì)。見例如，Bernstein(美國專利4770853)，May等(WO88/08534)，以及Ching等(EP0299428A)。所有這些已知的流過裝置均可用于本發(fā)明。
直接標記是可用于根據(jù)本發(fā)明的免疫色譜試驗的一個標記例子。直接標記被限定為在其自然狀態(tài)很容易被看見的(無論是裸眼還是通過濾光器)和/或施加刺激，例如U.V.光后可以促發(fā)熒光的實體?？捎糜诒景l(fā)明的帶色標記的例子包括金屬溶膠顆粒，例如，由Leuvering(US4313734)所公開的金溶膠顆粒；染料溶膠顆粒，如Gribnau等(US4373932)以及May等(WO88/08534)所公開的；染色乳膠，如May，上引文，Snyder(EP0280559A，0281327A)所公開的；或者如Campbell等所公開的(US4703017)包封在脂質(zhì)體中的染料。其他直接標記包括放射性核素，熒光部分或發(fā)光部分。除這些直接標記手段之外，包含酶的間接標記也可用于本發(fā)明中。各種類型的酶聯(lián)免疫試驗是本領域公知的，例如，堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶，溶菌酶，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，乳酸脫氫酶，尿素酶，這些和其它酶已由Eva Engvall在Enzyme Immunoassay ELISAand EMIT In Methods In Enzymology，70.419-439，1980和US4857453中詳細討論了。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明的診斷裝置包括具有靠近樣本引入點的檢測部分和位于該位置下游的捕獲部分的膜組裝物。檢測部分包含抗體(檢測抗體)，其將與存在于樣本中的任何本發(fā)明分析物反應。檢測抗體可逆固定于膜上且在使用時隨樣本遷移。優(yōu)選但并不必需的是檢測抗體被標記，例如采用放射性核素，酶，熒光部分，發(fā)光部分或者帶色標記物(例如現(xiàn)有技術中所公開并在以上討論的那些)進行標記。特別地，可以采用反應活性標記物，因而例如，抗體在捕獲抗原之前可出現(xiàn)金色而捕獲后將變成紫色。
如前所述，捕獲部分位于檢測部分的下游，包含捕獲抗體，該抗體不可逆的固定在固相支持物上，每一種抗體固定在捕獲部分的不同位置?？贵w和必需試劑采用本領域標準工藝固定在固相支持物上，如先前在流過型免疫試驗裝置中所述的那樣。一般地，通過非極性蛋白質(zhì)亞結構和非極性支持物基質(zhì)材料之間的疏水相互作用，抗體被吸附在固相支持物上。
本發(fā)明的免疫色譜試驗技術的一個具體優(yōu)點在于它克服了這類試驗中不能提供定量數(shù)據(jù)的缺點。這樣，捕獲部分可以包含固定的PAMG-1特異抗體的混合物，這樣僅僅在樣本中的PAMG-1量超過期望的檢測閾值時才產(chǎn)生信號。
此外，本發(fā)明考慮采用均相免疫試驗格式。這樣的競爭均相方法的一個例子是Rubenstein和Ullman的美國專利US3817837，其公開了一種技術，其中配體和與酶結合的配體競爭抗體結合位點。由于抗體與酶結合的配體的結合改變了其酶學活性，故存在的配體的濃度可以通過檢測混合物轉換底物為產(chǎn)物的速率來評估。這樣，在均相方法中，可檢測的標記物的特性將根據(jù)結合與否而在本質(zhì)上是不同的。在它的結合狀態(tài)，標記物將具有更大或更小信號強度。通常，抗體與標記的配體的結合導致信號強度下降，例如，當采用酶標記時。這一種類的典型產(chǎn)品包括Syva Company的EMIT酶免疫試驗系統(tǒng)和Abbott Diagnostics的TDX熒光偏振免疫試驗系統(tǒng)。一個特定的均相試驗可以通過將所有分析物布置于珠子上來制備，在此情況下將樣本導入，珠子隨后離心沉降并檢測之。
可以用于本發(fā)明的其他生物診斷裝置包括G.Grenner，P.B.Diagnostics Systems，Inc.，在美國專利US4906439和US4918025中所公開的裝置。Grenner的US4906439中的裝置包括診斷測試元件和帶有流體遞送元件的樣本加樣單元，流體遞送元件的特征在于其具有一個上帶有將樣本遞送至測試元件的多個溝槽的層。Grenner的US4918025涉及一種包括樣本導入手段的裝置，該手段是例如膜，其鄰近包含固定的試劑的毛細管和廢液池。樣本沉積后固定試劑從毛細管中釋放以完成反應，而過量的液體被廢液池保存，因而該裝置是自容納的。
雖然用膜檢測是優(yōu)選的，但可以理解的是也可以以上述相似的方式采用其他技術和相應傳感裝置。目前可獲得幾種類型的自動檢測試驗裝置，其能同時進行多個樣本的分析。這些自動試驗裝置包括連續(xù)/隨機訪問試驗裝置。其例子包括PB Diagnostic System Inc.的OPUSTM，以及由AbbottLaboratories of North Chicago，III.在1988年介紹的IMXTM。通常，待測流體的樣本典型地在樣本杯中提供，并且所有處理步驟自動完成，包括將樣本吸入分析試驗元件，孵育和讀取所獲信號。自動試驗系統(tǒng)一般包括一系列工作站，每個完成檢測程序中的一個步驟。試驗元件可通過各種手段由一個工作站轉移至下一個工作站，所述手段為例如傳送帶或可移動的齒條，以保證檢測步驟按順序完成。這些試驗元件還可包括儲液池用以儲存試劑、混合流體、稀釋樣本等。試驗元件還包括開口，以允許將預定量樣本液，以及如果必要，任何其它必需試劑施加至多孔膜上。樣本元件也可以包括窗口，以允許讀取作為處理步驟結果而獲得的信號，信號典型的是多孔膜上存在的試劑的熒光或比色變化，信號讀取可以例如通過光譜儀或熒光計(這些都包括在分析試驗系統(tǒng)之內(nèi))進行。PB Diagnostic System Inc.的自動分析試驗儀器在美國專利US5051237，5138868，5141871和5147609中公開。
可用于本發(fā)明的其他種類的免疫化學分析儀系統(tǒng)是生物傳感器或光學免疫傳感器系統(tǒng)。通常，光學生物傳感器是利用光學原理定量地將感興趣的化學或生物化學濃度或活性轉換成電信號的裝置。這些系統(tǒng)可分為四個主要類型反射技術；表面等離子共振；光纖技術和集成光學裝置。反射技術包括橢圓光度法，多重合成反射光譜儀(multiple integral reflectionspectroscopy)，以及熒光毛細填充裝置(fluorescent capillary fill device)。光纖技術包括漸逝場熒光，光纖毛細管，以及光纖熒光傳感器。集成光學裝置包括平面漸逝場熒光，輸入分級耦合免疫傳感器，Mach-Zehnder干涉儀，Hartman干涉儀和微分干涉儀傳感器。結合反應的全息檢測通過在結合對的一個反應物結合至結合對中固定的第二反應物時，檢測在預定成像位置所產(chǎn)生的全息圖像的存在而得以完成(見美國專利US5352582，Lichtenmalter等1994.10.4授予)。光學免疫傳感器的例子由G.A.Robins(生物傳感器進展)，在Vol.1，pp.229-256，1991中的綜述文章里一般描述。這些裝置的更多的具體描述可見于美國專利US4810658，4978503，5186897；R.A.Brady等(Phil.Trans.R.Soc.Land.B316，143-160，1987)以及G.A.Robinson等(Sensors and Actuators。Elsevier，1992)。
本發(fā)明的方法和相關試劑盒可以與多種光學測量系統(tǒng)結合并應用于其中。特別地，當本發(fā)明的試劑盒和材料可以以免疫檢測試驗形式實施時，這樣的形式本身能夠體現(xiàn)在各種光電測量系統(tǒng)中。更特別的是，可以應用在本發(fā)明中的各種光學免疫傳感器技術是已知的。因此，例如，裝置和技術例如反射技術，表面等離子共振，光纖波導技術和集成光學裝置，均可以被采用并具體地配置以根據(jù)本發(fā)明方法檢測并顯示患者生物樣本的檢查結果。特定的反射技術，例如反射計和橢圓光度法，以及光纖的具體應用，光波導，熒光毛細填充裝置和集成光學生物傳感器是可用的多種裝置和儀器中的少數(shù)幾種。這些裝置的綜述見于Robinson，G.A.，OpticalImmunosensorsAn Overview，Advances In Biosensors，Vol.1，pp.229-256(1991)。
更具體地，橢圓光度法基于偏振光束的方向首先朝向參比表面(標準)隨后朝向樣本表面，然后可以將反射結果的特性及程度進行對比。具體地，分析物與受體的結合可以以該表面相對于參比表面的厚度來檢測。
對于多重內(nèi)反射光譜學，例如，配體和其受體可以被共價固定在平的溶凝石英波導器的光學表面上，其后光束可以在波導管內(nèi)被內(nèi)部反射并且透入鄰近波導器的溶液中，這樣可以測量在標準和樣本之間的折射差異。在該特定方式中，可結合熒光標記并測定所產(chǎn)生的熒光來確定存在的結合程度。
另一可采用的技術被稱為熒光毛細填充裝置。在該特定技術中，利用了兩塊分開毛細管大小間距的玻璃板。受體分子可以被固定在基板上，其也充當光波導器?？衫肍ITC標記進行競爭性或夾心試驗，誘導的熒光與來自結合源(相對地來自未結合源)的信號耦合到波導器中。該信號通過其離開波導器時的角偏向而被區(qū)分。還制備了表面等離子體共振(SPR)裝置，其工作基礎是入射到金屬薄膜上的光耦合到與金屬薄膜中的集成電子振蕩(collective electron oscillation)相關的表面模式中。共振條件取決于金屬膜的光學特性，其厚度，其任一面上的電介質(zhì)的折射指數(shù)，以及光入射角度。受體分子結合于金屬膜的頂面，而在膜的底面用光照射，例如通過棱鏡基底。靶分析物在結合至這些受體上時，將引起共振條件的變化，因為它造成了局部折射率的變化。隨金屬膜表面上光束入射角度的變化，通過監(jiān)控反射光強度來觀察共振。共振角度的變化與結合的分析物的量直接相關。
涉及光纖系統(tǒng)的技術包括漸逝場(evanescent field)熒光。在該例子中，將光纖末端的覆蓋層去除，這樣就產(chǎn)生了瞬逝地與周圍介質(zhì)相互作用的傳感器元件。受體分子結合于暴露的光纖表面，可通過利用受體和綴合蛋白的天然熒光直接進行檢測。競爭性或夾心試驗可利用FITC標記進行以獲得更高的靈敏度。在操作中，光波被耦合至纖維中，而部分瞬逝產(chǎn)生的熒光被耦合回纖維中并被傳播回檢測器。
另一利用光纖技術學的技術涉及光纖毛細管，其中裸露光纖被包繞在圓柱形填充腔中，形成一個傳感器元件，其與緊緊圍繞著纖維的填充體積部分發(fā)生瞬逝相互作用。受體分子可以結合至裸露的纖維表面，并且可以進行夾心或競爭性置換試驗。光波被耦合入纖維中，而部分瞬逝誘導的熒光被耦合回纖維中并被傳播回檢測器。來自靶分析物的信號通過其離開纖維的角偏向而從背景源中區(qū)別出來。其他利用上述某些相同原理的纖維光學技術，例如光纖熒光也可以用于本發(fā)明。
其他光子技術，例如干涉測量術包括具有例如兩個通道的薄膜波導器的配置，在第一個通道上可固定受體分子，而第二個通道被遮蔽以提供參照通道。例如，激光可以被耦合至波導器中并且分成兩條通路，這樣折射率和覆蓋物厚度的變化可以通過光束的相轉變結果來檢測，而光束的相轉變轉而又與結合的分析物的量相關聯(lián)。該方法的一種變形是采用Hartman干涉儀，在其中提供的是單通道多模薄膜平面波導器。受體分子可以固定在該通道上，而激光可以耦合入波導器中，這樣兩個模態(tài)沿通道傳播。多模幾何光學是這樣的，即較高等級模態(tài)具有大的漸逝場，從而提供信號機制，而較低級別模態(tài)實際上不存在漸逝場，從而提供參考機制。與靶分析物的結合將導致通道上方覆蓋層厚度和折射率的變化，其可以通過較高等級模態(tài)的漸逝場(導致該模態(tài)的相轉變)來檢測。由于較低等級模態(tài)或參考模態(tài)不發(fā)生這樣的變化，就不會產(chǎn)生相轉變，因而在信號和參考光束之間的測量差異能相關地確定結合的分析物的量。
雖然上述說明介紹了一般概念和一些細節(jié)，但是現(xiàn)有的各種光學傳感器技術都可用于實現(xiàn)本發(fā)明?？梢岳斫?，上述描述并不是窮盡或限制性的，而是可采用各種現(xiàn)有技術，只要其可成功地檢測結合的差別，并進而確定感興趣的相應標記物或分析物的存在和量即可。當然，如上所強調(diào)的，無論采用什么技術，本發(fā)明包括同時檢測和測量至少三種分析物。
檢測PAMG-1的免疫色譜方法下面將描述根據(jù)本發(fā)明檢測PAMG-1的方法的實施方案。
在檢測方法的一個實施方案中，樣本中PAMG-1的檢測通過包含PAMG-1的樣本與根據(jù)本發(fā)明的免疫測定系統(tǒng)接觸以形成抗體-PAMG-1復合物來進行。然后，檢測抗體-PAMG-1復合物。在這一實施方案的一個變形中，抗體帶有可檢測的標記，檢測抗體-PAMG-1復合物的步驟包括檢測可檢測的標記。
在該方法的另一實施方案中，樣本中PAMG-1的檢測通過將樣本與具有PAMG-1高結合親和力的抗體(如M271，以下示例)接觸，從而形成抗體M271-PAMG-1復合物來完成。該復合物然后與固定的第二抗體(例如，M52)接觸。第二抗體與第一抗體在免疫學上是不同的，并且不發(fā)生交叉反應，因而這些抗體能同時結合至PAMG-1分子。固定的抗體結合至遷移的抗體-PAMG-1復合物上以形成固定的抗體-PAMG-1抗體復合物。PAMG-1通過檢測該異三聚體復合物而得以檢測。如上所述，具有PAMG-1高特異性的抗體優(yōu)選用于PAMG-1的起始識別。
當上述方法中以可檢測標記物標記了所選擇抗體對中的一個抗體時，該方法的變體包括將樣本在與第二固定的抗體接觸之前，先與標記的第一抗體接觸。在這一變體方案中，標記的抗體用于結合樣本中的PAMG-1。該方法的另一實施方案包括以下步驟向多孔材料的可移動標記抗體區(qū)加入包含PAMG-1的流體樣本，該多孔材料允許抗體和蛋白質(zhì)在其中遷移，該抗體區(qū)包括具有PAMG-1高特異性的可移動抗體，從而抗體與PAMG-1結合形成抗體PAMG-1復合物；復合物遷移至固定有第二抗體的測試區(qū)，該第二抗體具有PAMG-1結合親和力，從而使第二抗體與標記抗體-PAMG-1復合物結合，形成固定的復合物；在測試區(qū)檢測固定的復合物。
該方法的另一實施方案是標準的夾心試驗，其中未標記的抗體被固定在任何表面上。加入包含PAMG-1的流體樣本導致固定的抗體與PAMG-1結合形成抗體PAMG-1復合物。加入標記的抗體，形成由固定抗體-PAMG-1-標記抗體形成的固定復合物，并檢測該復合物。
根據(jù)上述方法，抗體可包括可檢測標記物或標記，而檢測抗體-PAMG-1或PAMG-1-抗體復合物的步驟包括檢測此可檢測標記物或標記?？捎玫目蓹z測標記物的例子包括染色的顆粒，酶，染料和放射性同位素。在一個特定實施方案中，可檢測標記物是金染色顆粒，例如，具有平均大小為大約20nm至30nm的顆粒。在另一實施方案中，可檢測標記物是辣根過氧化物酶。
檢測PAMG-1的裝置示例可以提出各種裝置用于檢測樣本中的PAMG-1蛋白。用于檢測PAMG-1的本發(fā)明裝置的一個具體實施方案如圖1-2所示。根據(jù)本發(fā)明的裝置優(yōu)選能檢測具有大約5ng/ml至50μg/ml PAMG-1的樣本中的PAMG-1。也優(yōu)選裝置的檢測閾值為大約5-7ng/ml。PAMG-1背景濃度與檢測裝置靈敏度閾值之間的差距越大，假陽性的可能性就越低。在本節(jié)中，根據(jù)本發(fā)明的不同的可能裝置實施方案體現(xiàn)在圖1，2中所示的裝置上。要注意的是該裝置可以設計為用于簡單地檢測陰道分泌物樣本中PAMG-1的存在。
這里所用的術語“大約”指的是本領域普通技術人員測定的具體值的可接受誤差范圍，其部分取決于該值是如何被測量或確定的，即，測量系統(tǒng)的局限性。例如，“大約”可以是按本領域的實踐在1個或1個以上標準差范圍內(nèi)。作為選擇，“大約”可以是不超過給定值的20％的范圍，優(yōu)選不超過10％，更優(yōu)選不超過5％，更優(yōu)選不超過給定值的1％。作為選擇，具體到特定的生物系統(tǒng)或方法，該術語可以指一個值的數(shù)量級范圍之內(nèi)，優(yōu)選5倍之內(nèi)，更優(yōu)選2倍之內(nèi)。當具體的值在說明書和權利要求書中予以描述時，除非另行指明，應理解術語“大約”指的是該具體值的可接受誤差范圍。
本發(fā)明裝置的詳述為了舉例說明，本說明涉及以下例舉的單克隆抗體。然而，不一定必須采用這些特異性單克隆抗體。如圖1和2所示，該裝置包括由幾個順序互連的元件構成的條狀體。更具體地，裝置的部件12包括襯墊，在其上包含M271抗體區(qū)10，其中M271抗體為被標記的抗體，例如，通過染色的顆粒SP標記(圖中未示出)。襯墊12可以由玻璃纖維紙或任何其他多孔并且允許各種樣本顆粒及物質(zhì)在其中遷移通過的材料制成。染色的顆粒可以包括具有平均大小20至30nm的金顆粒。M271抗體區(qū)還包含由同樣染色顆粒標記的小鼠IgG免疫球蛋白。通過采用標記的M271抗體和標記的小鼠IgG免疫球蛋白的溶液浸漬襯墊12，將標記的M271抗體和鼠IgG免疫球蛋白引入襯墊12的帶狀部分10。M271抗體和小鼠IgG免疫球蛋白的溶液可以采用繪圖筆(drawing pen)或微滴形成裝置引入硝化纖維膜22中。硝化纖維膜22連接于襯墊12縱向方向上的一端，其包含測試區(qū)14和對照區(qū)16。測試區(qū)14和對照區(qū)16都橫向排列在裝置的整個寬度上。測試區(qū)14是硝化纖維膜22的帶狀部分。測試區(qū)14包含附著于硝化纖維膜22的M52抗體。對照區(qū)16包含附著于硝化纖維膜22的抗小鼠免疫球蛋白抗體。對照區(qū)16橫跨測試條22的整個寬度。將濾紙膜24連接在硝化纖維膜22上位于該硝化纖維膜22與襯墊12連接端的相對另一端。濾紙膜24縱向連接于硝化纖維條22的該端。裝置的表面覆蓋特異性保護膜28和30，例如，特意設計用于試條裝置的薄膠帶。膜28表面上繪有箭頭18以顯示襯墊12的樣本加樣端。襯墊12、硝化纖維膜22和濾紙條24被附著在粘性的剛性塑料基底26上。
圖1，2的說明10-M271抗體區(qū)；12-襯墊；14-測試區(qū)；16-對照區(qū)；18-箭頭；22-硝化纖維膜；24-濾紙膜；26-粘性的剛性塑料基底；28-帶箭頭的部分透明的保護膜；30-不透明保護膜。
本發(fā)明裝置的優(yōu)選實施方案在本部分所描述的實施方案中，該裝置包括一個由允許抗體和蛋白質(zhì)遷移通過的多孔樣本加樣基質(zhì)形成的M271抗體襯墊區(qū)10。M271抗體區(qū)10包括M271抗體，其能高度特異的與PAMG-1結合。將包含PAMG-1的流體樣本引入M271抗體區(qū)，導致M271抗體與PAMG-1結合形成抗體M271-PAMG-1復合物。該裝置還包括測試區(qū)14，其與M271抗體區(qū)流體連結，由允許抗體和蛋白質(zhì)在其中遷移通過的多孔材料形成。測試區(qū)14包括固定在測試區(qū)14中的M52抗體，該抗體也能與PAMG-1結合。M52抗體與M271抗體在免疫學上是不同的，從而M271和M52抗體可同時與PAMG-1結合。將流體樣本引入M271抗體區(qū)10，導致抗體M271-PAMG-1復合物遷移到測試區(qū)14，在這里抗體M271-PAMG-1復合物與M52抗體結合，并通過M52抗體固定在測試區(qū)。該裝置基于固定在測試區(qū)14中的M52抗體的存在檢測樣本中的PAMG-1。根據(jù)該實施方案，兩種抗體都是根據(jù)本發(fā)明的抗體。以上所述的抗體對的選擇過程可以由任何本領域技術人員重復進行。作為結果，僅僅PAMG-1形成抗體M271-PAMG-1-M52抗體復合物，該復合物被固定在測試區(qū)14中。這樣固定在測試區(qū)14中的M52抗體的存在指示著樣本中PAMG-1的存在。
在該裝置的這一實施方案中，M271抗體與可檢測標記結合，該標記用于檢測固定在測試區(qū)14中的PAMG-1?？梢允褂玫目蓹z測標記的例子包括但不限于，染色的顆粒，酶，染料，熒光染料，以及放射性同位素。在一個實施方案中，可檢測標記是平均大小為大約20-30nm的金顆粒。在一個實施方案中，M271抗體是凍干狀態(tài)的標記抗體。
在該實施方案的一個變體中，在M271抗體襯墊區(qū)的M271抗體采用可檢測標記物標記，該裝置還包括測試區(qū)，其包含M52抗體。襯墊區(qū)和測試區(qū)為流體連接。
在該裝置的另一實施方案中(也體現(xiàn)在圖1-2所示的裝置中)，該裝置具有帶近端和遠端的條狀體。條狀體的M271抗體區(qū)10由允許抗體和蛋白質(zhì)在其上遷移通過的材料制成。條狀體的M271抗體區(qū)10包括M271抗體，其具有PAMG-1高度特異結合親和力，將包含PAMG-1的流體樣本引入M271抗體襯墊區(qū)，結果M271抗體與PAMG-1結合形成抗體M271-PAMG-1復合物。
條狀體還包括測試區(qū)14，其鄰近M271抗體區(qū)10并且與M271抗體區(qū)10通過流體連接。測試區(qū)14由允許抗體和蛋白質(zhì)在其上遷移通過的材料形成。測試區(qū)14包括固定于其上的M52抗體，該抗體具有PAMG-1結合親和力，將流體樣本引入M271抗體區(qū)10導致抗體M271-PAMG-1復合物遷移至測試區(qū)14，在那里抗體M271-PAMG-1復合物與M52抗體結合并通過M52抗體固定在測試區(qū)14中。測試區(qū)還包括固定在測試區(qū)14中的M42抗體和M52抗體。未標記的M52和M42抗體組合起來允許對本發(fā)明試條裝置的靈敏度閾值進行微調(diào)(實施例11)。該裝置基于在測試區(qū)14中固定標記抗體M271-PAMG-1復合物來檢測樣本中的PAMG-1。
對照區(qū)。本發(fā)明的裝置包括一個標準對照區(qū)16(FIGS1-2)。該對照區(qū)用于驗證裝置的正確運行。然而，要注意的是，任何可選擇的對照區(qū)設計均可用于本發(fā)明的裝置。
帶有一個對照區(qū)的裝置包括由允許抗體和蛋白質(zhì)在其上遷移的材料形成的M271抗體區(qū)10，M271抗體區(qū)10包括沒有固定在其中的標記的M271抗體，該抗體具有PAMG-1高度特異性，將包含PAMG-1的流體樣本引入M271抗體襯墊區(qū)10中，結果M271抗體與PAMG-1結合形成抗體M271-PAMG-1復合物。該裝置還包括與M271抗體區(qū)10流體連接的測試區(qū)14，其由允許抗體和蛋白在其上遷移的材料形成。測試區(qū)14還包括固定在測試區(qū)14中的M52抗體，其具有PAMG-1結合親和力。M52抗體與M271抗體具有不同的免疫學，這樣M271和M52抗體能同時與PAMG-1結合。將流體樣本引入M271抗體區(qū)10，導致抗體M271-PAMG-1復合物遷移入測試區(qū)14，在其中抗體M271-PAMG-1復合物與M52抗體結合并通過M52抗體固定在測試區(qū)14中。該裝置基于在測試區(qū)14中固定標記的M271抗體來檢測樣本中的PAMG-1。當樣本中存在的PAMG-1濃度低時，至少一些標記的M271抗體從M271抗體區(qū)10遷移經(jīng)過測試區(qū)14到達對照區(qū)16?？剐∈罂姑庖咔虻鞍卓贵w固定在對照區(qū)16中?？姑庖咔虻鞍卓贵w與標記的M271抗體結合從而使對照區(qū)染色。如果樣本中存在高濃度的PAMG-1，則僅僅有少量的標記M271抗體能夠到達對照區(qū)16，這樣對照區(qū)的著色可能太淺，以致無法以裸眼觀察。為了避免這種可能性，將標記的小鼠IgG免疫球蛋白加入M271抗體區(qū)10。此免疫球蛋白不與PAMG-1結合，并且自由經(jīng)過M52抗體測試區(qū)14而遷移至對照區(qū)16，在那里其與抗小鼠抗球蛋白抗體結合并且使對照區(qū)16著色。對照區(qū)驗證裝置是否能發(fā)揮正常功能，而無須考慮樣本中PAMG-1的濃度。
而本發(fā)明裝置的另一組件是與測試區(qū)材料緊密孔隙連接的多孔材料。裝置的這一部件作為泵起作用，幫助液體、蛋白質(zhì)和抗體在裝置上移動?？捎糜跇擞浶∈罂贵w和IgG免疫球蛋白的可檢測標記物的例子包括但不限于染色的顆粒，酶，染料和放射性同位素。在一個實施方案中，可檢測標記是熒光染料。而在另一實施方案中，可檢測標記是染色的顆粒。在一個實施方案中，M271抗體為標記的抗體，其與標記的小鼠免疫球蛋白IgG處于凍干狀態(tài)。
用于上述裝置各種區(qū)域的材料可以是任何允許抗體和蛋白在其上遷移的材料的組合。合適材料的例子包括但不限于玻璃纖維、多孔塑料、硝化纖維以及濾紙。
裝置的各部件可以以任何功能性組合方式進行定位，只要在本發(fā)明的裝置的任何實施方案中，存在所選擇的抗體對能檢測孕婦陰道分泌物中最低背景濃度的PAMG-1即可。
本發(fā)明的裝置可以任選地包括覆蓋裝置的至少一部分的保護性膜。它可以是透明或不透明的，在其表面上可以具有必要的商標、信息標記/標識或箭頭。
檢測胎膜破裂在胎膜沒有破裂時，存在于羊水中的PAMG-1濃度大約至少比孕婦血清中的濃度高100倍，而比孕婦陰道分泌物中的濃度高大約至少3000倍。作為結果，即使在陰道分泌物樣本中溶解小量的羊水(大約每1ml陰道分泌物1/100之一滴)，也有足夠數(shù)量PAMG-1存在于該陰道分泌物中來指示胎膜發(fā)生了破裂。進而，因為血清中PAMG-1的濃度低，樣本中血清的不明顯混入(10-15％)不會對本發(fā)明的裝置和方法產(chǎn)生的結果形成影響。
因為陰道分泌物中羊水的存在指示胎膜破裂，故在陰道分泌物中檢測PAMG-1也能用于檢測胎膜破裂。
根據(jù)本發(fā)明檢測羊水中PAMG-1的方法是高度靈敏的。例如，可檢測濃度為0.05ng/ml的PAMG-1(實施例6，7)。因為血清中PAMG-1的最大濃度為大約25ng/ml，而與之相比羊水中的最小濃度為大約1680ng/ml，并且因為陰道分泌物中PAMG-1的背景濃度非常低，大約為0.2ng/ml，故本發(fā)明的方法中可以采用較低的PAMG-1閾值水平，以檢測陰道中羊水的存在。在本發(fā)明中通過采用較低的檢測閾值，可避免大多數(shù)錯誤結果。
本發(fā)明的裝置和方法的設計在于通過采用對PAMG-1具有高度特異性和靈敏性的抗體對來避免錯誤結果。此外，本發(fā)明的裝置的靈敏度閾值可以準確設定在接近5-7ng/ml的預定水平。
作為結果，本發(fā)明的裝置和方法不會被陰道炎或其他會對現(xiàn)有用于檢測胎膜破裂的方法的準確性產(chǎn)生負面影響的因素所影響。PAMG-1在炎癥分泌物中的最大濃度為3ng/ml(實施例8，表10，11)。如果血清混入陰道分泌物中不超過10-15％，會產(chǎn)生同樣濃度的PAMG-1。此外，血清與羊水中PAMG-1濃度的巨大比率使得本發(fā)明的方法和裝置即使采用低PAMG-1檢測閾值，也不太可能由于陰道分泌物中存在血清而產(chǎn)生假陽性結果。如這里所述，該裝置和方法可很容易地以便捷的方式使用，因而它能夠用于門診病人。例如，該方法可以與能夠由沒有經(jīng)驗或經(jīng)驗很少的患者操作的易用裝置配合使用。使用該裝置無需特定的時間，也無需為了使用該裝置而在檢測前對樣本濃度進行稀釋或調(diào)配。這使得該方法和裝置高度可靠并且不容易出現(xiàn)操作錯誤。該方法還可以被設計成簡單地以有/無方式確定樣本中PAMG-1的存在以及陰道中羊水的存在。
本發(fā)明提供了基于孕婦陰道分泌物中PAMG-1的存在來檢測胎膜破裂的方法和裝置。相應地，本發(fā)明用于檢測胎膜破裂的方法簡單地包括在陰道分泌物中檢測PAMG-1的步驟，陰道分泌物中PAMG-1的存在指示胎膜破裂的發(fā)生。本發(fā)明的關鍵部分是逐步選擇可以檢測孕婦陰道分泌物中極低背景濃度的蛋白PAMG-1的抗體對?？梢灶A見陰道分泌物中存在低濃度的PAMG-1，因為毛細管壁對血液蛋白的通透性取決于蛋白的翻譯后修飾以及它們與其它分子的相互作用(Marinaro J.A.等，“O-糖基化延遲了人IGF結合蛋白-6從循環(huán)中清除”，European Journal of Endocrinology，2000年5月，Vol.142(5)，p.512；Schneeberger E.E.，“蛋白和小泡在毛細管內(nèi)皮中的運輸”，F(xiàn)ed.Proc.，1983年5月，Vol.42(8)，pp.2419-24；MinshallR.D.等，“小泡在內(nèi)皮細胞中的形成和運輸以及內(nèi)皮屏障功能的調(diào)節(jié)”，Histochem.Cell Biol.2002年2月，Vol.117(2)，pp.105-12；Del Vecchio P.J.等，“內(nèi)皮單層對大分子的通透性”，F(xiàn)ed Proc 1987年6月，Vol.46(8)，pp.2511-2515；Siflinger Birnboim A等，“內(nèi)皮單層的選擇性對通透性增加的影響”，Microvascular Research 1998年11月，Vol.36(3)，pp.216-227；Ghinea N.，Milgrom，E.A.，“LH/CG受體的新功能在靶器官中激素跨內(nèi)皮屏障的胞轉作用”，Semin.Reproduct.Med.，2001，Vol.19(1)，pp.97-101)。進行了翻譯后修飾或與其它分子建立非共價鍵的PAMG-1應該是最少滲入陰道分泌物中的分子。這樣的分子在陰道分泌物中的濃度應該很低。不同分子滲透性的低或高取決于毛細管壁的選擇通透性和選擇分泌過程。因為已知孕婦陰道分泌物中羊水的存在能指示胎膜破裂，因此陰道分泌物中PAMG-1的檢測也能用于檢測胎膜破裂的存在。用于檢測陰道分泌物中PAMG-1的方法和裝置的例子包括這里更詳細描述的方法和裝置。在此也更詳細的描述了進一步包括基于檢測陰道分泌物樣本中PAMG-1而檢測胎膜破裂的步驟的方法。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明檢測胎膜破裂的方法和裝置是高度特異、靈敏及準確的。靈敏度和準確性的原因在于孕婦陰道分泌物中PAMG-1的低背景濃度和高得多的本發(fā)明裝置預設的靈敏度閾值之間存在很寬的差距，而該閾值又低于由胎膜破裂造成羊水滲漏入陰道時陰道分泌物中PAMG-1的典型濃度。而閾值的準確設定又通過在測試區(qū)14中采用至少一種或多種抗PAMG-1的附加抗體來精確建立本發(fā)明裝置的預定閾值靈敏度而實現(xiàn)(實施例9)。相應地，本發(fā)明的裝置和方法的設計通過采用高度特異性抗體對M271和M52以及至少一種附加抗體M42，避免了產(chǎn)生假陰性和陽性結果。結果，方法和裝置的準確性不受陰道感染或可以降低檢測胎膜破裂的現(xiàn)有技術方法的準確性的某些其它因素影響。本發(fā)明用于檢測懷孕婦女陰道分泌物中PAMG-1的優(yōu)選裝置和方法也被設計成易于方便而快捷地使用，這樣可以將本發(fā)明裝置用于門診病人。例如，本方法可以與能夠由對裝置沒有經(jīng)驗或經(jīng)驗很少的患者操作的易用裝置配合使用。使用該裝置無需特定的時間，也無需在檢測前對樣本濃度進行稀釋或調(diào)配。這使得本發(fā)明用于檢測胎膜破裂的方法和裝置高度可靠并且不容易受操作錯誤的影響。本發(fā)明裝置的臨床試驗結果見實施例10。在陰道炎時陰道分泌物中PAMG-1濃度的測量結果見實施例8?？蓮膶嵤├?中看到炎癥分泌物中觀察到的PAMG-1最大濃度接近3ng/ml。
實施例以下實施例進一步詳細描述了PAMG-1從羊水中的分離，抗PAMG-1抗體對的選擇，該抗體特異性的研究，以及在陰道炎的炎癥分泌物中PAMG-1的濃度。這些實施例用來說明本發(fā)明的某些方面，并不是用來限定本發(fā)明的范圍。
實施例1在血液和羊水中的PAMG-1濃度通過采用如實施例3所述產(chǎn)生的單克隆抗體對以ELISA方法，檢測了未孕婦女、孕婦(妊娠37-40周)的血清中及羊水中(妊娠39-40周)的PAMG-1濃度。
抗體M1，M271，M152，和M392在pH為9.5的0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中于6℃經(jīng)18小時吸附于聚苯乙烯板上(每孔100μl抗體溶液)。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的pH7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)，每孔200μl，37℃溫育一小時，以去除聚苯乙烯上的非特異性吸附。
100ul PAMG-1抗原以50，25，12，6，3，1.5和0.7ng/ml的濃度加到每個孔中。血清或羊水樣本用含有0.01％BSA和0.05％Twin 20的PBS緩沖液稀釋。將稀釋后的樣本加入孔中，37℃溫育一小時。反應通過鄰苯二胺在0.05M檸檬酸磷酸緩沖液(pH4.7)中的溶液進行顯色，其中37℃溫育20分鐘。在492nm波長處讀取光密度。
查出第一層中抗體的濃度和綴合物的濃度，從而建立PAMG-1的標準光密度曲線，其具有最大斜率約45°(提高一個光學單位對應于樣本中PAMG-1濃度提高1ng/ml)、1.5光學單位的上限(對于PAMG-1濃度，50ng/ml)和零濃度點不超出0.1光學單位。研究的樣本(血清，羊水，陰道和宮頸分泌物)凍存于-40℃。每個樣本檢測三次。血清稀釋至原濃度的1/5。羊水樣本稀釋至原濃度的1/2000。如果樣本具有超過1.5單位的光密度，將其進一步稀釋并再次檢測。
所獲得的數(shù)據(jù)概括于下表1-3。
表1未孕婦女血清中PAMG-1的濃度(ng/ml)

表2孕婦(妊娠37-40周)血清中PAMG-1的濃度(ng/ml)

表3(妊娠39-40周)羊水中PAMG-1的濃度(ng/ml)

實施例2PAMG-1的分離D.Petrunin在1980年提出了PAMG-1分離的改進方法(Petrunin，D.D.，Kozlyaeve，G.A.，Tatarinov，Yu.S.，Shevchenko，O.P.，Bulletin ofExperimental Biology and Medicine，No5，p.558，1980(俄語))。方案的步驟概括于下表4表4PAMG-1的分離步驟

將PAMG-1從妊娠16-25周的羊水中分離。羊水從醫(yī)學原因導致懷孕終止的婦女中獲得。我們以體積比20∶1在羊水中加入10％氯化鑭溶液(使其終濃度為0.5％)并且在4℃中保持18個小時。沉淀形成并8000rpm離心30分鐘進行分離。在Na2HPO4飽和溶液中溶解沉淀，并且在8000rpm離心30分鐘以分離在該過程中產(chǎn)生的不溶性鑭系鹽沉淀。所獲溶液用50％飽和度的硫酸銨4℃溫育18個小時進行分級分離，將所得沉淀溶解在蒸餾水中，兩種情況下均將溶解的沉淀級分的體積恢復至羊水的起始體積。然后，我們用60％飽和度硫酸鋰沉淀溶液，之后用少量的蒸餾水溶解沉淀。透析后，我們通過添加等體積吸濕劑至蛋白溶液中，混合并孵育10-15分鐘，用焦磷酸鈣吸附混合物，然后通過離心分離吸濕劑。
實施例3本發(fā)明穩(wěn)定雜交系的建立雜交瘤實驗1。采用取自5只BALB/c小鼠腘淋巴結的淋巴細胞。小鼠通過在爪墊中5次注射PAMG-1而免疫。每次注射比例為1∶1的100μgPAMG-1和弗氏完全佐劑。在細胞融合之后，將細胞接種于1152孔中?？偣?63株原代雜交瘤被檢測，其中38株為PAMG-1陽性。然后，通過研究與育性-α-2-微球蛋白(fertilityα-2-microglobulin)，人絨毛膜促性腺激素，滋養(yǎng)層β-1-糖蛋白，人胎盤催乳激素，α-胎蛋白，以及人血清白蛋白的交叉反應性結合而檢測單克隆抗體的特異性。選擇了14株原代雜交瘤，其單克隆抗體與其它蛋白沒有交叉反應。然后，采用有限稀釋法將原代PAMG-1特異性雜交瘤克隆兩次。最后，選擇出5個克隆，它們是單克隆抗體M1、M38、M42、M52、M91的明顯最穩(wěn)定的高產(chǎn)生產(chǎn)者。
雜交瘤實驗2。采用來自5只小鼠的脾淋巴細胞。小鼠通過在腹膜內(nèi)5次注射100ug PAMG-1而免疫。每次注射比例為1∶1的PAMG-1和弗氏完全佐劑。接種了1344孔并且檢測了562株雜交瘤。在其中，45株呈PAMG-1陽性，19株不與其它蛋白發(fā)生交叉反應，即是PAMG-1特異的。將無交叉反應的雜交瘤克隆兩次，并且其中6個克隆被證明是單克隆抗體M122、M152、M211、M271、M371和M392的最穩(wěn)定多產(chǎn)者，將其選擇出來待用。
因而，產(chǎn)生了11個抗PAMG-1的單克隆抗體，然后，從這些抗體選擇抗體對來檢測孕婦陰道分泌物中最低背景濃度的PAMG-1，如實施例4所述。
根據(jù)本發(fā)明的特異細胞系抗體M271和M52分別通過雜交瘤細胞系M271和M52生產(chǎn)，產(chǎn)生單克隆抗體的細胞系這里被稱為M271和M52，以及M42(其生產(chǎn)用于建立并調(diào)整裝置的靈敏度閾值的單克隆抗體，如下所述)。
表5報道了來自2個實驗的雜交瘤生產(chǎn)的結果表5

實施例4檢測孕婦陰道分泌物中最低濃度的PAMG-1的單克隆抗體對的選擇PAMG-1以1ug/ml在pH9.5的0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中通過在4℃溫育18小時而吸附于聚苯乙烯板。將下表6中列出的抗體自3mg/ml起始的系列稀釋物加入到孔中。然后將板37℃溫育一小時。將以辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠抗IgG抗體的抗體綴合物加入到孔中。反應用含有鄰苯二胺的0.05M檸檬酸-磷酸緩沖液(pH4.7)在37℃溫育20分鐘進行顯色。定量單克隆抗體的效價。
表6本發(fā)明的單克隆抗體結合濃度1ug/ml的PAMG-1的結合親和力

表6中所示的單克隆抗體濃度是抗體結合PAMG-1的最小濃度，其時溶液中PAMG-1的濃度為1ug/ml。濃度越低，抗體檢測最低濃度PAMG-1的能力就越高。單克隆抗體M271和M52被選擇開發(fā)用于PAMG-1的高靈敏度ELISA。
在ELISA中單克隆抗體M271沒有顯出與以下羊水中的各蛋白質(zhì)的交叉反應育性α-2-微球蛋白，人絨毛膜促性腺激素，滋養(yǎng)層β-1-糖蛋白，人胎盤催乳激素，α-胎蛋白，人血清白蛋白。
除此之外，在用柱進行的實驗中，M271抗體被固定在瓊脂糖上而使未稀釋的羊水通過柱子。電泳后從柱子獲得的洗脫液顯示出一條與PAMG-1的分子量相吻合的分子量條帶(28-30kDa)。將高度特異性的單克隆抗體M271置于本發(fā)明的橫向流動試條裝置的襯墊中。
與抗體M271相比，在ELISA中抗體M52與血清和羊水中豐富的IGFBP-3蛋白存在交叉反應。在陰道分泌物中所檢測到的非糖基化IGFBP-3的濃度為大約600ng/ml(實施例9)。在采用本發(fā)明的試條裝置的實驗中，這一濃度的IGFBP-3不抑制濃度為5ng/ml的PAMG-1的識別。
實施例5胎盤α1-微球蛋白的高靈敏度ELISA試驗采用標準ELISA和M271-M52抗體對不能檢測到陰道分泌物中的PAMG-1。為了允許檢測，通過將檢測所要求的PAMG-1濃度降至0.05ng/ml來提高ELISA的靈敏度。
研發(fā)了帶有抗體M271-M52的夾心免疫檢測系統(tǒng)，其顯示靈敏度為每毫升50皮克(0.05ng/ml)第一層單克隆抗體M271，在pH9.5的碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液中，濃度為6μg/ml。
第二層PAMG-1，濃度為3200，1600，800，400，200，100，50pg/ml，以及稀釋至1/2濃度的宮頸和陰道分泌物，在pH7.0緩沖液中。
第三層用緩沖液稀釋至1/1000的M52綴合物。
靈敏度的提高通過改變第一和第三層而獲得。與高靈敏度系統(tǒng)相比，在靈敏度為1ng/ml的常規(guī)系統(tǒng)中，第一層由濃度為10至20ug/ml的M271形成，綴合物的稀釋度(辣根過氧化物酶標記的M52)是1/40000。
獲得了標準校準曲線。如以下表7所示，其中PAMG-1濃度以每毫升所含皮克量表示(pg/ml)，在波長450nm下觀察到的顏色的光密度以標準的無量綱單位表示。
表7高靈敏度ELISA的校準曲線

實施例6懷孕婦女陰道分泌物中PAMG-1表8孕婦陰道分泌物中PAMG-1的濃度(ng/ml)。
采用抗PAMG-1的不同單克隆抗體對進行測量(妊娠29-41周)

在測量最低濃度后，每種抗體采用辣根過氧化物酶標記。在ELISA試驗中，將濃度為10μg/ml的未標記抗體引入板的孔中。然后，將濃度為50，100，200，400，800，1600，3200pg/ml的PAMG-1引入塑料板上作為第二層。最后，將其它抗體中的一種的綴合物引入板的每個孔中。選擇出下列成對起作用的抗體(這里顯示為抗體-綴合物)M1-M91；M271-M52；M152-M91；M392-M371。
這些抗體對被用于測量孕婦陰道分泌物中PAMG-1的濃度。最后，挑選出了M271-M52抗體對，對于該抗體對，測量到的陰道分泌物中的PAMG-1濃度最低。針對M271-M52對，采用高靈敏度ELISA測量PAMG-1濃度。所選擇的抗體對M271-M52和幾種其它抗體對被用來檢測未懷孕和已懷孕婦女羊水和血清中PAMG-1的濃度(實施例1，參考前文)。
實施例7孕婦陰道和宮頸分泌物中PAMG-1表9孕婦陰道和宮頸分泌物中PAMG-1的濃度，皮克每毫升(pg/ml)。下表中正常妊娠指沒有任何診斷到的自正常妊娠過程的偏高。
PAMG-1濃度采用M271-M52抗體對以高靈敏度ELISA測量。

實施例8患有陰道炎的孕婦陰道分泌物中的PAMG-1表10患有陰道炎的孕婦陰道分泌物中胎盤α1-微球蛋白濃度。采用非高靈敏度ELISA測量。

表11患有陰道炎的孕婦陰道分泌物中胎盤α1-微球蛋白濃度。

實施例9試條裝置特征的修飾在第一個實驗中，制備濃度為1，1/2，1/4，1/8，1/16，和1/32mg/ml的M52 Mab溶液。每種溶液被放置于一個試條裝置中。三種Mab的混合物(M52、M271、M42)也被稀釋成原濃度的1，1/2，1/4，1/8，1/16和1/32，并將每種稀釋溶液分別引入到單獨的試條裝置中。然后，將濃度為50ng/ml的PAMG-1溶液加入到12個試條裝置的每一個上。純M52抗體的溶液在1/8濃度時在檢測區(qū)造成了可見的有色條帶，而在Mab混合物中有色條帶在1/2濃度時可見。因此，Mab混合物抑制PAMG-1分子的結合，由此調(diào)節(jié)了條帶的可見性。
將抗體濃度為M520.8mg/ml，M2710.1mg/ml，和M420.1mg/ml的單克隆抗體放置于多個試條裝置的測試區(qū)中。然后，將在一個寬濃度范圍的PAMG-1(從12800ng/ml至7ng/ml)，以及濃度為1ng/ml的PAMG-1加入到本發(fā)明每個試條裝置的測試區(qū)。在PAMG-1濃度從12800ng/ml至7ng/ml的范圍內(nèi)，檢測條帶可以被人眼看見，但在濃度為1ng/ml時看不見。同時，當以相同濃度采用純M52溶液時，在PAMG-1的整個濃度范圍(包括1ng/ml)都能看見檢測條帶，盡管在1ng/ml時強度很弱。這極大提高了在患有某些醫(yī)學病癥例如炎癥的患者中產(chǎn)生假陽性結果的可能性。
1.在測試區(qū)采用兩種抗體的組合來調(diào)節(jié)本發(fā)明試條裝置的靈敏度在第一個研究中，只有M52抗體(濃度0.4mg/ml)被引入測試區(qū)中。在第二個研究中，M52抗體(濃度0.4mg/ml)和M271抗體(濃度0.4mg/ml)被引入測試區(qū)中。M271抗體綴合有金顆粒，將其以選定濃度引入襯墊區(qū)，以使510nm波長處光密度為10。將該綴合物在10％蔗糖和2％酪蛋白溶液中引入襯墊。PAMG-1被滴定至濃度為20，10，5和1ng/ml。
在如下表中，數(shù)值為用掃描儀以Sigma Scan程序測量的相對光密度指數(shù)。M271抗體在襯墊中；M271+M52組合在測試區(qū)中?！?”代表測試條帶是可見的(顏色足以被人眼所檢測)，“-”代表測試條帶不能被人眼檢測到。

檢測靈敏度從第一研究中的5ng/ml變成第二研究中的20ng/ml?？梢詺w納出通過在測試區(qū)加入Mab M271，獲得了靈敏度的4倍抑制。
2.采用兩種抗體的組合調(diào)節(jié)試條裝置中的測試條帶的顏色強度在第一個研究中，只有M52抗體(濃度0.8mg/ml)被引入測試區(qū)中。在第二個研究中，M52抗體(濃度0.8mg/ml)，M271抗體(濃度0.7mg/ml)和M42抗體(濃度0.8mg/ml)被引入測試區(qū)中。用于測試區(qū)的抗體混合物制備如下M52抗體溶液14μl(微升)，濃度為8.6mg/ml，與7μl濃度為13.9mg/ml的M42溶液以及3μl濃度為10.9mg/ml的M271溶液混合。然后，加入緩沖液至總體積為150ul，并且將溶液引入試條裝置中。
在下表中，顯示了相對光密度。

光密度曲線的斜率(坡度)在第一和第二研究中是不同的。在PAMG-1濃度為12ng/ml時，在第二個研究中試條上的顯色線要比第一研究中的明亮。在PAMG-1濃度為6ng/ml時，試條上的顯色線在第一個研究中是可見的，而在第二個研究中不可見。
采用抗體的組合觀察到視覺上獲得更明亮的條帶。因此，雖然靈敏度接近，人眼所觀察到的顏色強度是不同的。
3.采用四種抗體的組合來調(diào)節(jié)本發(fā)明裝置的靈敏度和顏色強度曲線的斜率在下表中，“+”代表可見的測試條帶，“-”代表不能被肉眼檢測到的測試條帶。

因此，通過組合抗體可以調(diào)節(jié)檢測的靈敏度。
實施例10臨床試驗結果研究方案患者采用“臨床評估”-對照和本發(fā)明的裝置進行評價。
入選條件1)妊娠齡為20.0-41.0周。
2)患者報告有暗示PROM或PPROM的征兆或癥狀。
3)在獲得用于評價患者是否有PROM或PPROM的樣本前，未進行手指陰道檢查。
4)患者同意無菌窺器檢查以收集標準臨床評價(pooling、硝嗪、羊齒試驗)和用于PAMG-1檢測的無菌拭子。
排除條件1)任何來源的活性陰道出血2)前置胎盤可從Sharp Memorial Mary Birch Hospital for Women(San Diego)和Summit Medical Center(Oakland)獲得192名患者自2000年12月15日起的統(tǒng)計分析。
在192名患者中有兩名，本發(fā)明的裝置給出了陽性結果而標準臨床評估沒有顯示出任何PROM的跡象。這兩例因而最初被計為是本發(fā)明裝置的假陽性結果(見以下“不正確”數(shù)據(jù))。然而，在檢測后的數(shù)小時之內(nèi)這兩名患者迅速出現(xiàn)了PROM的癥狀。在第二次臨床評估中被確診為PROM，而本發(fā)明裝置的這兩個結果因而被認為是真實的陽性(以下“正確”欄代表最后試驗數(shù)據(jù))。
組合的數(shù)據(jù) 組合的數(shù)據(jù)(不正確的) (正確的)Dx PROM Dx PROMa＝84，b＝5，c＝2，d＝101 a＝88，b＝1，c＝0，d＝103靈敏度＝a/(a+c)＝84/(84+2)＝97.7％ 靈敏度＝84/(84+0)＝100％特異性＝d/(b+d)＝101/(5+101)＝95.3％特異性＝103/(1+103)＝99％PPV＝a/(a+b)＝84/(84+5)＝94.4％ PPV＝88(88+1)＝99％NPV＝d/(d+c)＝101/(101+2)＝98.1％ NPV＝103/(103+0)＝100％其中a是所觀察到的真實陽性病例數(shù)；b是所觀察到的假陰性病例數(shù)；c是所觀察到的假陽性病例數(shù)；d是所觀察到的真實陰性病例數(shù)；靈敏度＝a/(a+c)；特異性＝d/(b+d)；陽性預測值PPV＝a/(a+b)；陰性預測值NPV＝d/(d+c)；真實陽性是本發(fā)明裝置的陽性反應數(shù)，其中PROM被隨后的臨床評價確診，真實陰性是被隨后的臨床評價確診的陰性反應數(shù)，假陽性是陽性反應數(shù)，但是PROM未被隨后的臨床評價所確診，假陰性是陰性反應數(shù)，但是隨后的臨床評價確診為PROM。
表12.采用本發(fā)明的裝置(Lot C 98-0007)在Third Maternity Hospital ofMoscow，Russian Federation，Obstetrics and Gynecology Department#2進行的試驗。

表13采用本發(fā)明的裝置(Lot C 98-0007)在Third Maternity Hospital ofMoscow，Russian Federation進行的試驗。

表14。采用本發(fā)明的裝置(Lot C 98-0007)在Third Maternity Hospital ofMoscow，Russian Federation進行的試驗。

表15采用本發(fā)明的裝置(Lot C 98-0007)在Third Maternity Hospital ofMoscow，Russian Federation，Obstetrics及Gynecology Chair of theState Moscow University of Russia進行的試驗。

備注表13，14，15中的羊水滲漏通過陰道排出物數(shù)量及超聲波掃描檢查來進行臨床評價。
在陰性檢測結果時長期臨床觀察是可能的，因為患者住院以治療相伴的疾病。
本發(fā)明不限于這里所述的具體實施方案的范圍。事實上，除在這里所描述的那些之外，從先前的描述和附圖，本發(fā)明的各種改變對于本領域技術人員來說是顯而易見的。這樣的改變也包括在所附的權利要求書的范圍之內(nèi)。
還要理解的是，所有的值均為近似值，提供這些值旨在描述目的。
本申請中所引用的專利、專利申請、公開出版物、產(chǎn)品說明和方案為所有目的特此全部引入作為參考。
表16。在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russsian National Collection ofIndustrial Mocroorganisms(VKPM)Depositary)(1 Dorozhny proezd 1，Moscow 117545，Russia)保藏的微生物。

權利要求
1.一種在檢測孕婦陰道分泌物中少量羊水時使假陽性和假陰性結果的可能性最小化的方法，以及基于該方法的試條裝置，其中所述方法包括(i)選擇用于測定陰道分泌物中胎盤α1-微球蛋白(PAMG-1)的最低背景濃度的高度特異性單克隆抗體對；以及(ii)選擇其它抗-PAMG-1單克隆抗體，所述抗體旨在和所述抗體對組合用于試條檢測裝置中以準確設立該試條檢測裝置的規(guī)定靈敏度閾值。
2.權利要求1的方法，其中，將單克隆抗體對(i)中的高度特異性單克隆抗體置于試條裝置的襯墊區(qū)中。
3.權利要求1的方法，其中，所述高度特異性單克隆抗體與標記物結合。
4.權利要求3的方法，其中標記物是染料顆粒。
5.權利要求1的方法，其中，將抗體對(i)中的第二單克隆抗體置于試條裝置的測試區(qū)中。
6.權利要求1的方法，其中，將一種或多種另外的抗-PAMG-1單克隆抗體(ii)與抗體對(i)中的第二抗體以預定比例置于所述試條裝置的測試區(qū)中。
7.權利要求6的方法，其中，用于與所述抗體對組合的所述抗體(ii)被用來設立所述試條裝置的預定靈敏度閾值。
8.權利要求1，6和7之任一的方法，其中，將以預定比例組合使用的所述抗-PAMG-1單克隆抗體(i)和(ii)用于設定陰道分泌物中每毫升0.05至0.2納克的所述PAMG-1背景水平值和每毫升5-10納克的所述試條裝置靈敏度閾值之間的最佳間距，從而將檢測孕婦陰道分泌物中少量羊水時的假陰性和假陽性結果的可能性最小化。
9.一種用于在陰道分泌物中檢測滲漏的羊水的方法，該方法包括在陰道分泌物中檢測PAMG-1特異性抗體對的結合。
10.權利要求9的方法，其中，該抗體對對于高于背景的PAMG-1水平敏感。
11.根據(jù)權利要求9的方法，其中，抗體對中的一個抗體被固定在固相支持物上。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中，固相支持物是一種液體能通過毛細作用在其中遷移通過的膜。
13.根據(jù)權利要求11的方法，其中抗體是單克隆抗體。
14.根據(jù)權利要求11的方法，還包括固定在固相支持物上對PAMG-1特異的第二抗體。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中固定在固相支持物上的抗體的比例提供了大約每毫升5納克的PAMG-1檢測閾值水平。
16.根據(jù)權利要求13的方法，其中單克隆抗體選自由保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)且保藏號為VKPM-93的雜交瘤N271生產(chǎn)的M271；由保藏在VKPM且保藏號為VKPM-92的雜交瘤N52生產(chǎn)的M52；由保藏在VKPM且保藏號為VKPM-94的雜交瘤N42生產(chǎn)的M42。
17.一種包含固定的PAMG-1特異性抗體和可移動的PAMG-1特異性抗體的裝置，其中，可移動抗體通過流體樣本進行移動從而使得可移動抗體可以與樣本中任何PAMG-1結合并且所形成的可移動抗體-PAMG-1復合物可以與固定的抗體結合，其中可移動抗體帶有標記物。
18.權利要求17的裝置，其中抗體是單克隆抗體。
19.權利要求17的裝置，其中所述固定的抗體被固定在膜支持物上。
20.權利要求17的裝置，其中標記物是膠體金。
21.權利要求17的裝置，還包括固定于固相支持物上的第二PAMG-1特異性抗體。
22.權利要求17的裝置，其中，固定在固相支持物上的抗體的比例提供了大約每毫升5納克的PAMG-1檢測閾值水平。
23.權利要求17的裝置，其中單克隆抗體選自由保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)且保藏號為VKPM-93的雜交瘤N271生產(chǎn)的M271；由保藏在VKPM且保藏號為VKPM-92的雜交瘤N52生產(chǎn)的M52；由保藏在VKPM且保藏號為VKPM-94的雜交瘤N42生產(chǎn)的M42。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過PAMG－1檢測抗體來檢測陰道中少量羊水的診斷方法和裝置。如圖1所示，該裝置包括含有已標記的M271抗體區(qū)(10)的襯墊(12)，測試區(qū)(14)和對照區(qū)(16)。
文檔編號G01N33/553GK1697972SQ03824113
公開日2005年11月16日 申請日期2003年8月12日 優(yōu)先權日2002年8月13日
發(fā)明者D·D·彼得魯寧, B·B·富克斯, E·I·扎賴斯基, M·N·博爾托夫斯卡亞, S·V·納濟莫娃, N·A·斯塔羅維斯塔亞, A·B·康斯坦丁諾夫, M·I·馬爾什斯卡亞 申請人:N-Dia公司