專(zhuān)利名稱：一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母中乙醛脫氫酶的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的方法。
背景技術(shù)：
乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase，ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中，在輔酶I存在的條件下，它催化某些醛和酮的脫氫反應(yīng)。在人類(lèi)和其他許多動(dòng)物體內(nèi)， 線粒體乙醛脫氫酶能把對(duì)生物體有害的醛類(lèi)轉(zhuǎn)化。人體由腸道吸收攝入的乙醇，主要在肝臟內(nèi)代謝。乙醇進(jìn)入體內(nèi)后，首先在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下使乙醇脫氫轉(zhuǎn)化為乙醛， 然后在由乙醛脫氫酶(ALDH)的催化作用下，使乙醛被氧化生成乙酸，乙酸通過(guò)三羧酸循環(huán) (TCA)分解為(X)2和水，并釋放能量生成ATP。人體中，一般都存在前一種酶，而且數(shù)量基本是相等的。但缺少后一種酶的人就比較多，在亞洲地區(qū)，50%的人缺少ALDH。ALDH的缺少， 使乙醇不能被完全分解為水和CO2,以乙醛的形式繼續(xù)留在體內(nèi)。乙醛是毒性很強(qiáng)的物質(zhì)， 可以共價(jià)結(jié)合微粒體蛋白形成乙醛蛋白絡(luò)合物，抑制肝細(xì)胞合成蛋白的排出，最終造成人體酒精性肝病的發(fā)生。而且乙醛還在體內(nèi)通過(guò)黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)槌趸衔?，?dǎo)致膜脂質(zhì)過(guò)氧化生成丙二醛和壬烯，它們可以進(jìn)一步促進(jìn)肝細(xì)胞釋放因子，破壞細(xì)胞膜。當(dāng)乙醛在體內(nèi)累積過(guò)多時(shí)，會(huì)使人酒后產(chǎn)生臉紅、惡心、嘔吐、全身出汗、肌肉抽搐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致休克。乙醛在體內(nèi)是潛在的致癌物質(zhì)，能引起體內(nèi)口腔、食道、腸道、肝臟癌型。因此， 乙醛在ALDH的催化作用下氧化分解至關(guān)重要。ALDH由于存在特殊的催化作用，在社會(huì)生產(chǎn)和日常生活中的應(yīng)用將日益廣泛。現(xiàn)有技術(shù)中，制備ALDH遇到的一個(gè)問(wèn)題是用研磨和色譜柱技術(shù)從動(dòng)植物細(xì)胞中分離提取，費(fèi)用高、純化產(chǎn)率低、ALDH含量少，難以大規(guī)模生產(chǎn)。在制備ALDH遇到的另一個(gè)問(wèn)題是現(xiàn)有的商品ALDH主要是從動(dòng)物的肝臟、胰腺或肝細(xì)胞線粒體中分離提取，資源有限且價(jià)格昂貴，極大地阻礙了這一產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的方法。該方法使用超聲波破碎法來(lái)破碎雪峰干酵母細(xì)胞得到粗酶液ALDH，并用硫酸銨沉淀和kphadex G-75分離純化粗酶液ALDH，可以得到純化倍數(shù)較高、活力較大、分子量分布在57kDa左右的ALDH，所得產(chǎn)品可以應(yīng)用于一般食品生產(chǎn)、醫(yī)療領(lǐng)域以及基因工程當(dāng)中， 特別適用于解酒產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案包括
一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的制備方法，包括如下步驟
(1)將雪峰干酵母加入水中混勻，在30°C 40°C的水浴中孵育10mirT20min，再高速離心后取沉淀即得濕酵母；其中雪峰干酵母的重量與水的體積比為59Γ15% ；
(2)將該濕酵母加入濃度為0.05mol/L、pH為7. 5^8. 5的磷酸鹽緩沖液中配制成菌懸液，將該菌懸液超聲波破碎后，離心，收集上清液，即為粗酶液；其超聲波破碎的條件為處理量為15mL 25mL、溫度1°C 8°C、超聲功率為250W 350W、每次超聲時(shí)間廣4s、間隔時(shí)間廣8s、總的超聲時(shí)間l(T20min ；濕酵母的重量與磷酸鹽緩沖液的體積比為15°/Γ25% ；
(3)將飽和度為30%飛0%的硫酸銨加入上述所得的粗酶液中，離心，取其上清液，再將飽和度為659Γ85%的硫酸銨加入該上清液中，離心，取其沉淀，并向該沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全溶解后，分離，即可得到所需的乙醛脫氫酶酶。所述步驟(1)中雪峰干酵母的重量與水的體積比為89Γ12%。所述步驟(1)中雪峰干酵母孵育的水浴溫度為33°C 37°C，孵育時(shí)間為 13min 17min。所述步驟(2)中濕酵母的重量與磷酸緩沖液的體積比為189Γ22%。所述超聲波破碎的處理量為18m廣22mL。所述磷酸緩沖液的pH值為7. 8 8. 2。
所述超聲波破碎的溫度為2。C~6。C。所述超聲波破碎的功率為280W 320W。所述每次超聲波破碎的時(shí)間為廣3s、間隔時(shí)間為廣5s、總時(shí)間為12 18min。所述步驟(4 )中粗酶液經(jīng)兩次分級(jí)沉淀的硫酸銨飽和度分別為359Γ55%和 709^80%。由于一般酵母的細(xì)胞壁較厚，ALDH容易受外部極端環(huán)境影響而失去活性，因此篩選出對(duì)ALDH活力影響小的酵母細(xì)胞破碎方法是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。破碎酵母細(xì)胞壁除有反復(fù)凍融法、化學(xué)滲透法、研磨法、超聲破碎法等，其中超聲破碎法是利用超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)將酵母的細(xì)胞壁破碎，這一方法與其他方法相比，對(duì)細(xì)胞破碎效果好，對(duì)ALDH活力影響小的特點(diǎn)。本發(fā)明的關(guān)鍵是超聲破碎雪峰干酵母細(xì)胞。超聲破碎是一種利用超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)達(dá)到有效破碎酵母細(xì)胞釋放ALDH的目的，配合降溫措施可較有效保存ALDH 的活力。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果
1.本發(fā)明中使用的酵母為雪峰干酵母，為面包酵母，可食用，并且易培養(yǎng)，周期短，價(jià)格低廉，有利于降低生產(chǎn)成本。2.本發(fā)明用超聲波破碎雪峰干酵母釋放ALDH，從而提高了細(xì)胞破碎效果，有效保存了 ALDH的活力，提高了酵母利用率。3.本發(fā)明制取的ALDH的品質(zhì)可達(dá)到或超過(guò)國(guó)內(nèi)同類(lèi)產(chǎn)品，提取ALDH后的酵母仍可以作為他用如制飼料、提蛋白等，既提高了酵母的利用價(jià)值，又提供了一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ALDH的制取方法。
具體實(shí)施例方式為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表示的范圍。實(shí)施例1
第一步取一定量的雪峰干酵母按8% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育15min,制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質(zhì)量體積比20%(W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH7. 5)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時(shí)間3s、間隙時(shí)間Is、總時(shí)間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min,收集上清液，即為ALDH粗酶液，經(jīng)檢測(cè)ALDH的活力達(dá)到0. 46U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經(jīng)飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經(jīng)飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 lOmin，收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH7. 5)，將沉淀溶解，經(jīng)檢測(cè) ALDH的比活力達(dá)到1. 03U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經(jīng)kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, ρΗ7· 5)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經(jīng)測(cè)定ALDH的比活力達(dá)到 1. MU/mg，經(jīng)電泳測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)品有共同的條帶，并且測(cè)定的ALDH分子量為57kDa左右。實(shí)施例2
第一步取一定量的雪峰干酵母按10% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質(zhì)量體積比20% (W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH8. 0)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時(shí)間3s、間隙時(shí)間Is、總時(shí)間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min,收集上清液，即為ALDH粗酶液，經(jīng)檢測(cè)ALDH的活力達(dá)到0. 48U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經(jīng)飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經(jīng)飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 lOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH8. 0)，將沉淀溶解，經(jīng)檢測(cè) ALDH的比活力達(dá)到1. 07U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經(jīng)kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, ρΗ8· 0)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經(jīng)測(cè)定ALDH的比活力達(dá)到 1. 27U/mg，經(jīng)電泳測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)品有共同的條帶，并且測(cè)定的ALDH分子量為56kDa左右。實(shí)施例3
第一步取一定量的雪峰干酵母按12% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質(zhì)量體積比20% (W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH8. 5)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時(shí)間3s、間隙時(shí)間Is、總時(shí)間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min,收集上清液，即為ALDH粗酶液，經(jīng)檢測(cè)ALDH的活力達(dá)到0. 50U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經(jīng)飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經(jīng)飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 lOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH8. 5)，將沉淀溶解，經(jīng)檢測(cè)ALDH的比活力達(dá)到1. 09U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經(jīng)kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, pH8. 5)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經(jīng)測(cè)定ALDH的比活力達(dá)到 1. 30U/mg，經(jīng)電泳測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)品有共同的條帶，并且測(cè)定的ALDH分子量為57kDa左右。實(shí)施例4
第一步取一定量的雪峰干酵母按14% (W/V)的比例加入水混勻，于35°C水浴中孵育 15min，制得菌懸液。將菌懸液于4°C、5000r/min、離心5min，棄上清液，蒸餾水清洗1次，再次離心，取沉淀即濕酵母，并保存于4°C冰箱備用。第二步將濕酵母按質(zhì)量體積比20% (W/V)重懸浮于0. 05mol/L PBS (Na2HPO4-KH2PO4, pH7. 5)中，于冰水浴中超聲波破碎，條件處理量20mL、功率300W、破碎時(shí)間3s、間隙時(shí)間Is、總時(shí)間15min。將破碎液于4°C、5000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為ALDH粗酶液，經(jīng)檢測(cè)ALDH的活力達(dá)到0. 45U/mg。第三步將上述ALDH粗酶液經(jīng)飽和度為35%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，IOOOOr/ min離心lOmin，收集上清，經(jīng)飽和度為70%的硫酸銨沉淀室溫靜置lh，10000r/min離心 IOmin,收集沉淀，加入5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0. 05mol/L pH7. 5)，將沉淀溶解，經(jīng)檢測(cè) ALDH的比活力達(dá)到1. 03U/mg。第四步將上述收集的沉淀溶解液經(jīng)kphadex G_75分離，洗脫液為磷酸鹽緩沖液(濃度0. 05mol/L, pH7. 5)，流速為0. 4mL/min,收集洗脫峰，經(jīng)測(cè)定ALDH的比活力達(dá)到 1. 22U/mg，經(jīng)電泳測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)品有共同的條帶，并且測(cè)定的ALDH分子量為56kDa左右。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將雪峰干酵母加入水中混勻，在30°C 40°C的水浴中孵育10mirT20min，再高速離心后取沉淀即得濕酵母；其中雪峰干酵母的重量與水的體積比為59Γ15% ；(2)將該濕酵母加入濃度為0.05mol/L、pH為7. 5^8. 5的磷酸鹽緩沖液中配制成菌懸液，將該菌懸液超聲波破碎后，離心，收集上清液，即為粗酶液；其超聲波破碎的條件為處理量為15mL 25mL、溫度1°C 8°C、超聲功率為250W 350W、每次超聲時(shí)間廣4s、間隔時(shí)間廣8s、總的超聲時(shí)間l(T20min ；濕酵母的重量與磷酸鹽緩沖液的體積比為15°/Γ25% ；(3)將飽和度為30%飛0%的硫酸銨加入上述所得的粗酶液中，離心，取其上清液，再將飽和度為659Γ85%的硫酸銨加入該上清液中，離心，取其沉淀，并向該沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全溶解后，分離，即可得到所需的乙醛脫氫酶酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中雪峰干酵母的重量與水的體積比為89Γ12%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中雪峰干酵母孵育的水浴溫度為33°C 37°C，孵育時(shí)間為13mirTl7min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中濕酵母的重量與磷酸緩沖液的體積比為18% 22%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎的處理量為18m廣22mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液的PH值為7.8 8. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎的溫度為2V 6°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，超聲波破碎的功率為^0W 320W。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，每次超聲波破碎的時(shí)間為廣3s、間隔時(shí)間為廣5s、總時(shí)間為12 18min。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中粗酶液經(jīng)兩次分級(jí)沉淀的硫酸銨飽和度分別為35% 55%和70% 80%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從雪峰干酵母中分離乙醛脫氫酶的制備方法，包括如下步驟將雪峰干酵母加入水中，孵育，得濕酵母并加入磷酸鹽緩沖液中配制成菌懸液，將該菌懸液超聲波破碎后，離心，收集上清液，即為粗酶液；將飽和度為30%~60%的硫酸銨加入上述所得的粗酶液中，離心，取其上清液，再將飽和度為65%~85%的硫酸銨加入該上清液中，離心，取其沉淀，并向該沉淀中加入磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全溶解后，分離，即可得到所需的乙醛脫氫酶酶。本發(fā)明突破了乙醛脫氫酶來(lái)源的局限性，實(shí)現(xiàn)了原料的來(lái)源廣、價(jià)格低廉和易培養(yǎng)，具有產(chǎn)品活性高、產(chǎn)品純度高和反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單可控的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102533684SQ201210005420
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者吳暉, 賴富饒, 陳貴川 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)