高通量菌落檢測(cè)芯片、檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了一種高通量菌落檢測(cè)芯片、檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)方法，該檢測(cè)芯片，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一個(gè)檢測(cè)單元，每個(gè)所述檢測(cè)單元包括沿第一方向依次設(shè)置的第一混合反應(yīng)槽、第二混合反應(yīng)槽和檢測(cè)池，所述第一混合反應(yīng)槽具有ATP提取液進(jìn)樣口和菌液進(jìn)樣口，所述第二混合反應(yīng)槽具有酶溶液進(jìn)樣口，所述第一混合反應(yīng)槽和第二混合反應(yīng)槽之間設(shè)有S型微通道閥，所述第二混合反應(yīng)槽與所述檢測(cè)池連通。本發(fā)明通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度確定ATP濃度，ATP含量和微生物數(shù)量之間存在著較好的線性關(guān)系,可以利用ATP含量與細(xì)菌數(shù)成正比這一原理,推算出菌落總數(shù)。應(yīng)用微流控芯片減少了人為干擾因素，降低了檢測(cè)過程中其熒光強(qiáng)度的衰減，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度。
【專利說明】
高通量菌落檢測(cè)芯片、檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本申請(qǐng)屬于生化、醫(yī)藥和食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種高通量菌落檢測(cè)芯片、檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菌落總數(shù)是指在一定條件下(如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等)每克(每毫升)樣品生長(zhǎng)出來的細(xì)菌菌落數(shù)量。水中菌落總數(shù)的測(cè)定是水質(zhì)監(jiān)測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它直接反應(yīng)水的細(xì)菌污染程度，人工游泳池水、生活飲用水等都需要對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。奶制品，碳酸飲料，以及成品啤酒的一個(gè)重要的微生物指標(biāo)就是菌落總數(shù)，其反映了奶制品，碳酸飲料，以及啤酒的細(xì)菌污染程度。
[0003]國(guó)內(nèi)檢測(cè)部門通常采用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)菌落總數(shù)，S卩37°C恒溫培養(yǎng)48h。存在著如下幾方面的缺陷:操作繁瑣，測(cè)試周期長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)實(shí)際生產(chǎn)的質(zhì)量控制沒有太大的意義。
[0004]ATP(Associat1n of Tennis Profess1nal)腺嘌呤核苷三磷酸是生物能量的主要來源，普遍存在于所有活的生物體中。
[0005]目前市場(chǎng)上已有用于ATP生物發(fā)光的檢測(cè)試劑盒，試劑用量大;檢測(cè)需要相關(guān)的精密儀器配套使用，儀器的購(gòu)買、使用及維護(hù)成本高;在操作過程中不能實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)，增加了人為因素，降低了檢測(cè)準(zhǔn)確度。微流控芯片技術(shù)是一種在微尺度空間中對(duì)流體進(jìn)行操控的科學(xué)技術(shù)。應(yīng)用微流控技術(shù)將混合、反應(yīng)和檢測(cè)等基本功能集成到一個(gè)十幾平方厘米的芯片上，較少試劑消耗量，降低了試樣成本，減少了環(huán)境污染。與光檢測(cè)模塊連用，實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)，減少了人為因素，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，增加了檢測(cè)準(zhǔn)確度。
[0006]其中微流控技術(shù)的一個(gè)難題是通道中的流體力。由于通道尺寸減小，流體的流動(dòng)阻力增加，需要更大的推力。可以采用微栗，但是體積小且功能適合的微栗價(jià)格昂貴;也可以使用注射栗和恒壓栗，但是這必然會(huì)造成試劑的浪費(fèi)，不適用于微量進(jìn)樣，因此失去了微流控技術(shù)的優(yōu)越性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種高通量菌落檢測(cè)芯片、檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0009]本申請(qǐng)實(shí)施例公開一種高通量菌落檢測(cè)芯片，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一個(gè)檢測(cè)單元，每個(gè)所述檢測(cè)單元包括沿第一方向依次設(shè)置的第一混合反應(yīng)槽、第二混合反應(yīng)槽和檢測(cè)池，所述第一混合反應(yīng)槽具有ATP提取液進(jìn)樣口和菌液進(jìn)樣口，所述第二混合反應(yīng)槽具有酶溶液進(jìn)樣口，所述第一混合反應(yīng)槽和第二混合反應(yīng)槽之間設(shè)有S型微通道閥，所述第二混合反應(yīng)槽與所述檢測(cè)池連通。
[0010]優(yōu)選的，在上述的高通量菌落檢測(cè)芯片中，所述第二混合反應(yīng)槽與檢測(cè)池之間通過微通道連通，所述微通道的截面積小于所述混合反應(yīng)槽的截面積。
[0011]優(yōu)選的，在上述的高通量菌落檢測(cè)芯片中，所述微通道包括至少一個(gè)U形的彎折部。
[0012]優(yōu)選的，在上述的高通量菌落檢測(cè)芯片中，所述基材為圓形，其圓心位置開設(shè)有離心孔，所述檢測(cè)單元分布于所述離心孔四周，所述第一方向位于所述基材的直徑方向，且自圓心向外延伸。
[0013]優(yōu)選的，在上述的高通量菌落檢測(cè)芯片中，所述芯片包括環(huán)形陣列于所述離心孔四周的多個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)單元。
[0014]優(yōu)選的，在上述的高通量菌落檢測(cè)芯片中，所述基材包括疊加的固定層和PMMA流道層，所述檢測(cè)單元形成于所述固定層和PMMA流道層之間。
[0015]相應(yīng)的，本申請(qǐng)公開了一種高通量菌落檢測(cè)系統(tǒng)，包括:
[0016]離心機(jī)；
[0017]所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，支撐于所述離心機(jī)上并可被所述離心機(jī)帶動(dòng)旋轉(zhuǎn)；
[0018]光檢測(cè)模塊，檢測(cè)檢測(cè)池內(nèi)的光信號(hào)，并將該光信號(hào)發(fā)送給信號(hào)處理模塊；
[0019]信號(hào)處理模塊，對(duì)光信號(hào)進(jìn)行處理并輸出熒光強(qiáng)度。
[0020]相應(yīng)的，本申請(qǐng)還公開了一種高通量菌落檢測(cè)方法，提供權(quán)利要求7所述的檢測(cè)系統(tǒng)，包括步驟:
[0021 ] (I)、從ATP提取液進(jìn)樣口、菌液進(jìn)樣口、酶溶液進(jìn)樣口分別注入ATP提取液、菌液和酶溶液；
[0022](2)、將芯片固定在離心機(jī)上，在第一轉(zhuǎn)速下使得菌液和ATP提取液在第一混合反應(yīng)槽內(nèi)混合，所述第一轉(zhuǎn)速滿足混合液無法突破S形微通道閥；
[0023](3)、提高轉(zhuǎn)速至第二轉(zhuǎn)速，使得混合液從S形微通道閥進(jìn)入第二混合反應(yīng)槽，并與第二混合反應(yīng)槽內(nèi)的酶溶液混合反應(yīng)；
[0024](4)、提高轉(zhuǎn)速至第三轉(zhuǎn)速，混合溶液進(jìn)入檢測(cè)池；
[0025](5)、對(duì)檢測(cè)池進(jìn)行定位檢測(cè)，測(cè)其熒光強(qiáng)度；
[0026](6)、以ATP濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其最低檢出限，利用ATP含量與細(xì)菌數(shù)成正比這一原理，推算出菌落總數(shù)。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0028](I)、體積小，整個(gè)芯片面積僅為幾平方厘米；
[0029](2)、在圓盤上引入了離心力法，解決了經(jīng)典微流控芯片在進(jìn)樣中需要外置栗的問題；
[0030](3)、片材質(zhì)采用PMMA，可批量生產(chǎn)，成本低廉。試劑用量少，明顯地降低了試劑成本。使用光電檢測(cè)模塊進(jìn)行檢測(cè)，避免了大型儀器購(gòu)買、使用和維護(hù)費(fèi)用。在一張芯片上完成了多個(gè)樣品的檢測(cè)，有效降低了每個(gè)樣品的檢測(cè)成本。
[0031](4)、該微流控芯片設(shè)計(jì)構(gòu)型可以連接在光電檢測(cè)模塊上，通過相關(guān)軟件可以實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)菌落總數(shù)。
[0032](5)、應(yīng)用微流控芯片減少了人為干擾因素，降低了檢測(cè)過程中其熒光強(qiáng)度的衰減，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度。
【附圖說明】
[0033]為了更清楚地說明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0034]圖1所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中PMMA流道層的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0035]圖2所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中固定層的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]應(yīng)用ATP生物發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)水體中菌落總數(shù)的反應(yīng)原理為:
[0037]ATP生物發(fā)光是在熒光素酶、熒光素和ATP存在下共同完成的。在熒光素酶和Mg2+的作用下，熒光素被ATP提供能量還原活化，活化后的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，生成熒光素(L)-AMP復(fù)合體，釋放焦磷酸。隨后在氧參與下，焚光素(L)-AMP復(fù)合體被氧化產(chǎn)生電激發(fā)，熒光素分子中的電子由激發(fā)態(tài)躍迀到低能級(jí)發(fā)射出光子，產(chǎn)生熒光。理論上，發(fā)光強(qiáng)度與ATP分子數(shù)量成正比，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度可以確定ATP濃度。
[0038]研究表明和證實(shí):ATP含量和微生物數(shù)量之間存在著較好的線性關(guān)系，可以利用ATP含量與細(xì)菌數(shù)成正比這一原理，推算出菌落總數(shù)。
[0039]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0040]參圖1和圖2所示，高通量菌落檢測(cè)芯片，包括基材1、以及分布于基材I上的至少一個(gè)檢測(cè)單元2，每個(gè)檢測(cè)單元2包括沿第一方向依次設(shè)置的第一混合反應(yīng)槽201、第二混合反應(yīng)槽202和檢測(cè)池203，第一混合反應(yīng)槽201具有ATP提取液進(jìn)樣口 204和菌液進(jìn)樣口 205，第二混合反應(yīng)槽202具有酶溶液進(jìn)樣口 206，第一混合反應(yīng)槽201和第二混合反應(yīng)槽202之間設(shè)有S型微通道閥207，第二混合反應(yīng)槽202與檢測(cè)池203連通。
[0041 ] 優(yōu)選的，第一混合反應(yīng)槽的深度為Imm，體積約為ΙΟΟμΙ，S型微通道閥的深度和寬度均為200μηι左右；第二混合反應(yīng)槽的深度約為1mm，體積約為200μ1;檢測(cè)池的直徑約為4mm ο
[0042]基材I優(yōu)選為圓形，其圓心位置開設(shè)有離心孔101，檢測(cè)單元2分布于離心孔四周，第一方向位于基材的直徑方向，且自圓心向外延伸。在優(yōu)選的實(shí)施例中，芯片包括環(huán)形陣列于離心孔四周的4個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)單元。
[0043]基材I包括兩層，上層是厚度為2mm的PMMA流道層102，下層是固定層103。檢測(cè)單元刻在PMMA流道層表面，通過與固定層疊加圍成密閉的檢測(cè)通道。
[0044]進(jìn)一步地，檢測(cè)池還與一通氣孔208連通。
[0045]在其他實(shí)施例中，檢測(cè)單元的數(shù)量可以根據(jù)需要設(shè)定，比如也可以為I個(gè)或其他數(shù)量;基材的形狀也并不限定于圓形，采用其他形狀時(shí)，可以通過將芯片的邊緣與離心機(jī)的軸心處連接，同樣可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的。
[0046]在上述技術(shù)方案中，芯片的進(jìn)樣和混合采用離心旋轉(zhuǎn)的方式，芯片中的S型微通道閥207采用“S”形微通道，不僅能夠阻止菌液和ATP提取液在與酶溶液反應(yīng)之前進(jìn)入混合反應(yīng)槽，同時(shí)增加了菌液和ATP提取液的混合程度，提高裂解效率。
[0047]在低轉(zhuǎn)速下對(duì)菌液和ATP提取液通過不斷改變離心方向在距離圓心近的混合反應(yīng)槽中進(jìn)行混合、裂解，將菌體中的ATP充分釋放出來。連接的“S”型微通道閥尺寸小，利用PMMA材料的疏水效應(yīng)，形成一個(gè)開關(guān)閥。在低轉(zhuǎn)速下菌液和ATP裂解液不能通過微通道閥進(jìn)入離圓心較遠(yuǎn)的混合反應(yīng)槽;在高轉(zhuǎn)速下，該閥被突破，菌液和ATP提取液進(jìn)入離圓心較遠(yuǎn)的混合反應(yīng)槽與酶溶液反應(yīng)產(chǎn)生熒光。
[0048]本實(shí)施例中，對(duì)檢測(cè)池內(nèi)的熒光度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)部分采用光電檢測(cè)模塊和信號(hào)處理模塊，其中光電檢測(cè)模塊包括雪崩二極管，模數(shù)轉(zhuǎn)換，信號(hào)放大器。雪崩二極管原理是在其PN結(jié)上施加一個(gè)非常高的反向偏壓，使結(jié)區(qū)產(chǎn)生很強(qiáng)的電場(chǎng)，當(dāng)光照射PN結(jié)時(shí)所激發(fā)的光生載流子進(jìn)入結(jié)區(qū)后，在強(qiáng)電場(chǎng)中會(huì)受到加速而獲得足夠的動(dòng)能，在高速運(yùn)動(dòng)中與晶格發(fā)生碰撞，使晶格中的原子發(fā)生電離，產(chǎn)生新的電子空穴對(duì)，通過不斷往復(fù)，形成很大的光信號(hào)電流，其靈敏度和線性范圍均大大超過其他常規(guī)技術(shù)。
[0049]離心式微流控系統(tǒng)將分析的預(yù)處理、分離及反應(yīng)集合在一張CD大小的芯片上，以離心力為液體驅(qū)動(dòng)力，解決了經(jīng)典微流控芯片栗和混合的問題，它能應(yīng)用于任何液體，任何化學(xué)物質(zhì)。
[0050]進(jìn)一步地，第二混合反應(yīng)槽與檢測(cè)池之間通過微通道208連通，微通道的208截面積小于混合反應(yīng)槽的截面積。微通道208包括至少一個(gè)U形的彎折部。優(yōu)選的，微通道自第二混合反應(yīng)槽出口處向第二方向延伸，經(jīng)過第一折彎后再沿第一方向延伸并與檢測(cè)池連通，其中第一方向和第二方向相反。
[0051 ]用ATP熒光快速檢測(cè)菌落總數(shù)的微流控芯片，其工作流程是:
[0052]1、先將光電檢測(cè)模塊和信號(hào)處理模塊連接好，并進(jìn)行校正測(cè)試。
[0053]2、利用離心機(jī)固定孔將芯片固定在離心機(jī)轉(zhuǎn)頭上，準(zhǔn)備移液槍和槍頭依次從3個(gè)進(jìn)樣口注入ΙΟΟμΙ的酶溶液、25μ1的ATP提取液和25μ1的菌液。
[0054]3、打開離心機(jī)，在低轉(zhuǎn)速下交換方向旋轉(zhuǎn)Imin，靜置2min，完成菌液與ATP提取液的混合及ATP高效率提取;提高轉(zhuǎn)速，突破S型微通道閥實(shí)現(xiàn)與酶溶液混合反應(yīng)，再次提高離心轉(zhuǎn)速，混合溶液進(jìn)入檢測(cè)池。
[0055]4、打開光電檢測(cè)模塊和信號(hào)處理模塊對(duì)檢測(cè)池進(jìn)行定位檢測(cè)，測(cè)其熒光強(qiáng)度。
[0056]5、以ATP濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，生物發(fā)光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其最低檢出限，進(jìn)而利用ATP含量與細(xì)菌數(shù)成正比這一原理，推算出菌落總數(shù)。
[0057]需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個(gè)……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。
[0058]以上所述僅是本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請(qǐng)?jiān)淼那疤嵯?，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本申請(qǐng)的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高通量菌落檢測(cè)芯片，其特征在于，包括基材、以及分布于所述基材上的至少一個(gè)檢測(cè)單元，每個(gè)所述檢測(cè)單元包括沿第一方向依次設(shè)置的第一混合反應(yīng)槽、第二混合反應(yīng)槽和檢測(cè)池，所述第一混合反應(yīng)槽具有ATP提取液進(jìn)樣口和菌液進(jìn)樣口，所述第二混合反應(yīng)槽具有酶溶液進(jìn)樣口，所述第一混合反應(yīng)槽和第二混合反應(yīng)槽之間設(shè)有S型微通道閥，所述第二混合反應(yīng)槽與所述檢測(cè)池連通。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，其特征在于:所述第二混合反應(yīng)槽與檢測(cè)池之間通過微通道連通，所述微通道的截面積小于所述混合反應(yīng)槽的截面積。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，其特征在于:所述微通道包括至少一個(gè)U形的彎折部。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，其特征在于:所述基材為圓形，其圓心位置開設(shè)有離心孔，所述檢測(cè)單元分布于所述離心孔四周，所述第一方向位于所述基材的直徑方向，且自圓心向外延伸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，其特征在于:所述芯片包括環(huán)形陣列于所述離心孔四周的多個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)單元。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，其特征在于:所述基材包括疊加的固定層和PMMA流道層，所述檢測(cè)單元形成于所述固定層和PMMA流道層之間。7.一種高通量菌落檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，包括: 離心機(jī)； 權(quán)利要求1至6任一所述的高通量菌落檢測(cè)芯片，支撐于所述離心機(jī)上并可被所述離心機(jī)帶動(dòng)旋轉(zhuǎn)； 光檢測(cè)模塊，檢測(cè)檢測(cè)池內(nèi)的光信號(hào)，并將該光信號(hào)發(fā)送給信號(hào)處理模塊； 信號(hào)處理模塊，對(duì)光信號(hào)進(jìn)行處理并輸出熒光強(qiáng)度。8.一種高通量菌落檢測(cè)方法，其特征在于，提供權(quán)利要求7所述的檢測(cè)系統(tǒng)，包括步驟: (1)、從ATP提取液進(jìn)樣口、菌液進(jìn)樣口、酶溶液進(jìn)樣口分別注入ATP提取液、菌液和酶溶液； (2)、將芯片固定在離心機(jī)上，在第一轉(zhuǎn)速下使得菌液和ATP提取液在第一混合反應(yīng)槽內(nèi)混合，所述第一轉(zhuǎn)速滿足混合液無法突破S形微通道閥； (3)、提高轉(zhuǎn)速至第二轉(zhuǎn)速，使得混合液從S形微通道閥進(jìn)入第二混合反應(yīng)槽，并與第二混合反應(yīng)槽內(nèi)的酶溶液混合反應(yīng)； (4)、提高轉(zhuǎn)速至第三轉(zhuǎn)速，混合溶液進(jìn)入檢測(cè)池； (5)、對(duì)檢測(cè)池進(jìn)行定位檢測(cè)，測(cè)其熒光強(qiáng)度； (6)、以ATP濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定其最低檢出限，利用ATP含量與細(xì)菌數(shù)成正比這一原理，推算出菌落總數(shù)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK105886386SQ201610207952
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月6日
【發(fā)明人】亓琳琳, 顧志鵬, 聶富強(qiáng)
【申請(qǐng)人】蘇州汶顥芯片科技有限公司