專利名稱：培養(yǎng)基自動(dòng)優(yōu)化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及高通量篩選方法領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的篩選系統(tǒng)和方法，其可以用于識(shí)別引發(fā)期望響應(yīng)的試劑混合物，尤其根據(jù)諸如抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和達(dá)到抗體分泌峰值的時(shí)間的各種響應(yīng)識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的二種或三種蛋白胨的最佳集和/或子集。
背景技術(shù)：
對(duì)于治療中使用的用來(lái)治療或醫(yī)治人的疾病的細(xì)胞，希望在體外培養(yǎng)基里保持細(xì)胞時(shí)控制細(xì)胞命運(yùn)例如細(xì)胞存活、增殖和分化。因此需要控制細(xì)胞表面受體和配體的相互作用。例如，為了獲得對(duì)細(xì)胞和存在于體外培養(yǎng)基底上的配體之間的相互作用的控制，可以對(duì)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基例如聚苯乙烯涂上聚合物，使培養(yǎng)基中即便使用血清蛋白后者也不允許細(xì)胞附著。從而這種涂層消除對(duì)血清蛋白的無(wú)控的和任意的吸收。接著可以在該涂層上固定適宜與細(xì)胞表面受體相互作用的生物活性配體，同時(shí)保持這些配體的生物活性。業(yè)內(nèi)人士周知這個(gè)概念。例如，已知把透明質(zhì)酸或藻酸用作為表面涂層，可以在該涂層上固定細(xì)胞粘附配體，方法是利用在該涂層和細(xì)胞粘附配體之間產(chǎn)生穩(wěn)定共價(jià)鍵的化學(xué)物質(zhì)。這防止細(xì)胞粘附配體溶解并脫離表面。另外，該涂層本身不支持細(xì)胞粘附。在2002年9月30日提交的共同待決、共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259,797中對(duì)此做出進(jìn)一步說(shuō)明，其整個(gè)內(nèi)容收錄在此作為參考。
另外，為了達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)可能需要特殊的試劑混合物。已知大量的生長(zhǎng)效應(yīng)因子分子。它們包括生長(zhǎng)因子、激素、肽、小分子和細(xì)胞外結(jié)合分子。但是，為尋找正確生長(zhǎng)效應(yīng)因子或生長(zhǎng)效應(yīng)因子組合以便對(duì)給定的細(xì)胞類型達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)，這將是冗長(zhǎng)的工作。
因此，需要一種通量更高的系統(tǒng)和方法以識(shí)別用于為給定細(xì)胞類型達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)的試劑。對(duì)于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中不存活的細(xì)胞或只在通過(guò)強(qiáng)烈改變它們的分化狀態(tài)才存活的細(xì)胞，這是特別感興趣的，其主要例子是初級(jí)哺乳細(xì)胞。技術(shù)上尤其需要一種計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法和系統(tǒng)，以便為了達(dá)到期望的細(xì)胞系統(tǒng)地探查所需的因子混合之間的交互作用。這種通量更高的系統(tǒng)和方法應(yīng)包括從列出幾種可能的試劑例如蛋白胨開(kāi)始，并且實(shí)施一種優(yōu)化策略以便根據(jù)各種響應(yīng)識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的二種或三種蛋白胨的最佳子集。這些響應(yīng)可以包括抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和抗體分泌峰值周期。

發(fā)明內(nèi)容
從而，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種自動(dòng)系統(tǒng)和方法以便識(shí)別在細(xì)胞中造成表現(xiàn)型改變的試劑。該方法包括在陣列中提供受器并且提供包含類因子名、因子水平和試驗(yàn)運(yùn)行的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。該方法還包括根據(jù)該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)在一些選定的受器中置入單種試劑的不同混合物以及利用軟件程序產(chǎn)生該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)。該軟件自動(dòng)地把試劑的身份變換到類因子名上，把試劑的濃度或數(shù)量變換到因子水平上，并且把該陣列內(nèi)的受器的位置變換到試驗(yàn)運(yùn)行上。一旦根據(jù)該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)把不同的混合物正確地置入各受器中，置入的混入物和能改變它們的表現(xiàn)型的完整細(xì)胞接觸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的包括提供一種方法，以獲取指示相接觸的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的數(shù)據(jù)，并且利用包含算法的處理器比較獲取的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，以識(shí)別哪些試劑混合物和/或哪些單種試劑在造成所接觸的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變上是有效的。該方法還包括在一個(gè)或更多的數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)、各試劑身份、該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)、獲取的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及該算法的比較結(jié)果。
本發(fā)明的再一個(gè)目的包括提供一種用來(lái)實(shí)現(xiàn)剛剛描述的方法的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括受器陣列，其中一些選定的受器用于接受(i)單種試劑的不同混合物和(ii)含有細(xì)胞的液體。該系統(tǒng)還包括含有類因子名、因子水平和試驗(yàn)運(yùn)行的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，并且包括用于產(chǎn)生該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)的軟件程序。該軟件程序自動(dòng)地把試劑身份變換成類因子名，把試劑的濃度或數(shù)量變換成因子水平并且把該陣列內(nèi)的受器的位置變換成試驗(yàn)運(yùn)行。該系統(tǒng)還包括獲得的指示細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且包括一個(gè)含有比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)以便識(shí)別在造成細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變上是有效的混合物和/或單試劑的算法的處理器。該系統(tǒng)中還包括一個(gè)或更多的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于存儲(chǔ)該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)、試劑身份、該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)、獲取的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及算法比較結(jié)果。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是應(yīng)用培養(yǎng)基自動(dòng)優(yōu)化技術(shù)以便用戶能利用MPM/CATSBA軟件和自動(dòng)液體處理平臺(tái)優(yōu)化培養(yǎng)基成分(例如因子)。利用各專用因子，該MPM/CATSBA軟件在多孔板格式下自動(dòng)建立統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，并且生成必要的文件從利用自動(dòng)液體處理平臺(tái)(例如，Biomek FX，Biomek 2000，Tecan Genesis或任何類似平臺(tái))準(zhǔn)備正確的試驗(yàn)條件。該軟件以及它駐留的數(shù)據(jù)庫(kù)用于自動(dòng)地分類和分析數(shù)據(jù)(例如，熒光性，吸收性，細(xì)胞計(jì)數(shù)等等)的各種格式。該軟件的用戶可以在自動(dòng)方式下進(jìn)行所有相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析并且自動(dòng)地生成和在數(shù)據(jù)庫(kù)中自動(dòng)地存儲(chǔ)所有相關(guān)的報(bào)告。在完成全部相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析后，用戶具有為元(meta)分析和數(shù)據(jù)挖掘而組合來(lái)自多個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果的能力。


從下面的連同附圖一起閱讀的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的這些以及其它的目的、優(yōu)點(diǎn)和新穎特征會(huì)更容易地理解，附圖中圖1A和1B是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的示例自動(dòng)進(jìn)程的流程圖，通過(guò)該進(jìn)程可以在高通量方式下識(shí)別能在細(xì)胞中引起表現(xiàn)型改變的最佳混合物和/或最佳試劑；圖2是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的示例進(jìn)程的流程圖，利用從圖1A和1B進(jìn)程中導(dǎo)出的信息從本進(jìn)程可以建立和/或修改生物模型；圖3示出為生物系統(tǒng)上的試劑混合物(M)的作用假設(shè)的示例細(xì)胞路徑的模型實(shí)例；圖4是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)例子的方塊圖，該系統(tǒng)可用來(lái)實(shí)現(xiàn)圖1-3的方法；圖5的方塊圖示例說(shuō)明該依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的系統(tǒng)的組成部分實(shí)例；圖6示出表示依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的示例測(cè)試孔；圖7示意表示96孔板布置例子，其包括單試劑的不同混合物，其中利用統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)建立該布置，在該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)中類因子代表各種單試劑并且類因子的組合形成依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的不同的混合物。
圖8A和8B是情景例子的方塊圖表示，可以利用它們開(kāi)發(fā)依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的方法的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。
圖9A和9B是另一個(gè)情景例子的方塊圖表示，可以利用它們開(kāi)發(fā)依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的方法的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。
圖10是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例利用圖9A和9B的情景開(kāi)發(fā)的帶有用于96孔板的布置的混合物設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)電子表格表示例子，其中根據(jù)給出的因子數(shù)劃分孔中的總液體容積；
圖11示出依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的基于圖10中的電子表格的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的96孔板的布置例子；圖12是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的在圖11中示出的布置下附著到該96孔板的各孔上的熒光標(biāo)記的細(xì)胞的熒光顯微鏡圖像；圖13是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的圖12中的顯微鏡圖象分析后得到的細(xì)胞核計(jì)數(shù)-孔號(hào)圖的例子；圖14是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的利用對(duì)圖9-13的信息進(jìn)行混合物-模型分析得到的Ln(無(wú)血清下細(xì)胞計(jì)數(shù)+1)-基準(zhǔn)混合偏差曲線例子；圖15是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的利用對(duì)圖9-13的信息進(jìn)行混合物-模型分析得到的Ln(10％血清下細(xì)胞計(jì)數(shù)+1)-基準(zhǔn)混合偏差曲線例子；圖16a到16d是電子表格例子，示出依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的用于96孔板的布置的Plackett-Burman統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；圖17示出依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的圖16中的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)例子里的因子身份的例子；圖18是示例曲線，示出依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的第一種材料隨時(shí)間的分泌和細(xì)胞增殖；圖19是示例曲線，示出依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的第二種材料隨時(shí)間的分泌和細(xì)胞增殖；以及圖20是示例曲線，示出依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的第一和第二種材料隨時(shí)間的組合分泌和細(xì)胞增殖。
具體實(shí)施例方式
如本文定義那樣，“試劑”是生長(zhǎng)效應(yīng)因子分子，它們結(jié)合細(xì)胞并且調(diào)節(jié)目標(biāo)分子或組織的存活、分化、增殖和成熟。供在本發(fā)明的各實(shí)施例中使用的適當(dāng)試劑的例子包括蛋白胨、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子、肽、激素和細(xì)胞因子，它們可以在溶液中或者結(jié)合在培養(yǎng)表面，例如孔表面、支架表面、珠表面等等上。
術(shù)語(yǔ)“試劑固定材料”文中定義為可以作為培養(yǎng)表面和試劑之間的鏈接的生物相容性聚合物。
如本文定義那樣，術(shù)語(yǔ)“固定”、“固定的”等是把試劑，即生長(zhǎng)效應(yīng)因子分子，變成固定在培養(yǎng)表面上，例如孔表面或孔內(nèi)含有的支架表面上。該術(shù)語(yǔ)預(yù)期包括試劑被動(dòng)吸收到培養(yǎng)表面上，以及試劑直接或間接地共價(jià)附著到培養(yǎng)表面上。
“因子”是試驗(yàn)中變量的名稱并且代表從一次試驗(yàn)或一次運(yùn)行(例如一個(gè)孔)到下一個(gè)試驗(yàn)或運(yùn)行改變的要素。在本發(fā)明的各實(shí)施例中，“因子”是單試劑或單試劑的混合物的類名。根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)組合因子以形成試驗(yàn)中的不同混合物。
如本文定義那樣，“統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)”是一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其幫助用戶找出可調(diào)整變量(即因子)的組合以產(chǎn)生最佳試驗(yàn)結(jié)果，以顯著地減少為達(dá)到目的所需的試驗(yàn)次數(shù)。在本發(fā)明的各實(shí)施例中，利用代表被試驗(yàn)的試劑的類因子名生成適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。該設(shè)計(jì)包含因子水平，其可以是因子的數(shù)量和/或濃度或者可以轉(zhuǎn)換成因子的實(shí)際數(shù)量和/或濃度。設(shè)計(jì)還包含編號(hào)的試驗(yàn)運(yùn)行。試驗(yàn)運(yùn)行規(guī)定要試驗(yàn)的因子和水平的組合，并且每次運(yùn)行可以對(duì)應(yīng)多孔板上的單個(gè)孔。試驗(yàn)運(yùn)行可以變換到多孔類板上的各個(gè)孔上。
如文中使用那樣，術(shù)語(yǔ)“預(yù)處理”和“預(yù)處理的”指的是對(duì)表面或其它材料添加官能團(tuán)，它們化學(xué)上參與隨后和試劑固定材料(即生物相容聚合物)形成的共價(jià)鍵。例如，微量滴定孔的表面可以受到氨基處理以形成富胺表面，試劑固定材料可結(jié)合在該富胺表面上。
如文中定義那樣術(shù)語(yǔ)“陣列”、“受器陣列”等是多個(gè)單一的容器例如管或孔，它們配置在有序的排列中，例如按行和列。
如本文定義那樣術(shù)語(yǔ)“表現(xiàn)型的”、“表現(xiàn)型改變”等包括生物體的由遺傳結(jié)構(gòu)或環(huán)境影響決定的可觀測(cè)的物理或生物化學(xué)特征。這包括根據(jù)遺傳和環(huán)境影響之特定特征，例如抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和達(dá)到抗體分泌峰值的時(shí)間的表達(dá)。
如前面說(shuō)明那樣，為了達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)，可能需要單試劑的混合物。例如，和細(xì)胞表面受體結(jié)合并且調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的存活、分化、增殖或成熟的生長(zhǎng)效應(yīng)因子分子包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子、肽、激素和細(xì)胞因子，而它們各又存在許多例子。從而這可能是為達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)尋找和細(xì)胞接觸的正確的生長(zhǎng)效應(yīng)因子或生長(zhǎng)效應(yīng)因子組合的乏味任務(wù)。
本發(fā)明的各實(shí)施例通過(guò)提供一種高通量的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法解決了本領(lǐng)域?yàn)榻o定細(xì)胞類型識(shí)別最優(yōu)試劑的需求。具體地，該下面更詳細(xì)說(shuō)明的系統(tǒng)和方法驗(yàn)證了幾種可能的試劑(例如蛋白胨)的列表并且根據(jù)各種響應(yīng)，例如抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和達(dá)到抗體分泌峰值的時(shí)間，識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的二種或三種蛋白胨的最佳子集。
圖1A和1B是依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的進(jìn)程例子，通過(guò)該進(jìn)程可以識(shí)別能引發(fā)細(xì)胞的表現(xiàn)型上的變化的獨(dú)特混合物和/或單試劑。在下面說(shuō)明的該實(shí)施例中，使用的格式是微孔陣列。這種陣列通常很適宜自動(dòng)化，因?yàn)槿菀踪I到自動(dòng)加樣器和板讀出器。
在流程圖10的第一步驟中，用戶在框100利用商用軟件例如可從SAS Institute(Cary，NC)買到的JMPTM建立試驗(yàn)設(shè)計(jì)或者根據(jù)該系統(tǒng)的軟件已包含的算法生成統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)?？?00的設(shè)計(jì)包括類因子名、因子水平、試驗(yàn)運(yùn)行以及試驗(yàn)運(yùn)行對(duì)類微孔陣列的變換。在框102把該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。用戶接著在框104把特定試劑以及這些特定試劑的濃度和/或數(shù)量輸入到該軟件中。接著在框106把用戶輸入存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。
在框107，用戶可以選擇特定的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。隨后，在框108可以利用一個(gè)軟件程序以產(chǎn)生該特定統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)。設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)可以是例如可以變換成96孔布置的電子表格。具體地，該用來(lái)生成計(jì)算機(jī)表達(dá)的軟件程序把特定試劑的名稱變換成設(shè)計(jì)中的類因子名，把試劑的濃度和/或數(shù)量變換成設(shè)計(jì)中的因子水平，根據(jù)特定試劑以及濃度和/或數(shù)量建立試驗(yàn)運(yùn)行，并且把孔位置變換成特定微孔陣列上的試驗(yàn)運(yùn)行。接著在框110把計(jì)算機(jī)表達(dá)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。
在框112，根據(jù)該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)為機(jī)器人系統(tǒng)生成計(jì)算機(jī)程序。在圖1B的流程圖15中示出的框144，該機(jī)器人系統(tǒng)根據(jù)該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)把試劑分配到各孔中，從而在該微孔陣列的一些選定的孔中產(chǎn)生不同的混合物，包括二和三種試劑的子集。最優(yōu)地，該機(jī)器人系統(tǒng)可以向該微孔陣列中的一些其它孔分配單種試劑。除了試劑添加，該機(jī)器人系統(tǒng)還可以完成回收和沖洗步驟。替代地，可以人工地完成這些步驟中的一部分或全部。通過(guò)諸如藻酸或透明質(zhì)酸的生物相容聚合物這些試劑可以共價(jià)地束縛在孔上或其它培養(yǎng)表面上，或者這些試劑可呈現(xiàn)在溶液中。
一旦已經(jīng)正確地把試劑放到孔中，該機(jī)器人系統(tǒng)在框116把含有完整細(xì)胞的液體分配到該微孔陣列的孔中。在框118獲取指示細(xì)胞的表現(xiàn)型上的改變的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。在框120把獲取的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中，從而使試驗(yàn)數(shù)據(jù)和該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)相鏈接。接著在框122利用一個(gè)包含比較存儲(chǔ)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和存儲(chǔ)的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的算法的處理器以識(shí)別最佳混合物和/或最佳試劑，尤其識(shí)別哪些二或三種試劑的子集引發(fā)期望的生物響應(yīng)(即，引發(fā)細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變)。任選地，可以利用另一個(gè)算法比較多次試驗(yàn)上的試劑混合物或單種試劑的性能以確定趨勢(shì)或模式。在這二種情況中，可以在框124把算法比較的結(jié)果存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中和對(duì)用戶顯示，并且可以周期性地更新比較結(jié)果。
圖1A和1B中示出的數(shù)據(jù)庫(kù)可以是單個(gè)集成的或聯(lián)合的數(shù)據(jù)庫(kù)。在框126，如果需要可以利用最佳混合物組的一個(gè)子集或者最佳試劑組的一個(gè)子集重復(fù)該進(jìn)程的各個(gè)步驟。另外，如果需要，可以利用最佳試劑組和來(lái)自最佳混合物組的試劑的子集的組合子集重復(fù)這些步驟(未示出)。此外，在步驟128可以在改變最佳混合物組中的試劑的濃度和/或數(shù)量下重復(fù)該進(jìn)程的步驟。另外，可以最優(yōu)地使用從框122的算法比較獲取的信息以在框130建立或者修改生物模型。
現(xiàn)參照?qǐng)D2，該流程圖表示依據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施例的一示例進(jìn)程，通過(guò)該進(jìn)程利用來(lái)自圖1B的框122和124的信息可以建立生物模型或者修改已有的模型。在流程圖20的第一步驟中，在框200從各種來(lái)源，例如論文、期刊、書(shū)藉、專家、試驗(yàn)、內(nèi)部信息等等，收集科學(xué)信息?？茖W(xué)信息可以包括但不限于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，細(xì)胞表現(xiàn)型數(shù)據(jù)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)數(shù)據(jù)，關(guān)于細(xì)胞路徑的數(shù)據(jù)，以及它們的組合?？梢栽谝粋€(gè)或更多的數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)這樣的科學(xué)信息。信息可以是計(jì)算機(jī)提取的，例如通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)。
在框202提取的信息和從圖1B的框122識(shí)別的試劑混合物和/或單種試劑比較。根據(jù)該比較可以在框204開(kāi)發(fā)或修改生物模型。該生物模型可以定義該表現(xiàn)型改變涉及到的生物系統(tǒng)以及生物系統(tǒng)之間的任何有關(guān)的交流機(jī)制。例如，在框204可以識(shí)別和細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變關(guān)聯(lián)的特定細(xì)胞路徑、蛋白或基因。在一實(shí)施例中，圖1B中說(shuō)明的處理器還包括第一應(yīng)用程序，用于計(jì)算和識(shí)別的單試劑混合物關(guān)聯(lián)的細(xì)胞表現(xiàn)型改變中所涉及到的細(xì)胞路徑、蛋白或基因的似然性。利用提取的科學(xué)信息確定細(xì)胞路徑、蛋白或基因。
在圖2中，該生物模型可以是計(jì)算機(jī)可執(zhí)行的模型，在框206運(yùn)行該模型，在框208檢查它的精確性并且如果需要在框210加以修改。一旦確定該模型是準(zhǔn)確的，可以在框212使用它。在Fink等的專利No.5,808,918中說(shuō)明生物系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)可執(zhí)行模型的一個(gè)例子，該專利的整個(gè)內(nèi)容收錄作為參考。希望該模型能支持計(jì)算、更新、比較和可視化。
圖3示出對(duì)試劑混合物(M)在生物系統(tǒng)上的作用假設(shè)的細(xì)胞路徑示例模型。在圖3的模型30中，通過(guò)和假設(shè)生物路徑300、302的相互作用試劑混合劑(M)在細(xì)胞上起作用?；旌衔?M)和這些路徑之間的弧代表混合物(M)在這些路徑上的可能作用。假定混合物(M)在細(xì)胞上的整個(gè)作用可以用混合物(M)在這二個(gè)路徑的一個(gè)或更多個(gè)上的作用的組合表達(dá)。如本文采用那樣，通常把細(xì)胞路徑理解成，細(xì)胞成分的集合是和該集合中的每個(gè)細(xì)胞成分按照某種生物機(jī)制受該集合中的一個(gè)或更多的其它細(xì)胞成分的影響相關(guān)的。構(gòu)成特定細(xì)胞路徑的細(xì)胞成分可以從細(xì)胞生物狀態(tài)的任何一個(gè)方面描述，例如從轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，或從翻譯狀態(tài)，或從活動(dòng)狀態(tài)，或者從生物狀態(tài)的混合方面。
細(xì)胞路徑的細(xì)胞成分可以包括mRNA水平，蛋白豐度，蛋白活性，蛋白或核酸改變程度(例如，磷酸化或甲基化)，這些類型的細(xì)胞成分的組合，等等。通過(guò)某些生物機(jī)制每個(gè)細(xì)胞成分受該集合中的至少一個(gè)的其它細(xì)胞成分影響。不論直接地還是間接地，一個(gè)細(xì)胞成分對(duì)另一個(gè)的影響用二個(gè)細(xì)胞成分之間的一條弧表示，并且整個(gè)路徑用一個(gè)把各細(xì)胞成分鏈接到該路徑的弧網(wǎng)表示。
在圖3中，生物路徑300包括蛋白P1(即，例如P1的豐度或活性)以及基因G1、G2和G3(即，例如mRNA轉(zhuǎn)錄水平)。生物路徑300還包括用把P1引到這三個(gè)基因的弧表示的蛋白P1在這三個(gè)基因上的直接或間接的影響。該影響例如可能由于蛋白P1可以和這些基因的啟動(dòng)子結(jié)合并且增加它們的轉(zhuǎn)錄本的豐度而造成。在圖3中還示出細(xì)胞路徑302。在該路徑中，蛋白P2和P3都直接影響基因G?；騁轉(zhuǎn)而可能間接地影響基因G4、G5和G6。
為了確定某些路徑，可以在存在引發(fā)細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的單試劑混合物下測(cè)量特別感興趣蛋白或基因以及細(xì)胞生物狀態(tài)的各個(gè)方面，例如轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、翻譯狀態(tài)或活動(dòng)狀態(tài)。這對(duì)應(yīng)圖1B的框122。在一個(gè)例子中，通過(guò)在存在著識(shí)別的單試劑的混合物下識(shí)別細(xì)胞所表達(dá)的基因和/或蛋白可以識(shí)別細(xì)胞路徑或機(jī)制。在另一個(gè)例子中，通過(guò)在存在著識(shí)別的單試劑的混合物下識(shí)別細(xì)胞上活化的受體可以識(shí)別細(xì)胞路徑或機(jī)制。
圖4示出適于實(shí)現(xiàn)圖1到3說(shuō)明的方法的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例。在方塊圖40中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400示出為在所示的實(shí)施例中包括內(nèi)部部件并且與外部部件鏈接。這些內(nèi)部部件包括和主存儲(chǔ)器404互連的處理器402。在一個(gè)實(shí)例中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400可以是時(shí)鐘速率為200Mhz或更高的并帶有32Mb或更大的主存儲(chǔ)器的英特爾公司的奔騰(Pentium)處理器。外部部件可以包括一個(gè)或更多的硬盤(pán)406，它們典型地和該處理器以及存儲(chǔ)器封裝在一起。外部部件還包括接口板405、微孔板讀出器407以及微孔陣列409，它們一起允許向計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400傳送試驗(yàn)數(shù)據(jù)。外部部件還包括機(jī)器人系統(tǒng)411，其根據(jù)用戶選擇的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)把試驗(yàn)因子，例如圖4中示出的十種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)置入微孔陣列409的受器中。
其它外部部件可包括可以是監(jiān)視器和鍵盤(pán)的用戶接口部件408，連同可以是“鼠標(biāo)”的指點(diǎn)器件410，或其它圖形輸入部件(未示出)。典型地，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400還可以和網(wǎng)絡(luò)鏈路412連接，該鏈路可以是至其它本地計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或因特網(wǎng)的以太網(wǎng)鏈路的一部分。網(wǎng)絡(luò)鏈路412允許計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400和其它計(jì)算機(jī)系統(tǒng)一起共享數(shù)據(jù)和處理任務(wù)。
在存儲(chǔ)器404中裝入若干標(biāo)準(zhǔn)的和業(yè)內(nèi)人士周知的軟件組件以及若干對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例特定的軟件組件。這些軟件組件共同使得計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400根據(jù)本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例的方法工作。這些軟件組件典型地存儲(chǔ)在硬盤(pán)406中。軟件組件414代表操作系統(tǒng)，其負(fù)責(zé)管理計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400和網(wǎng)絡(luò)互連。適用的操作系統(tǒng)的實(shí)例是視窗98或視窗NT。設(shè)置軟件組件415以分析來(lái)自微孔板讀出器407的圖象，而軟件組件416代表系統(tǒng)400上常規(guī)存在的普通語(yǔ)言和功能，以輔助用于實(shí)現(xiàn)專用于該實(shí)施例的方法的程序。可以用來(lái)編程這些分析方法的語(yǔ)言包括Java，但是也可以包括C、C++、Fortran，Visual Basic或其它計(jì)算機(jī)語(yǔ)言。
在一個(gè)實(shí)例中，可以在包括要使用的算法的數(shù)學(xué)軟件包中編程該方法，該以允許方程的符號(hào)輸入和處理的高級(jí)規(guī)范，從而用戶不必程式化地編程各個(gè)方程或算法。這樣的軟件包括可從Mathworks(Natick，MA)買到的Matlab，可從Wolfram Research(Champaign，IL)買到的Mathematica，可從Mathsoft(Seattle，WA)買到的S-Plus，可從Mathsoft(Cambridge，MA)買到的MathCAD，以及可從RFoundation買到的“R”。從而，軟件組件418代表按過(guò)程式語(yǔ)言或符號(hào)軟件包編程的方法。
在圖4的系統(tǒng)中，軟件組件418還包括若干如圖5的方塊圖50示出那樣彼此交互的軟件組件。軟件組件500代表數(shù)據(jù)庫(kù)，其最好是一個(gè)含有操作計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400所需的數(shù)據(jù)的集成或聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)。這種數(shù)據(jù)最好包括統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、算法結(jié)果、測(cè)試的特定試劑的名稱、測(cè)試的試劑的量和/或濃度、以及試驗(yàn)中要使用的孔的位置。
軟件組件502代表用戶接口(UI)，其最好是圖形用戶接口(GUI)，它是表示操作系統(tǒng)，例如視窗2000或X11的圖形方式。用戶接口502為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)400的用戶提供有關(guān)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)、專用試劑、試劑的濃度和/或量、以及試驗(yàn)數(shù)據(jù)可選的控制和輸入。該用戶接口還可以包括用于從硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器406，從可移動(dòng)媒體(例如CD-Rom)，或者從在諸如互聯(lián)網(wǎng)的網(wǎng)絡(luò)上和該直接系統(tǒng)通信的不同計(jì)算機(jī)系統(tǒng)裝入例如試驗(yàn)數(shù)據(jù)的信息的手段。
軟件組件504代表可以稱為“UI服務(wù)器”的控制軟件，其控制該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的其它軟件組件。軟件組件506代表包括執(zhí)行這些分析方法的算法的數(shù)據(jù)簡(jiǎn)化和計(jì)算組件。例如，構(gòu)件506可以包括比較獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)以識(shí)別最佳混合物組和/或最佳試劑的算法。數(shù)據(jù)可被輸入到軟件中并且自動(dòng)地和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)鏈接，從而數(shù)據(jù)是被完全注釋的并且對(duì)于統(tǒng)計(jì)分析是準(zhǔn)備就緒的。另外，組件506可以包括對(duì)多次試驗(yàn)比較混合物或試劑的性能以確定趨勢(shì)或模式的算法，可存儲(chǔ)該趨勢(shì)或模式并且若需要可周期地更新。在一實(shí)施例中，軟件組件506包括線性回歸算法。這是一種對(duì)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)中使用的每種特定試劑估計(jì)系數(shù)的方法。
軟件組件418還可以包括用于生成統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)的軟件組件508，以及用于機(jī)器人系統(tǒng)的、根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)500中存儲(chǔ)的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)把試劑正確地置入陣列409的各孔中的軟件組件510。例如，用戶可以通過(guò)用戶接口502選擇選項(xiàng)以產(chǎn)生計(jì)算機(jī)文件，這些文件可以輸入到機(jī)器人樣本準(zhǔn)備平臺(tái)，例如Tecan Genesis的Biomek FX、Biomek2000中或者任何類似平臺(tái)中。還可以利用這些計(jì)算機(jī)文件自動(dòng)地準(zhǔn)備微孔陣列上的正確試驗(yàn)條件，培養(yǎng)細(xì)胞，以及完成液體分配、液體回收或清洗步驟以進(jìn)行表現(xiàn)型的化驗(yàn)。
還可以在遠(yuǎn)離實(shí)際進(jìn)行試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室的顧客位置處實(shí)現(xiàn)上面說(shuō)明的方法。這可能涉及基于環(huán)球網(wǎng)(web)的接口或者向顧客分發(fā)胖客戶軟件應(yīng)用程序。試驗(yàn)室和顧客之間的交互水平可以是不同的。例如，顧客可以完成控制該進(jìn)程，或者作為可替代方案，顧客只能周期地就獲得最優(yōu)試劑混合物的進(jìn)展接收來(lái)自實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告。
現(xiàn)參照?qǐng)D6，圖中示出示例的試驗(yàn)孔60和65，每個(gè)孔包括設(shè)置在陣列(未示出)中的受器10。受器10包括可被預(yù)處理過(guò)的表面12。在一個(gè)實(shí)例中，表面12是氨基等離子體處理過(guò)的，從而形成可以在其上附著試劑固定材料16的富胺表面14。如后面會(huì)進(jìn)一步說(shuō)明的那樣，試劑固定材料16最好是和胺化表面14偶聯(lián)的生物相容性聚合物。
在示出的實(shí)施例中，單試劑20例如20a-20d的混合物18共價(jià)地固定到試劑固定材料16上。但是，要試驗(yàn)的一些或者全部試劑可以在溶液之中，而不是結(jié)合到培養(yǎng)表面上。在本方法的一個(gè)例子中，單試劑的混合共價(jià)地固定到培養(yǎng)表面上的試劑固定材料上，例如受器表面或受器內(nèi)含有的支架上，在又一例子中，單試劑的混合可以被動(dòng)地吸收到培養(yǎng)表面上。此外，該混合中的一些或者全部單試劑可以在溶液中，并且如前面說(shuō)明那樣適當(dāng)?shù)挠糜谠囼?yàn)的試劑包括但不限于生長(zhǎng)因子，細(xì)胞外基質(zhì)分子，肽，激素和細(xì)胞因子。另外，可以對(duì)孔添加作為試劑的小分子、金屬、螯合劑或酶。
根據(jù)后面更詳細(xì)討論的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)把單試劑20的混合置入各受器10中。如圖6中所示，受器10a中的試劑20a-20d的組成和第二受器10b中由單試劑20e-20h構(gòu)成的組成不同。但是，應(yīng)注意，一個(gè)以上的受器可以包含相同的試劑。例如，一種給定的試劑在由其它試劑的某種組合的包圍下可能對(duì)達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)具有積極的作用，而當(dāng)由不同的試劑組合包圍時(shí)該同一種試劑可能對(duì)達(dá)到期望的細(xì)胞命運(yùn)具有中性作用或者沒(méi)有作用。因此，在和其它試劑的不同組成中提供某種試劑在評(píng)定這些效應(yīng)上是有益的。
再次參照?qǐng)D6，一旦根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)以不同的混合把各試劑置入不同的受器10中，這些混合物18和完整的細(xì)胞22接觸。各試劑20和各細(xì)胞22結(jié)合并且能在接觸的細(xì)胞中產(chǎn)生期望的生物響應(yīng)。根據(jù)獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)確定在該細(xì)胞類型中引發(fā)期望的響應(yīng)時(shí)給定的試劑混合物或者該混合物中各種試劑的效果。該數(shù)據(jù)可以利用包括但不限于免疫細(xì)胞分析、顯微術(shù)或功能分析的方法獲取。
現(xiàn)參照?qǐng)D7至9更詳細(xì)地說(shuō)明統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的各個(gè)方面。尤其參照?qǐng)D7，各受器10示成處于圖7的布局70中，并對(duì)應(yīng)于一個(gè)微孔陣列24，例如由行A-H和列1-12組成的96孔板。如圖7中所示，通過(guò)類因子名表示圖6中的單試劑20或混合物18的身份，其中這些因子是試驗(yàn)中的變量。例如，在圖7中示出的實(shí)施例里，類因子1-10代表欄28中指示的十種單細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。在該實(shí)例中，類因子1是膠原蛋白I，類因子2是膠原蛋白III，等等。這些因子中的每一個(gè)可和一個(gè)或更多的其它因子組合以便為該板布局產(chǎn)生各種混合。
現(xiàn)參照?qǐng)D7中示出的實(shí)施例說(shuō)明圖8A、8B、9A和9B，其中每個(gè)類因子1-10對(duì)應(yīng)于給定濃度或量(即因子水平)的單種試劑。
如圖8A和8B中所示，呈現(xiàn)一種情景，其中把受器10內(nèi)的總液體容積劃分成10個(gè)容積相等的間隔32。96孔板的每個(gè)孔可以包含有全部十個(gè)因子(例如，各個(gè)單試劑)或者包含這些因子的子集。如圖8A中所示，在情景80下，存在全部十個(gè)因子并且所有十個(gè)因子占據(jù)一個(gè)液體間隔32。在圖8A中示出的孔10中的總因子濃度從而為[10/10]＝[1]這對(duì)每個(gè)孔提供等同于[1]的總因子濃度。
圖8B表示同一96孔板上的不同孔情景。在情景85中，只呈現(xiàn)十種因子中的五種。同樣，把液體容積劃分成十個(gè)相等的間隔32。在85中，當(dāng)存在某個(gè)因子時(shí)，用該因子填充液體間隔。但是，在85中，十個(gè)容積間隔中的五個(gè)不充填因子而是填充“位置占有物”例如培養(yǎng)基。在圖8B中，總因子濃度等于[5/10]＝
從而，在圖8B中示出的孔里總因子濃度等同于每個(gè)孔為
。80中的總因子濃度不等于85中的總因子濃度。從而，每個(gè)受器中試劑組的總濃度可以是不同的。另外，在80以及85兩者中，各孔之間單個(gè)因子的濃度是相同的。例如，因子1(其可代表單種膠原蛋白I配體)的濃度在80的孔中以及85的孔中是相同的。
現(xiàn)參照?qǐng)D9A和9B，呈現(xiàn)了另二種情景，其中對(duì)表面化學(xué)要求給予特別考慮。具體地，在這些情景中孔之間保持因子的總密度不變，但僅允許在孔之間改變因子成分。換言之，孔之間因子的濃度可以是不同的，但是每個(gè)孔總體上具有相同量的固定的因子。
如圖9A和9B中所示，根據(jù)存在的因子的數(shù)量劃分給定孔中呈現(xiàn)的總液體容積。同樣，出于簡(jiǎn)明，可以假定一個(gè)因子對(duì)應(yīng)于一個(gè)單種試劑，盡管所示出的實(shí)施例不受一個(gè)單種試劑的限制。如圖9A的情景90所示，存在全部十個(gè)因子并且總因子濃度等于[10/10]＝[1]總因子濃度等同于每個(gè)孔為[1]。
在圖9B的情景95中，只存在十個(gè)因子中的五個(gè)，但是這五個(gè)因子中的每個(gè)因子的液體體積32是圖9A中示出的每個(gè)因子的體積32的二倍。因此，圖9B中示出的總因子濃度和圖9A中示出的總因子濃度相同，即每個(gè)孔的總因子濃度等同于[1]。
從而，每個(gè)受器中試劑的總濃度是相同的。根據(jù)圖9A和9B可以看出，盡管圖9A中示出的孔和圖9B中示出的孔之間的總因子濃度是恒定的，而這些孔之間單個(gè)因子的濃度可以是不同的。具體地說(shuō)，對(duì)于可以用膠原蛋白I表示的因子1，圖9B中的該單試劑的濃度應(yīng)是圖9A中示出的濃度的二倍。從而，在又一些其它實(shí)例中，受器之間各種試劑的濃度可以不同。應(yīng)注意，圖8和9中描述的每種情景是可行的，并且可以用于篩選單試劑的混合物。
上面說(shuō)明的方法利用一種格式例如微孔陣列并列地就它們與給定細(xì)胞類型鍵合并在細(xì)胞中引發(fā)期望的響應(yīng)的能力方面篩選各種試劑的多種不同混合。該方法包括根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)把試劑的不同混合物置入多孔板的一些選定的孔中。該方法還包括把單種試劑置入其它孔中的可任選步驟。
該方法還包括向各個(gè)孔遞送包含細(xì)胞類型的液體樣本。在不同孔中細(xì)胞和樣本之間的適當(dāng)培育時(shí)間之后，可以直接或間接地檢測(cè)細(xì)胞和孔構(gòu)件之間相互作用的證據(jù)。例如，可以利用功能化驗(yàn)、免疫細(xì)胞化學(xué)或顯微方法獲取數(shù)據(jù)，以測(cè)量諸如抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和抗體分泌峰值的響應(yīng)。
供和本發(fā)明的各實(shí)施例一起使用的適合的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)包括但不限于以下設(shè)計(jì)分式因子設(shè)計(jì)、D最優(yōu)設(shè)計(jì)、混合設(shè)計(jì)和Plackett-Burman設(shè)計(jì)。統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)還可以是基于收斂準(zhǔn)則的空間填充設(shè)計(jì)、格柵設(shè)計(jì)或拉丁方格設(shè)計(jì)。
如前面說(shuō)明那樣，試劑可以結(jié)合在培養(yǎng)表面(例如受器表面或支架表面)上或者可在溶液中。例如，在一個(gè)例子中，培養(yǎng)表面(可以是預(yù)處理的)涂著試劑固定材料。希望試劑固定材料是不支持細(xì)胞附著并且可以充當(dāng)培養(yǎng)表面和試劑之間的靈活鏈接或系留的生物相容性聚合物。適當(dāng)聚合物的例子包括諸如聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇、聚羥基乙基異丁烯酸酯、聚丙烯酰胺的合成聚合物和諸如透明質(zhì)酸和藻酸的天然聚合物。
培養(yǎng)表面(例如孔表面)是從以下但不限于以下選擇的聚苯乙烯，聚乙烯乙烯基乙酸酯，聚丙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚環(huán)氧乙烷，玻璃，多硅酸鹽，聚碳酸酯，聚四氟乙烯，碳氟化合物以及尼龍。培養(yǎng)基也可以全部地或部分地包括生物可降解材料例如聚酐，聚乙醇酸，諸如聚乳酸、聚乙醇酸及聚乳酸-乙醇酸共聚物的聚羥酸，聚原酸酯，聚羥基丁酸酯，聚磷氮烯(polyphosphazene)，聚丙基富馬酸酯以及生物可降解聚氨基甲酸乙酯。
還可以預(yù)處理培養(yǎng)表面。例如，可以通過(guò)氨環(huán)境中對(duì)聚合物的等離子放電處理準(zhǔn)備承載伯胺的細(xì)胞培養(yǎng)表面。在一個(gè)例子中，利用標(biāo)準(zhǔn)固定化學(xué)，例如如前用引用的共同待決、共同擁有美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259,797中說(shuō)明那樣，可以把試劑固定材料共價(jià)地附著到這些胺化表面上。
商業(yè)上采用的形成組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯的兩種處理是還稱為電暈放電的大氣等離子體處理和真空等離子體處理，業(yè)內(nèi)人士周知這二種處理。等離子是氣體離子和自由原子團(tuán)的高活性混合物。可以利用氨基等離子體處理或氧/氮等離子體處理形成富胺表面，利用上面引用的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259,797中說(shuō)明的碳二亞胺生物偶聯(lián)物化學(xué)通過(guò)羧基可以在該富胺表面上偶聯(lián)生物相容性聚合物例如透明質(zhì)酸(HA)或藻酸(AA)。即使細(xì)胞培養(yǎng)物中存在高濃度例如10-20％的血清蛋白，所形成的表面也不允許細(xì)胞附著。
一種可以用于通過(guò)試劑固定材料共價(jià)鏈接試劑的預(yù)處理過(guò)的組織培養(yǎng)聚苯乙烯產(chǎn)品的例子是可從Betton Dickinson Labware買到的PRIMARIATM組織培養(yǎng)產(chǎn)品，其是利用對(duì)聚苯乙烯的氧氮等離子體處理形成的并且其造成摻入含有氧和氮的官能基，例如氨基和酰胺基。
利用蛋白/肽上的胺基以及HA或AA上的羧基或者HA或AA上的通過(guò)利用諸如高碘酸鈉的氧化形成的醛基，可以順序地共價(jià)地把諸如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、肽等的試劑偶聯(lián)到HA或AA表面上。
在一個(gè)例子中，通過(guò)E.Junowicz和S.Chanm在Biochimica et.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)上標(biāo)題為“TheDerivatization of Oxidized Polysaccharides for ProteinImmobilization and Affinity Chromatography”發(fā)表的文章中描述的高碘酸鹽過(guò)程可以活化人胎盤(pán)透明質(zhì)酸的末端糖，該文的整個(gè)內(nèi)容收錄作為參考。該過(guò)程必須對(duì)透明質(zhì)酸溶液添加高碘酸鈉或鉀，從而活化末端糖，該末端糖可以和試劑上的自由氨基例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上的末端氨基化學(xué)地交聯(lián)。
在另一個(gè)例子中，生物相容性聚合物例如HA或AA上的自由羧基利用作為交聯(lián)劑試劑的碳二亞胺可以化學(xué)地和該試劑上的自由氨基交聯(lián)。業(yè)內(nèi)人士周知其它的標(biāo)準(zhǔn)固定化學(xué)術(shù)，它們可以用于使培養(yǎng)表面和生物相容性聚合物結(jié)合并且使生物相容性聚合物和試劑結(jié)合。在M.Dekker，NY，1991出版的Richard F.Taylor編輯的“ProteinImmobilizationFundamentals and Applications”(其整個(gè)內(nèi)容收錄作為參考)或者上面引用的共同待決美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259,797中提供補(bǔ)充的細(xì)節(jié)。
利用標(biāo)準(zhǔn)的固定化學(xué)術(shù)可以通過(guò)生物相容性聚合物把試劑約束到胺化組織培養(yǎng)表面上或者可以通過(guò)生物相容性聚合物約束到羧化表面或羥化表面上。附著試劑的例子包括溴化氰、琥珀酰亞胺，醛，甲苯磺酰氯，抗生物素蛋白-生物素，可光致交聯(lián)試劑，環(huán)氧化物和順丁烯二酰亞胺。同樣，應(yīng)注意這些試劑可以呈現(xiàn)在溶液中不必和培養(yǎng)表面結(jié)合。
如前面說(shuō)明那樣，本方法提供包含在一些選定受器中的與培養(yǎng)表面結(jié)合或者可以處在溶液中的試劑混合物。此外，其它受器可以含有單獨(dú)試劑，并且可以在任意期望的比例下組合這些試劑?？梢岳缤ㄟ^(guò)要分配到受器里的組成中的試劑濃度控制各受器中存在的不同試劑的相對(duì)數(shù)量。
另外，在通過(guò)生物相容性聚合物使試劑共價(jià)地附著到受器表面上的情況下，可以通過(guò)調(diào)整結(jié)合到培養(yǎng)表面上的生物相容性聚合物的能力控制裝載密度。這可以通過(guò)控制聚合物上的可以和試劑起反應(yīng)的活性基團(tuán)的數(shù)量或者通過(guò)控制培養(yǎng)表面上的生物相容性聚合物的分子密度實(shí)現(xiàn)。此外，可以首先單獨(dú)地使試劑和生物相容性聚合物(即系繩)鏈接，接著可以在期望的比例下混合這些“裝入的”系繩并且附著到預(yù)處理后的基底上。
試劑可以在溶液中和/或和表面結(jié)合。例如，可以通過(guò)生物相容性聚合物把各試劑共價(jià)地固定到最好是富胺的預(yù)處理過(guò)的組織處理表面上。替代地，可以通過(guò)表面對(duì)試劑的被動(dòng)吸收把這些試劑固定到受器表面上。還可以把各試劑預(yù)先固定到固體支持例如珠上，然后再把珠添加到受器上。隨后可以檢測(cè)和受體中的珠接觸的細(xì)胞類型的響應(yīng)。可以組合含有單種試劑的珠以形成試劑混合物。替代地，可以將單試劑的混合物固定到珠上。
還可以把各試劑固定到或者滲透到支架上，可把支架放到受器中并且接著和含有細(xì)胞的液體接觸。在共同待決、共同擁有的于2002年9月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259,817中描述了供上面說(shuō)明的實(shí)施例使用的適當(dāng)支架以及在其上或在其中固定試劑的方法，該申請(qǐng)的整個(gè)內(nèi)容收錄作為參考。
上面說(shuō)明的各實(shí)施例中使用的受器可以取任何有用的形式，但希望是微孔或管。這種微量滴定孔和管的配置是特別有用的并且允許在有效和方便的方式下同時(shí)自動(dòng)進(jìn)行大量樣本的檢驗(yàn)。由于自動(dòng)加樣器和板讀出器，微量滴定孔能高度自動(dòng)化。也可以使用其它固相，尤其是其它塑性固體支持。
在一個(gè)例子中，這些受器構(gòu)成96孔微量滴盤(pán)定板(即，微孔陣列)的各個(gè)孔。業(yè)內(nèi)人士周知用于試劑添加和清洗步驟的自動(dòng)移液設(shè)備以及用于這種微量滴定板的已有彩色讀出器。這種自動(dòng)部件的一個(gè)例子包括移液臺(tái)和檢測(cè)設(shè)備(例如板讀出器)，其中該移液臺(tái)能在恒溫環(huán)境(即溫控環(huán)境)下在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)順序地完成對(duì)各孔添加和移出試劑的操作。
如前面說(shuō)明那樣，這些實(shí)施例中使用的試劑包括生長(zhǎng)效應(yīng)因子分子，它們把受體固定到細(xì)胞表面上或者通過(guò)離子通道或遷移吸收受體并且調(diào)節(jié)目標(biāo)細(xì)胞或者組織的生長(zhǎng)、復(fù)制或分化。在一個(gè)例子中，這些試劑是細(xì)胞粘附配體和/或外來(lái)因子。在另一些例子中。這些試劑可以是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白片段，肽，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子以及它們的組合，包括下面更詳細(xì)說(shuō)明的包含著用來(lái)優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的二種和三種蛋白胨的集和子集的例子。
優(yōu)選的試劑是生長(zhǎng)因子，細(xì)胞外基質(zhì)分子，細(xì)胞因子，肽，激素，金屬，螯合劑或酶。生長(zhǎng)因子的例子包括但不限于脈管內(nèi)皮衍生生長(zhǎng)因子(VEGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生成因子(TGFα，TGFβ)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，肝素結(jié)合因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子I或II，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，紅細(xì)胞生成素神經(jīng)生長(zhǎng)因子，骨形成蛋白，肌肉形成蛋白，以及業(yè)內(nèi)人士知道的其它因子，在Springer-Verlag，NY出版的由M.B.Sporn和A.B.Roberts編輯的“Peptide Growth Factors and Their Receptors I”一書(shū)中說(shuō)明其它的適用生長(zhǎng)因子，該書(shū)的整個(gè)內(nèi)容收錄作為參考。
可以利用業(yè)內(nèi)人士周知的方法從組織中分離這些生長(zhǎng)因子。例如，可以通過(guò)重組手段使生長(zhǎng)因子從組織中分離或者產(chǎn)生生長(zhǎng)因子。表皮生長(zhǎng)因子可以從鼠的頜下腺分離并且Genentech公司(San Francisco，CA)重組地產(chǎn)生TGF-β。還可以從以下供應(yīng)商買到天然的和重組形式的其它生長(zhǎng)因子，例如Sigma Chemical公司(St.Louis，MO)，R&D系統(tǒng)公司(Minneapolis，MN)，BD Biosciences公司(San Jose，CA)以及Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。
各實(shí)施例中使用的細(xì)胞外基質(zhì)分子包括玻連蛋白，腱生蛋白，血小板反應(yīng)蛋白，纖連蛋白，層粘連蛋白，膠原蛋白和蛋白多糖。在Analytical Biochemistry 1661-13(1987)登出的Kleinman等的標(biāo)題為“Use of Extracellular Matrix Components for Cell Culture”一文中描述了其它的細(xì)胞外基質(zhì)分子。
可用于上面說(shuō)明的方法中的其它試劑包括細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素、GM-集落刺激因子以及諸如胰島素的激素。在前面引用的文獻(xiàn)中說(shuō)明這些試劑并且是市場(chǎng)上可買到的。
各實(shí)施例中使用的細(xì)胞可以是任何可潛在地響應(yīng)試劑的或者生長(zhǎng)需要試劑的細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以從建立的細(xì)胞系中得到或者從隔離的組織分離。合適的細(xì)胞包括大部分上皮和內(nèi)皮細(xì)胞類型，例如實(shí)質(zhì)細(xì)胞，諸如肝細(xì)胞，胰島細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，外分泌腺細(xì)胞，腸源細(xì)胞，膽管細(xì)胞，甲狀旁腺細(xì)胞，甲狀腺細(xì)胞，腎上腺-小丘腦-垂體入口的細(xì)胞，心肌細(xì)胞，腎上皮細(xì)胞，腎小管細(xì)胞，腎基膜細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，血管細(xì)胞，形成骨、軟骨、平滑肌和骨胳肌的細(xì)胞。
其它有用的細(xì)胞可包括干細(xì)胞，它們可響應(yīng)選定的試劑混合物歷經(jīng)表現(xiàn)型上的改變。另一些適當(dāng)?shù)募?xì)胞包括血細(xì)胞，臍帶血衍生細(xì)胞，臍帶血衍生干細(xì)胞，臍帶血衍生先祖細(xì)胞，臍帶衍生細(xì)胞，胎盤(pán)衍生細(xì)胞，骨髓衍生細(xì)胞以及來(lái)自羊水的細(xì)胞。利用受器例如96孔微量滴定板的孔中的試劑可以遺傳工程化和/或培養(yǎng)這些細(xì)胞。這些細(xì)胞的培養(yǎng)可以采用業(yè)內(nèi)人士知道的許多細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的任何技術(shù)，例如在Wiley-Liss公司(NY，1994)出版的Freshney的“Cell Culture，A Mannal of Basic Technique”，第三版中說(shuō)明的技術(shù)。業(yè)內(nèi)人士周知其它細(xì)胞培養(yǎng)基和技術(shù)并且也可以用于上面說(shuō)明的本發(fā)明的實(shí)施例中。
可以在溶液中的或者附著到諸如微量滴定板的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)容器上的試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞。還可以利用約束到珠或纖維(最好直徑在10微米量級(jí))上試劑在懸浮液中培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)添加到培養(yǎng)基中，這些顆粒會(huì)附著在細(xì)胞上，從而刺激它們的生長(zhǎng)并且提供附著信號(hào)。
在一種特定應(yīng)用中，上面說(shuō)明的系統(tǒng)和方法可應(yīng)用于根據(jù)各種響應(yīng)識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的二種或三種蛋白胨的最佳子集。從列出幾種可能的蛋白胨開(kāi)始，根據(jù)各種響應(yīng)，例如抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和達(dá)到抗體分泌峰值的時(shí)間，可以開(kāi)發(fā)識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的二種或三種蛋白胨的最佳子集的優(yōu)化策略。以下刊物進(jìn)一步討論優(yōu)化技術(shù)發(fā)表于Journal of Bimolecular Screening，5(4)213-225，August 2000的Taylor等人的“Automated Assay Optimization with IntegratedStatistics And Smart Robotics”；發(fā)表于Drug Discovery Today，6(12)637-646，June 15，2001的Wolcke等人的“Miniaturized HTSTechnologies-μHTS”；以及發(fā)表于Drug Delivery Today，1(7)277-286，July 1996的Lutz等人的“Experimental Design ForHigh-Throughput Screening”，它們的整個(gè)內(nèi)容各收錄作為參考。
可以作為一種自動(dòng)培養(yǎng)基優(yōu)化技術(shù)提供該系統(tǒng)和方法，以使用戶能利用MPM/CATSBA軟件和機(jī)器人液體處理平臺(tái)優(yōu)化培養(yǎng)基成份(即因子)。利用這些特定因子，該軟件可以自動(dòng)建立多孔板格式下的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)。接著該軟件生成必要的文件以利用機(jī)器人液體處理平臺(tái)(例如，Biomek FX，Biomex 2000，Tecan Genesis，或任何類似平臺(tái))準(zhǔn)備正確的試驗(yàn)條件。接著可從利用該軟件以及其駐留的數(shù)據(jù)庫(kù)自動(dòng)分類和分析各種格式的數(shù)據(jù)(即，熒光性，吸收性，細(xì)胞計(jì)數(shù)，等等)。該軟件的用戶可以接著在自動(dòng)形式下完成所有相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析并且自動(dòng)產(chǎn)生所有相關(guān)的報(bào)告并存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。在完成所有相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析后，用戶具有為了元分析和數(shù)據(jù)挖掘組合來(lái)自多次試驗(yàn)的結(jié)果的能力。
在該例子中，該系統(tǒng)和方法在第一步驟中啟動(dòng)基本細(xì)胞培養(yǎng)條件的化驗(yàn)過(guò)程和判定。具體地說(shuō)，用戶通過(guò)GUI在該軟件(即MPM/CATSBA)中規(guī)定因子(即蛋白胨)以及它們的濃度，如圖1A的框100中指出那樣。如框107中所指示，用戶選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，該軟件自動(dòng)地建立包含特定因子和它們的濃度的正確試驗(yàn)方案，如框108中指出那樣。接著用戶在該軟件中選擇一個(gè)選項(xiàng)，該選項(xiàng)自動(dòng)地建立可通過(guò)機(jī)器人樣本準(zhǔn)備平臺(tái)(例如，Biomek FX，Biomek 2000，Tecan Genesis，或任何類似平臺(tái))輸入的必要的計(jì)算機(jī)文件，如框112指出那樣。
在第二步驟中，在96孔板中提供稀釋系列，以便一次一個(gè)地確定蛋白胨的最優(yōu)濃度。如圖1B的框114中指出那樣，利用這些計(jì)算機(jī)文件自動(dòng)地在該96孔板上準(zhǔn)備正確的試驗(yàn)條件。一旦正確地把各試劑置入各孔中，在框116該機(jī)器人系統(tǒng)把含有全部細(xì)胞的液體分配到該微孔陣列的各孔中。化驗(yàn)結(jié)果輸入到該軟件中并且自動(dòng)地和各試驗(yàn)的描述鏈接，從而數(shù)據(jù)是完全被注釋的從而準(zhǔn)備用于統(tǒng)計(jì)分析。
具體地，在框118獲取將指示細(xì)胞的表現(xiàn)型改變的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并在框120將該試驗(yàn)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中，從而使試驗(yàn)數(shù)據(jù)與設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)鏈接。接著在框122，利用一個(gè)包含用于比較存儲(chǔ)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)與存儲(chǔ)的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的算法的處理器，以識(shí)別引發(fā)期望的生物響應(yīng)(即在細(xì)胞中引發(fā)表現(xiàn)型改變)的最佳濃度。該算法的比較結(jié)果可在框124存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中并對(duì)用戶顯示，并且可以周期地對(duì)其更新。
96孔板中產(chǎn)生的試驗(yàn)用于識(shí)別二種和/或三種蛋白胨的最佳子集，并在搖瓶中檢驗(yàn)。即，96孔板中的最優(yōu)試驗(yàn)確定最佳子集中的蛋白胨的最佳濃度，用搖瓶驗(yàn)證。
在搖瓶檢驗(yàn)后得出相對(duì)于客戶培養(yǎng)基的最佳子集/最佳濃度以及96孔板的適當(dāng)對(duì)照。再次回到圖1A和1B，包含客戶培養(yǎng)基以及所使用的適當(dāng)對(duì)照的數(shù)據(jù)庫(kù)可以是一個(gè)集成的或者聯(lián)合的數(shù)據(jù)庫(kù)。在框126，可以利用最佳混合的子集或者最佳試劑組的子集重復(fù)該進(jìn)程的各個(gè)步驟。另外，如果需要，可以利用最佳試劑組的組合子集以及來(lái)自最佳混合的試劑組子集重復(fù)這些步驟。另外，在框128，可以在改變最佳混合組中的各試劑的濃度和/或數(shù)據(jù)的情況下重復(fù)該進(jìn)程的各步驟，以通過(guò)補(bǔ)充的驗(yàn)證和質(zhì)量控制(QC)加大最佳條件。可以最優(yōu)地使用框122中的從算法比較獲取的任何信息以在框130建立或修改生物模型。
用戶可以在自動(dòng)方式下對(duì)該軟件應(yīng)用提供的信息進(jìn)行所有相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析。接著可以生成報(bào)告和把結(jié)果存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果，用戶可以回到第一步驟以開(kāi)始下次試驗(yàn)或者可能進(jìn)入加大最佳培養(yǎng)基配方的操作。
在該特定例子中，這些試劑或因子限于蛋白胨，但是上面說(shuō)明的系統(tǒng)和方法通?？蓱?yīng)用于可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基添加的任何試劑或因子。在上面說(shuō)明的實(shí)施例的自動(dòng)優(yōu)化應(yīng)用中，下面更詳細(xì)說(shuō)明的結(jié)果表采用八蛋白胨組，但是可以改變蛋白胨的數(shù)量，盡管這會(huì)要求修改具體的設(shè)計(jì)參數(shù)但是不會(huì)影響整個(gè)策略。
該特定的例子指向檢測(cè)二種或三種蛋白胨的最佳子集組，但是最佳子集評(píng)估中包括的蛋白胨的數(shù)量可以增加或者減少，盡管這會(huì)如上面指出那樣可能要求修改特定設(shè)計(jì)參數(shù)不過(guò)策略是一樣的。另外，下面的例子和96孔板相結(jié)合，但是板的實(shí)際格式是可改變而整個(gè)策略仍是有效的。如果使用更大或更小的板，需要相應(yīng)地修改設(shè)計(jì)。
在該例中，該系統(tǒng)和方法指向每次二種或三種蛋白胨的蛋白胨以確定哪些子集最佳。在八種蛋白胨下，其中每次提供至少二種不同的濃度水平，如表1中所示該實(shí)施例可完成所有高濃度和低濃度(即高/高和低/低)下的雙式組合(即8中選2＝28)，并留下幾個(gè)孔用作對(duì)照。另外，由于蒸發(fā)不使用外側(cè)的孔。例如，在表1中，在3.0mg/mL(低濃度CG大豆)和4.0mg/mL(高濃度CG大豆)的濃度下評(píng)估CG大豆，而其余的蛋白胨例如植物蛋白胨濃度分別為9.0mg/mL(即低濃度植物蛋白胨)和10.0mg/mL(即高濃度植物蛋白胨。)
在第二板上，如表2中所示，該系統(tǒng)和方法指向其中一塊板上每種蛋白胨各個(gè)單種濃度下的三式組合(即8中選3＝56)，并且提供幾個(gè)孔用作對(duì)照。每個(gè)板上的對(duì)照允許板的比較并且允許補(bǔ)充的統(tǒng)計(jì)分析。例如，在表2中，CG大豆?jié)舛葹?.0mg/mL(即單種CG大豆?jié)舛?下和別的蛋白胨，例如9.0mg/mL濃度下的植物蛋白胨(即單種植物蛋白胨濃度)和2.0mg/mL濃度的植物蛋白胨UF(即單種植物蛋白胨濃度)，一起被評(píng)估。
在表1中示出的示例陣列中，從八種蛋白胨的組中檢測(cè)二種蛋白胨的最佳子集，其中一些控制孔和重復(fù)孔來(lái)自板2。
表1


在表1中，評(píng)估中使用八種蛋白胨，包括CG大豆，植物蛋白胨，植物蛋白胨UF、3，精選大豆蛋白胨，小麥，酵母分離物(yeastolate)以及酵母分離物plus。在低濃度或者高濃度下包含各種蛋白胨。例如，在包括充當(dāng)?shù)蜐舛鹊?.0mg/mL以及充當(dāng)高濃度的4.0mg/mL的濃度下使用CG大豆。這些值可以在蛋白胨之間改變，如作為對(duì)比所示，在包括充當(dāng)?shù)蜐舛鹊?.0mg/mL以及充當(dāng)高濃度的10.0mg/mL的濃度下使用植物蛋白胨?？譏P編號(hào)指示其中放入指出的蛋白胨濃度組合的微孔陣列的孔。
如表1中所示，根據(jù)自動(dòng)過(guò)程中在圖1A的步驟100-112中建立的計(jì)算機(jī)表達(dá)，機(jī)器人系統(tǒng)把選定的期望蛋白胨濃度的組合置入微孔陣列中的各孔中。如上面指出那樣，表1代表一種使用八種蛋白胨的應(yīng)用，其為把所有二種蛋白胨(即，從8選2＝28)的低濃度和高濃度的雙式組合置入單個(gè)板的各孔中產(chǎn)生充足的空間。
該系統(tǒng)和方法接著獲取指示所接觸的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。具體地，在該例子，指示數(shù)據(jù)包括抗體的生長(zhǎng)(即增殖)和分泌(即IgG分泌/細(xì)胞增殖)。接著該系統(tǒng)可以以和試驗(yàn)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)相關(guān)聯(lián)的方式把試驗(yàn)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)到數(shù)據(jù)庫(kù)中。這樣做，可以接著應(yīng)用一個(gè)算法比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)以識(shí)別最佳蛋白胨組合，并且更具體地識(shí)別一種最佳的雙蛋白胨組合以包含在后面更詳細(xì)說(shuō)明的子集濃度評(píng)估中。接著可以對(duì)來(lái)自八種蛋白胨的組中的三種蛋白胨的組合重復(fù)該過(guò)程。
在表2中示出板2的示例陣列，其中在以來(lái)自板1的若干控制孔和重復(fù)孔作為補(bǔ)充的情況下檢測(cè)三種蛋白胨的最佳子集。
表2


在表2中，評(píng)估中再次使用表1的八種蛋白胨，包括CG大豆，植物蛋白胨，植物蛋白胨UF，3，精選大豆蛋白胨，小麥，酵母分離物以及酵母分離物plus。在該評(píng)估中，在每種蛋白胨各為單種濃度下包含各種蛋白胨。例如，在3.0mg/mL的單濃度值下使用CG大豆。如上面指出那樣，蛋白胨之間濃度值可以改變，如對(duì)植物蛋白胨比較示出那樣，在9.0mg/mL的單濃度值下使用該蛋白胨。還如上面指出那樣，孔ID編號(hào)指示其中置入指示的蛋白胨組合濃度的微孔陣列孔。
如圖2中示出那樣，機(jī)器人系統(tǒng)再次在自動(dòng)過(guò)程中根據(jù)圖1A的步驟100-112建立的計(jì)算機(jī)表達(dá)把期望的蛋白胨濃度選定組合置入微孔陣列的各孔中。如上面指出那樣，表2代表一種使用八種蛋白胨的應(yīng)用，其為把各具有單濃度的三種蛋白胨的三式組合(即從8選3＝56)置入單個(gè)板的各孔中產(chǎn)生充足的空間。
如表1一樣，該系統(tǒng)和方法接著獲取指示相接觸的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并在與該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)相鏈接的情況下把試驗(yàn)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。這樣做，可以接著應(yīng)用一個(gè)算法比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)以識(shí)別最佳蛋白胨組合，并且更具體地識(shí)別三種最佳三蛋白胨組合以包含在后面更詳細(xì)說(shuō)明的子集濃度評(píng)估中。
在該例子，應(yīng)用該系統(tǒng)和方法以確定從八種的組中選出的二種和三種蛋白胨的子集組合的最優(yōu)濃度(即優(yōu)化)。上面的最佳子集試驗(yàn)的結(jié)果提供數(shù)個(gè)二種或三種蛋白胨的組合，它們一起被確定為是這些檢驗(yàn)中最佳的。如下面更詳細(xì)說(shuō)明那樣，會(huì)對(duì)這些蛋白胨的組合進(jìn)行另一次自動(dòng)試驗(yàn)，在該試驗(yàn)中利用圖1B的框126和/或128中指出的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法為每個(gè)子集確定最佳濃度。
下面的表3的方案是一個(gè)用于優(yōu)化板的通用模板，以檢查從表1產(chǎn)生的一個(gè)雙蛋白胨的最佳子集以及從表2產(chǎn)生的三個(gè)三蛋白胨的最佳子集。不同集中的蛋白胨可重疊。對(duì)于每個(gè)蛋白胨集，在板中布署一個(gè)中央混成設(shè)計(jì)。利用該板的內(nèi)部的60個(gè)孔，可以對(duì)二種和三種蛋白胨的最佳子集評(píng)估最優(yōu)濃度。
表3


在表3中，各值反映所使用的蛋白胨的編碼等級(jí)。表3中的蛋白胨是按類因子FO1、FO2、......、F11指定的。盡管在該例中只包括八種蛋白胨，在不同的子集中蛋白胨可以重疊。在該例子中，F(xiàn)O1和FO2代表從表1確定的現(xiàn)在要優(yōu)化的二種蛋白胨的該最佳子集中所包含的蛋白胨。子集FO3-FO5、FO6-FO8以及FO9-F11代表從表2確定的現(xiàn)在要優(yōu)化的三種蛋白胨的三個(gè)最佳子集。
表3的孔ID編號(hào)指示其中置入所指出的蛋白胨組合的濃度的微孔陣列的孔，列“設(shè)計(jì)ID”指示哪些子集濃度是在改變的。例如該設(shè)計(jì)ID列對(duì)于所有其中改變二種蛋白胨的子集的濃度的孔具有等于1的值。該設(shè)計(jì)ID列對(duì)于其中改變?nèi)N蛋白胨的三個(gè)子集的濃度的孔分別具有為2、3和4的值(即，F(xiàn)03-F05，F(xiàn)06-F08，以及F09-F11)。在表3中出現(xiàn)NA，則說(shuō)明在該孔中不包含所指示的因子或蛋白胨。
參照表3，第一列指示96孔板中每次試驗(yàn)運(yùn)行的孔ID編號(hào)。在該例中存在60次運(yùn)行。表3中標(biāo)記為“F01、F02、......、F11”的列中的數(shù)字(-1.41，-1，0，1，1.41，等)分別表示該因子或蛋白胨的等級(jí)或濃度的編碼值。根據(jù)收集到的信息，對(duì)每種蛋白胨判定可能的最優(yōu)濃度的范圍，在該范圍內(nèi)相信存在著最優(yōu)濃度。利用下面將更詳細(xì)說(shuō)明的例如響應(yīng)表面方法學(xué)(RSM)的技術(shù)對(duì)該范圍分配相對(duì)值。
在該例中，對(duì)于列F01和F02，值-1.41和1.41分別對(duì)應(yīng)于被假定跨越最前二種蛋白胨的可能的最優(yōu)濃度范圍的最大濃度和最小濃度。蛋白胨的和編碼值-1、0、1對(duì)應(yīng)的濃度位于最大和最小濃度-1.41和1.41之間，并且可以通過(guò)簡(jiǎn)單的線性變換確定。例如，編碼值零對(duì)應(yīng)于最大和最小濃度之間的中間濃度。
對(duì)于列F03到F11，值-1.68和1.68對(duì)應(yīng)于被假定為跨越按F03至F11分配的相應(yīng)的蛋白胨的可能最優(yōu)濃度范圍的最大濃度和最小濃度。可以如上面說(shuō)明那樣確定和-1、0以及1對(duì)應(yīng)的濃度。后面會(huì)更詳細(xì)地說(shuō)明定義這種范圍并且接著分配相對(duì)值的過(guò)程的一個(gè)具體例子。
例如，如果從表1發(fā)現(xiàn)二種蛋白胨的最佳組合是濃度為3.0mg/mL的CG大豆和濃度為9.0mg/mL的植物蛋白胨，則可以接著把這些值應(yīng)用到表3的優(yōu)化。如上面對(duì)表3指出的那樣，F(xiàn)01和F02代表包含在從表1確定的要被優(yōu)化的二種蛋白胨的最佳子集中的蛋白胨。
在優(yōu)化試驗(yàn)中，確定每種蛋白胨的濃度范圍，確信最優(yōu)濃度存在于該范圍中并且對(duì)該范圍分配相對(duì)值。在確定該范圍時(shí)，可以把目前的最佳值(即來(lái)自表1)選成為中心值，并且接著可以選擇更大和更小的值，以便為了探查最優(yōu)值而定義圍繞這些當(dāng)前最佳值的范圍。該范圍應(yīng)足夠?qū)捯园▽?duì)真的最優(yōu)選值的最佳估計(jì)，但又應(yīng)足夠窄以提供好的統(tǒng)計(jì)模型。在許多應(yīng)用中這可能要求熟練用戶，例如細(xì)胞生物學(xué)家和統(tǒng)計(jì)學(xué)家進(jìn)行輸入。
對(duì)于上面的例子，可以根據(jù)下面定義的范圍對(duì)用于表3中的CG大豆的范圍規(guī)定相對(duì)值。
X0＝0→對(duì)應(yīng)于3.0mg/mL濃度的CG大豆X-1＝-1→對(duì)應(yīng)于2.0mg/mL濃度的CG大豆X+1＝+1→對(duì)應(yīng)于4.0mg/mL濃度的CG大豆其中X0代表用于CG大豆的范圍的中心，X-1代表下部范圍中的增量，而X+1代表上部范圍中的增量。編碼值中一個(gè)單位的變化為濃度值中的1mg/mL，從而X-1.41＝-1.41→3.0-(1.41×1.0)＝1.59mg/mL濃度的CG大豆X+1.41＝+1.41→3.0+(1.41×1.0)＝4.41mg/mL濃度的CG大豆其中X-1.41代表CG大豆的范圍的下界，而X+1.41代表該范圍的上界。同樣，對(duì)于植物蛋白胨的值，可以應(yīng)用相同的過(guò)程。
Y0＝0→對(duì)應(yīng)于9.0mg/mL濃度的植物蛋白胨Y-1＝-1→對(duì)應(yīng)于7.0mg/mL濃度的植物蛋白胨Y+1＝+1→對(duì)應(yīng)于11mg/mL濃度的植物蛋白胨編碼值中一個(gè)單位的變化為濃度值中的2mg/mL濃度的植物蛋白胨，從而Y-1.41＝-1.41→9.0-(1.41×2.0)＝6.18mg/mL濃度的植物蛋白胨Y+1.41＝+1.41→9.0+(1.41×2.0)＝11.82mg/mL濃度植物蛋白胨對(duì)表2中找到的三種蛋白胨的最佳組合應(yīng)用類似的過(guò)程。如前面對(duì)表3指出那樣，子集F03-F05、F06-F08和F09-F11代表從表2確定的要進(jìn)行優(yōu)化的三種蛋白胨的三個(gè)最佳子集。
例如，如果從表2找出三種蛋白胨的最佳組合是濃度為3.0mg/mL的CG大豆、濃度為2.0mg/mL的植物蛋白胨UF以及濃度為7.0mg/mL的小麥，則可以接著對(duì)表3的優(yōu)化應(yīng)用這些值。如前面一樣，對(duì)于應(yīng)當(dāng)含有最優(yōu)值的區(qū)段選擇一個(gè)作為最佳估計(jì)的范圍。下面給出對(duì)這三個(gè)蛋白胨范圍之一的示例計(jì)算?？梢愿鶕?jù)如下定義的范圍對(duì)表3中用于小麥的范圍分配相對(duì)值。
Z0＝0對(duì)應(yīng)于濃度為7.0mg/mL的小麥
Z-1＝-1對(duì)應(yīng)于濃度為6.5mg/mL的小麥Z+1＝+1對(duì)應(yīng)于濃度為7.5mg/mL的小麥從而編碼值上中一個(gè)單位的變化為濃度值中的0.5mg/mL，由此，Z-1.68＝-1.68→7.0-(1.68×0.5)＝7.0-.84＝6.16Z+1.68＝+1.68→7.0+(1.68×0.5)＝7.0+.84＝7.84在上述實(shí)施例的許多應(yīng)用中，在二個(gè)和三個(gè)變量的優(yōu)化試驗(yàn)里可以為同一個(gè)因子選擇不同的濃度水平。即，在某個(gè)因子在二種和三種蛋白胨的最佳組合中都存在并且在表3中的多個(gè)位置都使用的情況下，該單種蛋白胨的范圍在表3中不必是一樣的。
在表3的第一行中提供該例中的類因子名并且它們對(duì)應(yīng)于表1和2中列出的蛋白胨的各種子集。具體地，用從表1中對(duì)各種蛋白胨的評(píng)估得出的二種蛋白胨的最佳子集里的實(shí)際的蛋白胨來(lái)替代類因子F01和F02。用從表2中的對(duì)各種蛋白胨的評(píng)估得出的三種蛋白胨的第一最佳子集里的實(shí)際的蛋白胨替代類因子F03、F04和F05，依此類推。由于在多個(gè)最佳子集中可能出現(xiàn)同一種蛋白胨，所以該同一個(gè)蛋白胨可能對(duì)應(yīng)于多于一個(gè)的類因子名F01，F(xiàn)02，...F11。
利用表1和2，機(jī)器人系統(tǒng)在自動(dòng)過(guò)程中把具有期望的蛋白胨濃度變化的選定子集置入微孔陣列的各孔中。表3的評(píng)估產(chǎn)生足夠的空間，用于把具有最小、或低的(即-1.41)、中低的(即-1)、中間的(即0)、中高的(即1)以及最大的、或高的(即1.41)濃度水平的雙蛋白胨的雙式組合，并以及把具有最小、或低的(即-1.68)、中低的(即-1)、中間的(即0)、中高的(即1)以及最大的、或高的(即1.68)濃度水平的三蛋白胨的三式組合置入到單個(gè)板的各孔中。但是這些濃度不必需對(duì)應(yīng)于表1和表2中為同一種蛋白胨示出的濃度，而是如前面指出那樣，是假設(shè)為跨越特定蛋白胨的可能的最優(yōu)濃度范圍的濃度。
該系統(tǒng)和方法接著獲取指示相接觸的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且在具有與該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)的鏈接的情況下把試驗(yàn)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中。這樣做，接著可以應(yīng)用一個(gè)算法比較試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以識(shí)別最佳的蛋白胨濃度值。
可以用一個(gè)子集再重復(fù)試驗(yàn)，以便獲得在細(xì)胞中產(chǎn)生期望的響應(yīng)的最優(yōu)的因子子集。另外，可以改變各試劑的濃度而重復(fù)試驗(yàn)。還可以利用各種統(tǒng)計(jì)上具有明顯的主效應(yīng)的單試劑的子集或者通過(guò)組合最佳單試劑的子集和最佳混合中識(shí)別出的子集來(lái)進(jìn)行相隨的試驗(yàn)。
在圖18、19和20中示出上面的實(shí)施例提供的結(jié)果的例子。在圖18、19和20中示出二種蛋白胨組合的最佳孔分析。具體地說(shuō)，分析利用八種培養(yǎng)基成份試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)，并且最佳孔分析示出三種一貫地具有陽(yáng)性效果的蛋白胨植物蛋白胨、小麥和精選大豆蛋白胨。
圖18示出表1的孔ID編號(hào)D10提供的結(jié)果，其中濃度為3mg/mL的3和濃度為8.0mg/mL的小麥組合。類似地，圖19示出表1的孔ID編號(hào)D11提供的結(jié)果，其中濃度為3.0mg/mL的3和濃度為3.0mg/mL的精選大豆蛋白胨組合。圖20示出表1的孔ID編號(hào)C11提供的結(jié)果，其中濃度為3.0mg/mL的精選大豆蛋白胨和濃度為8.0mg/mL的麥組合。分析表明，這三種蛋白胨在HB67細(xì)胞及IgG分泌和增殖上具有陽(yáng)性作用。接著可以利用表3的自動(dòng)優(yōu)化模板進(jìn)一步評(píng)估這三種蛋白胨的子集以確定最佳濃度。
和常規(guī)試驗(yàn)相比可以在較短的時(shí)間完成上面說(shuō)明的實(shí)施例。具體地說(shuō)，可以在單個(gè)板(即表1)上評(píng)估二種蛋白胨的全部最佳子集，并且可以在另一個(gè)獨(dú)立板(即表2)上評(píng)估三種蛋白胨的全部最佳子集。其中包含重復(fù)的這二個(gè)板提供結(jié)果(即子集)，這些結(jié)果可以同時(shí)地在又一個(gè)獨(dú)立板(即表3)上的單次試驗(yàn)中予以評(píng)估。與不在多孔板中進(jìn)行的常規(guī)試驗(yàn)相比，這種自動(dòng)實(shí)現(xiàn)要快得多和有效得多。由于在同一個(gè)板上評(píng)估所有的每種尺寸(即，二種和三種)的子集，所得到的數(shù)據(jù)具有更直接的可比性和更可靠。另外，相隨的優(yōu)化試驗(yàn)允許在同一個(gè)板上在同一次試驗(yàn)中優(yōu)化二種和三種蛋白胨的若干子集。這比在分離的板上、分離的時(shí)間和/或替代格式的多孔板上進(jìn)行試驗(yàn)更加有效。
通過(guò)使用軟件包例如MPM/CATSBA，本發(fā)明的上述各實(shí)施例可通過(guò)自動(dòng)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化策略來(lái)消除細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞試驗(yàn)中固有的人為誤差。這些實(shí)施例允許軟件以自動(dòng)方式實(shí)現(xiàn)根據(jù)復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)進(jìn)行物理板布局。接著這些復(fù)雜的板布局能以比目前更加有效的方式自動(dòng)進(jìn)行評(píng)估并確定最佳子集問(wèn)題的解。尤其，在該例中，優(yōu)化策略的自動(dòng)實(shí)現(xiàn)用于根據(jù)抗體分泌、細(xì)胞數(shù)量和達(dá)到抗體分泌峰值的時(shí)間有效地識(shí)別蛋白胨組合的最佳子集，并且接著識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的最佳蛋白胨濃度。
通過(guò)對(duì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的組合了解以及通過(guò)機(jī)器人自動(dòng)準(zhǔn)備樣本，上述實(shí)施例把計(jì)算機(jī)與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)相結(jié)合，并且利用該技術(shù)優(yōu)化生物系統(tǒng)，這與簡(jiǎn)單地優(yōu)化化驗(yàn)條件是不同的。
利用該軟件自動(dòng)地產(chǎn)生所有板布局、液體處理命令和數(shù)據(jù)分析功能。這種自動(dòng)平臺(tái)為試驗(yàn)進(jìn)程消除大部分人為誤差。在采用該技術(shù)之前，人工地把試驗(yàn)編程到機(jī)器人液體處理平臺(tái)中或者手工地在半敞開(kāi)臺(tái)上建立試驗(yàn)。由于人的操縱以及編程的錯(cuò)誤，這二種試驗(yàn)方法很可能含有固有誤差。
另外，MPM軟件自動(dòng)地分析所有數(shù)據(jù)并且可用于建議相隨的優(yōu)化試驗(yàn)。該系統(tǒng)允許以更有效的多的方式解決更加復(fù)雜的培養(yǎng)基優(yōu)化問(wèn)題。此外，在設(shè)計(jì)以及實(shí)現(xiàn)上，拾取最佳子集并且聯(lián)立地優(yōu)化這些子集的濃度的策略是新穎的。這產(chǎn)生以自動(dòng)的方式建立復(fù)雜的板布局的能力并且導(dǎo)致和人工系統(tǒng)非常不同的試驗(yàn)和觀測(cè)。例如，在培養(yǎng)基成分的某些組合下可以觀察協(xié)同作用。
上面的實(shí)施例還提供快得多的移液速度，這些都提供更大的成本節(jié)約、改進(jìn)數(shù)據(jù)分析時(shí)間以及機(jī)器人編程時(shí)間。試劑成本節(jié)約是通過(guò)以下方式計(jì)算的每種試驗(yàn)方法所需的重復(fù)次數(shù)乘以所需的優(yōu)化試驗(yàn)次數(shù)，接著再用常規(guī)結(jié)果除以上面的優(yōu)化結(jié)果。
可以從遠(yuǎn)離進(jìn)行試驗(yàn)的實(shí)際實(shí)驗(yàn)室的客戶位置實(shí)現(xiàn)上面說(shuō)明的實(shí)施例。這可能涉及基于萬(wàn)維網(wǎng)的接口或者涉及向客戶分發(fā)胖客戶軟件應(yīng)用程序。交互水平的范圍可以從簡(jiǎn)單地動(dòng)態(tài)生成顯示目前的優(yōu)化狀態(tài)的報(bào)告到客戶完全控制進(jìn)程。另外，這些實(shí)施例可應(yīng)用于定制的培養(yǎng)基優(yōu)化服務(wù)以及定制的數(shù)據(jù)、試劑和試驗(yàn)設(shè)計(jì)管理服務(wù)。
下面更詳細(xì)地說(shuō)明依據(jù)本發(fā)明的各實(shí)施例的其他統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)。
例子例1 透明質(zhì)酸和富胺組織培養(yǎng)表面的偶聯(lián)Becton Dickinson Labware公司利用氧/氮等離子形成PRIMARIATM組織培養(yǎng)產(chǎn)品。具體地，聚苯乙烯產(chǎn)品的氧/氮的等離子體處理造成含氧和氮的官能基例如氨基和胺基的結(jié)合。對(duì)于該試驗(yàn)，利用技術(shù)上周知的碳二亞胺生物偶聯(lián)化學(xué)(例如在Richard S.Taylor編輯的“Protein ImmobilizationFundamentals and Applications”，M.Dekkerr，NY，1991中說(shuō)明或者在2002年9月30日提交的共同待決、共同擁的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259,797中說(shuō)明)通過(guò)HA上的羧基把HA偶聯(lián)到PRIMARIATM多孔板的富胺表面上。
例2 ECM蛋白和透明質(zhì)酸的偶聯(lián)ECM試劑共價(jià)地附著到來(lái)自例子1的約束在培養(yǎng)表面的HA聚合物上。具體地，利用E.Junowicz和S.Charm的“The Derivatizationof Oxidized Polysaccharides for Protein Immobilization and AffinityChromotography”，Biochimica et.Biophysica Acta，Vol.428157-165(1976)中說(shuō)明的高碘酸鹽過(guò)程通過(guò)氧化在HA上形成醛基。該過(guò)程要求對(duì)HA溶液添加高碘酸鈉，以活化末端糖。隨后，利用標(biāo)準(zhǔn)固定化學(xué)術(shù)(例如Richard F.Taylor編輯的“Protein ImmobilizationFundamentals and Applications”，M.Ddkker，NY，1991或2002年9月30日提交的共同待決美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/259.797中說(shuō)明的固定化學(xué)術(shù))把活化的HA偶聯(lián)到ECM蛋白上的胺基。
例3 利用統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)試驗(yàn)(混合設(shè)計(jì))同時(shí)篩選10種不同的ECM蛋白在本例中該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)是混合設(shè)計(jì)。利用該設(shè)計(jì)識(shí)別在細(xì)胞響應(yīng)上具有陽(yáng)性作用的因子對(duì)或單種因子并且允許我們檢查二個(gè)ECM之間的交互作用。在該例子，10種各代表一個(gè)單“因子”的ECM用來(lái)形成ECM混合以置入圖7中所示的96孔板的各孔中。這些ECM共價(jià)地附著到培養(yǎng)表面上的生物配物聚合物上(見(jiàn)例1和2)。注意，在沒(méi)有對(duì)該試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)下，為了對(duì)給定的細(xì)胞類型試驗(yàn)這十種ECM中的一種和另一種，總共需要210(1024)次單試驗(yàn)或者十一個(gè)96孔板。
在本例中，選擇一個(gè)10個(gè)粘附配體的組并且選取96孔陣列作為該篩選的格式。為了消除不均勻蒸發(fā)產(chǎn)生的邊界效應(yīng)，該試驗(yàn)只使用96孔陣列的60個(gè)內(nèi)孔。由此該板的外行或外列上的孔可用于適當(dāng)?shù)目刂啤?br> 根據(jù)它們充當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)試劑的常規(guī)用途以及市場(chǎng)上的易購(gòu)性和價(jià)格選擇以下10種粘附配體膠原蛋白I(CI)，膠原蛋白III(CIII)，膠原蛋白IV(CIV)，膠原蛋白VI(CVI)，彈性蛋白(ELA)，纖連蛋白(FN)，玻連蛋白(VN)，層粘連蛋白(LAM)，聚賴氨酸(PL)以及聚鳥(niǎo)氨酸(PO)。
在表面化學(xué)要求的特殊考慮下開(kāi)發(fā)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。具體地，在該試驗(yàn)中采用圖9中示出的情景，其中各孔間保持粘附配體的總密度并且只允許改變粘附配體的成分。換言之，各孔間某個(gè)單種粘附配體的濃度可以是不同的，但是每個(gè)孔固定上的總粘附配體數(shù)量是相同的。前面對(duì)此情景做了進(jìn)一步的說(shuō)明。在圖10的電子表格中示出這種設(shè)計(jì)的一個(gè)例子。該電子表格充當(dāng)存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中的該設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)。圖10的頂行列出該具體篩選中使用的十種因子(A-K)以及它們的對(duì)應(yīng)身份。在該示出的電子表格中，因子A代表纖維蛋白，因子B代表膠原蛋白I，等等。第一列是轉(zhuǎn)換到96孔板的某個(gè)孔中的試驗(yàn)點(diǎn)的列表，在本情況中共52個(gè)孔。該電子表格中的數(shù)字是因子水平。在該例子中，這些水平是添加到特定孔中的因子的實(shí)際體積(按μL)。在該具體設(shè)計(jì)中，按三種體積例如5μL，25μL或50μL對(duì)地添加因子。本情況中孔的總?cè)莘e是50μL。這樣，對(duì)于那些按50μL添加一種因子的孔，孔的最終成分由共價(jià)地固定在孔表面上的單種粘附配體構(gòu)成。相應(yīng)地，如果對(duì)某個(gè)孔添加25μL的某因子并且還添加25μL的第二因子，則最終孔成分是二種共價(jià)固定在孔表面上的不同的細(xì)胞粘附配體的混合構(gòu)成。當(dāng)添加5μL的某因子并且還添加9種各為5μL的其它因子，則在這些孔中產(chǎn)生孔表面上的全部10種細(xì)胞粘附配體的混合構(gòu)成。這些含有全部10種粘附配體的試驗(yàn)點(diǎn)稱為“中間點(diǎn)”并且是該例中的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的組成部分。
現(xiàn)參照?qǐng)D11，圖中示出96孔板的布局，其是圖10中所示的具體統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換得到的。具體地，該96孔板包括圖10指出的孔成分，例如固定在每個(gè)孔的底上的細(xì)胞粘附配體組合。具體地，按如下圖10中的試驗(yàn)運(yùn)行和圖11的行/列對(duì)應(yīng)圖10設(shè)計(jì)中的運(yùn)行1-10分別代表圖11陣列上的行B，列2-11；運(yùn)行11-20代表行C，列2-11；運(yùn)行21-30代表行D，列2-11；行31-40代表行E，列2-11；運(yùn)行41-50代表行F，列2-11；以及運(yùn)行51和52分別代表行G，列2和3。如通過(guò)圖10的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)和圖11的對(duì)應(yīng)96孔板布置所示，這是本發(fā)明的一個(gè)其中除了試劑混合之外還可以在受器中置入單種試劑的實(shí)施例。
例4 專用于MC3T3-E1成骨細(xì)胞的ECM篩選MC3T3-E1細(xì)胞源自Duke大學(xué)的L.D.Qnarles博士并且由北卡羅來(lái)納大學(xué)(Chapel Hill)的Gale Lester博士友好提供。利用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)這些細(xì)胞生長(zhǎng)。MC3T3-E1是一種充分表征和迅速生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞系，由于它積極地附著到最常使用的組織培養(yǎng)表面上而被選擇。
按照技術(shù)上周知的方法利用胰蛋白酶-EDTA從細(xì)胞培養(yǎng)瓶取出細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、離心沉降并且重懸浮在不含有血清的培養(yǎng)基中(或者替代地含有10％的胎牛血清的培養(yǎng)基中)。根據(jù)圖11中示出的和在前面例3中說(shuō)明的布置把細(xì)胞置96孔微陣列的各孔中。接種濃度為每個(gè)孔大約10,000個(gè)細(xì)胞。在板中37℃下溫育細(xì)胞過(guò)夜。下一個(gè)白天，去除未附著在孔表面上的固定試劑中的培養(yǎng)基和細(xì)胞。通過(guò)對(duì)福爾馬林至少暴露15分鐘固定任何附著的細(xì)胞。使用碘丙錠熒光標(biāo)記所述固定的粘附細(xì)胞的核。利用熒光顯微鏡(Discovery-1，UNIVERSALImaging公司，為位于Downingtown，PA的Molecular Devices公司的子司)獲取附著在ECM篩選板的各孔上的熒光標(biāo)記細(xì)胞的圖象。圖12中示出從一個(gè)96孔板獲取的圖象的例子。具體地，除了行G，列4-11充當(dāng)對(duì)照孔外，該布局和圖11中示出的布局相同。在圖12中，把10％的含胎牛血清溶液中的MC3T3-E1細(xì)胞置入含有已約束到透明質(zhì)酸表面上的試劑的各孔中，但孔G4-G9只含有透明質(zhì)酸表面以及孔G10和G11只由組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯構(gòu)成。如預(yù)期那樣，孔G4-G9中的僅僅透明質(zhì)酸的表面防止細(xì)胞附著。在該情況中，孔G10和G11中的對(duì)聚苯乙烯表面的細(xì)胞附著出奇地低。相反，一些含有細(xì)胞粘附配體的孔顯示強(qiáng)的細(xì)胞附著，如可以通過(guò)大量白點(diǎn)看出那樣，每個(gè)白點(diǎn)代表一個(gè)附著細(xì)胞的細(xì)胞核。
利用一個(gè)圖象分析軟件包(Meta Morph，Universal Imaging公司，Molecular Devices公司的子公司，Downingtown，PA)對(duì)圖12中的熒光標(biāo)記細(xì)胞核計(jì)數(shù)，在圖13中示出對(duì)不含有胎牛血清的培養(yǎng)基以及含有10％的胎牛血清的培養(yǎng)基中的細(xì)胞的細(xì)胞核計(jì)數(shù)。在圖13中，孔1-10對(duì)應(yīng)圖12中的行B，列2-11；圖13中的孔11-20對(duì)應(yīng)圖12中的行C，列2-11；等等。
在圖13中，存在10％的胎牛血清下，對(duì)一些孔觀察到細(xì)胞附著。不存在血清下，細(xì)胞附著減少，但是在一些孔中仍觀察到細(xì)胞附著。在這二種情況中，一些含有根據(jù)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)的細(xì)胞粘附配體的孔中的細(xì)胞附著超過(guò)在純組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯(圖12中的孔59和60)中培養(yǎng)的細(xì)胞。該得到的結(jié)果能證實(shí)一些支持MC3T3-E1附著的表面好于最常用作于細(xì)胞培養(yǎng)支持的組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯。
為了優(yōu)化表面可以遵循二個(gè)指導(dǎo)，即，“最佳孔”組成或“最佳因子組”。在對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的嚴(yán)格統(tǒng)計(jì)分析后確定“最佳因子組”。
在“最佳孔”方法下，選出帶有最佳試驗(yàn)結(jié)果的孔進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。在圖13示出的例子中，應(yīng)選擇細(xì)胞核數(shù)量最高的孔40(或孔E11)。根據(jù)圖11中示出的板布局，該孔含有VI型膠原和III型膠原的混合。為ECM篩選板準(zhǔn)備中的固定步驟選擇的VI型膠原以及III型膠原的濃度是根據(jù)利用ECM(纖連蛋白)模型對(duì)MC3T3-E1的初始濃度依賴性研究。注意，對(duì)于一種研究的細(xì)胞類型最優(yōu)的濃度對(duì)另一種細(xì)胞類型可能不是最優(yōu)的。另外，對(duì)某給定細(xì)胞類型最優(yōu)的特定ECM的濃度對(duì)于另一種ECM可能不是最優(yōu)濃度，即使使用相同的細(xì)胞類型時(shí)。類似地，“擊中孔”中的混合物的成分可能不是最優(yōu)的。例如，為“最佳孔”的孔E11由VI型膠原和III型膠原的50/50混合構(gòu)成?？梢赃M(jìn)行相隨的試驗(yàn)以優(yōu)化為固定步驟選擇的二種配體的濃度，以及為某給定的細(xì)胞類型優(yōu)化結(jié)合到“擊中”孔的表面上的混合物的組成(50/50混合可能不是最優(yōu)組成)。
在“最佳因子組”方法下，利用統(tǒng)計(jì)模型分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)于上面說(shuō)明的例子，MC3T3-E1數(shù)據(jù)的混合物模型分析表明，當(dāng)不存在血清，在膠原IV、層粘連蛋白以及聚-L-賴氨酸(邊緣效應(yīng))為足夠數(shù)量時(shí)它們看來(lái)增加細(xì)胞計(jì)數(shù)，如圖14中所示。所有這些線相交的點(diǎn)對(duì)應(yīng)中間點(diǎn)，在這些中間點(diǎn)上所有10種ECM各按5μL出現(xiàn)。該圖提供取決于孔的組成如何偏離該基準(zhǔn)“中間點(diǎn)”混合細(xì)胞計(jì)數(shù)會(huì)如何改變的指示，如可看出那樣，當(dāng)膠原蛋白IV或?qū)诱尺B蛋白的數(shù)量增加時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。
參照?qǐng)D15，在10％的血清下，圖14中看到的聚L賴氨酸的作用消失，僅僅膠原蛋白IV和層粘連蛋白繼續(xù)顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)上的陽(yáng)性作用。
注意“最佳孔”和“最佳因子組”二種方法都是有效的，但是每種方法可以導(dǎo)致不同的表面組成。在本例中，“最佳孔”方法會(huì)導(dǎo)致VI型膠原蛋白和III型膠原蛋白構(gòu)成的表面，而“最佳因子”方法會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白VI和層粘連蛋白構(gòu)成的表面。
例5 利用統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)(Plackett-Burman設(shè)計(jì))篩選30種不同的試劑設(shè)計(jì)本例說(shuō)明圖16(a-d)中所示的Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)，其是利用SAS Institute(Cary，NC)的商用軟件包JMPTM生成的。具體地說(shuō)，利用SAS/JMP V 4.0.5中的定制設(shè)計(jì)功能產(chǎn)生該篩選設(shè)計(jì)。該軟件包是一個(gè)GUI導(dǎo)向的包，從而不示出代碼。參照?qǐng)D16a，第一列是轉(zhuǎn)換到96孔板的各孔中的試驗(yàn)點(diǎn)(運(yùn)行)的列表，在本例中共60個(gè)孔。該電子表格自身中的數(shù)字(-1或1)(圖16a-16d)是因子水平的指示。在本例中，“1”指示存在該因子而“-1”指示不存在該因子。另外，在本例中，如果一給定孔中存在某因子，則對(duì)于該孔的總?cè)莘e它總是為相同的濃度。根據(jù)對(duì)應(yīng)試驗(yàn)運(yùn)行中包含的試劑的編號(hào)，各個(gè)孔之間試劑的總濃度可以是不同的。在圖16a-16d的首行中提供類因子名。圖17示出該試驗(yàn)中每個(gè)類因子F01-F03的身份。例如，第一列中的試驗(yàn)運(yùn)行1可代表96孔板的孔1。從圖16(a-d)示出的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，可以看出孔1中存在以下因子(即水平為“1”)F01，F(xiàn)08，F(xiàn)09，F(xiàn)11，F(xiàn)12，F(xiàn)14，F(xiàn)16，F(xiàn)20，F(xiàn)23，F(xiàn)25，F(xiàn)26，F(xiàn)27和F29。
建議的數(shù)據(jù)獲取和統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)圖16(a-d)的電子表格中示出的設(shè)計(jì)把細(xì)胞置入96孔板的各孔中。接種密度約為每個(gè)孔10,000個(gè)細(xì)胞。37℃下在板中溫育細(xì)胞過(guò)夜。下一個(gè)白天，去除未附著在孔表面上的固定試劑中的培養(yǎng)基和細(xì)胞，并且通過(guò)對(duì)福爾馬林至少暴露15分鐘固定任何附著的細(xì)胞。如例4中說(shuō)明那樣，熒光標(biāo)記固定的附著細(xì)胞的核并且利用熒光顯微鏡獲取圖象。利用一個(gè)圖象分析軟件包(Meta Morph，Universal Imaging公司)對(duì)熒光標(biāo)記的細(xì)胞核計(jì)數(shù)并且對(duì)細(xì)胞得到核計(jì)數(shù)結(jié)果。根據(jù)這些結(jié)果，選出帶有最佳試驗(yàn)結(jié)果(例如，細(xì)胞核數(shù)量最高)的孔供進(jìn)一步優(yōu)化。通過(guò)檢查給出最佳結(jié)果的那些孔的內(nèi)容，獲得有關(guān)哪些因子和/或因子組產(chǎn)生有益作用的信息。通過(guò)在該設(shè)計(jì)中包括許多因子，可以確定因子之間的潛在的更復(fù)雜的交互作用。相隨的篩選試驗(yàn)可以集中在第一輪篩選中發(fā)現(xiàn)的特別感興趣的因子組合上。
第一次篩選之后，評(píng)估和審查主效果?！爸餍Ч敝傅氖菃畏N試劑獨(dú)立起的效果。交互效果指的是多于一種的試劑一起作用(不獨(dú)立地)時(shí)的組合效果。此刻，典型地不在統(tǒng)計(jì)模型中評(píng)估試劑之間的相關(guān)交互作用，而是期望試劑之間的交互作用會(huì)產(chǎn)生最佳試驗(yàn)運(yùn)行，即最佳的孔。在第一輪篩選之后，識(shí)別最佳的孔以及這些孔中包含的因子(水平“1”)。對(duì)每個(gè)最佳的孔，利用該孔中包含的所有因子，不論它們?cè)诔醪浇y(tǒng)計(jì)分析中具有陽(yáng)性、中性或陰性效果，可以進(jìn)行相隨的試驗(yàn)。可以利用最佳孔中識(shí)別出的試劑的子集重復(fù)試驗(yàn)，從而達(dá)到用于在細(xì)胞中產(chǎn)生期望響應(yīng)的最優(yōu)因子子集。另外，可以在改變最佳孔中各試劑的濃度的情況下重復(fù)試驗(yàn)。還可以利用統(tǒng)計(jì)上具有明顯的主效果的單試劑的子集或者通過(guò)使最佳單試劑的子集與最佳混合中識(shí)別的子集組合來(lái)進(jìn)行相隨的試驗(yàn)。
已經(jīng)提出通過(guò)細(xì)胞外環(huán)境中因子之間的高階交互作用來(lái)管理經(jīng)細(xì)胞外條件的細(xì)胞表現(xiàn)型的控制。確信本文給出的Plackee-Burman設(shè)計(jì)對(duì)主效果提供好的統(tǒng)計(jì)評(píng)估，并且還提供在各次試驗(yàn)運(yùn)行中觀察各因子的各種組合的機(jī)會(huì)，在此情況下，可以期望高階交互作用會(huì)產(chǎn)生超過(guò)最佳孔中各試劑各自的主效果所預(yù)期的試驗(yàn)運(yùn)行的特定試驗(yàn)運(yùn)行以作為“最佳的孔組”。
盡管上面只詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明的一些示范實(shí)施例，業(yè)內(nèi)人士容易理解，在不實(shí)質(zhì)背離本發(fā)明的新穎的教導(dǎo)和優(yōu)點(diǎn)的情況下，在這些示范實(shí)施例中許多修改是可能的。從而，預(yù)期所有這樣的修改包含在由后面的權(quán)利要求書(shū)定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種提供優(yōu)化策略以便根據(jù)各種響應(yīng)識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的多種物質(zhì)的最優(yōu)濃度的自動(dòng)方法，該方法包括步驟生成把多種物質(zhì)中的每一種變換成相應(yīng)的類因子名的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；生成進(jìn)一步把每種所述物質(zhì)的至少一種濃度變換成相應(yīng)的因子水平的所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；生成進(jìn)一步把多個(gè)受器的相應(yīng)位置變換到第一受器陣列中的所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；根據(jù)所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)生成第一表達(dá)，并且作為響應(yīng)把一種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度以及另一種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度作為相應(yīng)的組合物質(zhì)置入所述第一受器陣列里的至少一個(gè)所述受器中；使所述置入的組合物質(zhì)與感興趣的細(xì)胞接觸；以及獲取指示由于所述感興趣的細(xì)胞與所述組合物質(zhì)的接觸而產(chǎn)生的、所述感興趣的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的數(shù)據(jù)，并且作為響應(yīng)確定產(chǎn)生期望的表現(xiàn)型改變的最優(yōu)組合物質(zhì)以及所述最優(yōu)組合物質(zhì)的所述物質(zhì)的最優(yōu)濃度。
2.權(quán)利要求1所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述置入包括把相應(yīng)的二種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度作為相應(yīng)的組合物質(zhì)置入各相應(yīng)的所述受器中；所述接觸包括在所述受器中使所述感興趣的細(xì)胞與每種所述組合物質(zhì)接觸；以及所述獲取包括獲取指示由于所述感興趣的細(xì)胞與所述相應(yīng)的組合物質(zhì)的接觸而產(chǎn)生的、所述感興趣的細(xì)胞中的相應(yīng)表現(xiàn)型改變的相應(yīng)的所述數(shù)據(jù)，并且作為響應(yīng)確定產(chǎn)生所述期望的表現(xiàn)型改變的所述最優(yōu)組合物質(zhì)以及所述最優(yōu)組合物質(zhì)的所述物質(zhì)的所述最優(yōu)濃度。
3.權(quán)利要求1所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述組合物質(zhì)包括下述之一具有第一濃度值的所述的一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度與具有第二濃度值的所述的另一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度的組合；以及具有第三濃度值的所述的一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度與具有第四濃度值的所述的另一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度的組合。
4.權(quán)利要求3所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述的一種所述物質(zhì)的所述第一濃度值小于或等于所述的一種所述物質(zhì)的所述第三濃度值；以及所述的另一種所述物質(zhì)的所述第二濃度值小于或等于所述的另一種所述物質(zhì)的所述第四濃度值。
5.權(quán)利要求1所述的提供優(yōu)化策略的方法，還包括步驟生成進(jìn)一步把多個(gè)受器的相應(yīng)位置變換到第二受器陣列中的所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；根據(jù)所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)生成第二表達(dá)，并且作為響應(yīng)把一種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度、另一種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度以及再一種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度作為相應(yīng)的三組合物質(zhì)置入所述第二受器陣列的至少一個(gè)所述受器中；使所述置入的三式組合物質(zhì)與感興趣的細(xì)胞接觸；以及獲取指示由于所述感興趣的細(xì)胞與所述三式組合物質(zhì)的接觸而產(chǎn)生的、所述感興趣的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的第二數(shù)據(jù)，并且作為響應(yīng)確定產(chǎn)生第二期望的表現(xiàn)型改變的最優(yōu)三式組合物質(zhì)以及所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)的所述物質(zhì)的最優(yōu)濃度。
6.權(quán)利要求5所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述置入包括把相應(yīng)的三種所述物質(zhì)的相應(yīng)濃度作為相應(yīng)的三式組合物質(zhì)置入所述第二受器陣列的相應(yīng)的所述受器中；所述接觸包括在所述第二受器陣列的所述受器中使所述感興趣的細(xì)胞與所述三式組合物質(zhì)的每種物質(zhì)接觸；以及所述獲取包括獲取指示由于所述感興趣的細(xì)胞與所述相應(yīng)的三式組合物質(zhì)的接觸而產(chǎn)生的、所述感興趣的細(xì)胞中的相應(yīng)的表現(xiàn)型改變的相應(yīng)的所述第二數(shù)據(jù)，并且作為響應(yīng)確定產(chǎn)生所述第二期望的表現(xiàn)型改變的所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)以及所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)的所述物質(zhì)的所述最優(yōu)濃度。
7.權(quán)利要求6所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述三式組合包括具有第一濃度值的所述的一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度和具有第二濃度值的所述的另一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度以及具有第三濃度值的所述的再一種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度的組合。
8.權(quán)利要求5所述的提供優(yōu)化策略的方法，還包括步驟生成進(jìn)一步把多個(gè)受器的相應(yīng)位置變換到第三受器陣列中的所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；根據(jù)所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)生成第三表達(dá)，并且作為響應(yīng)，把所述最優(yōu)組合物質(zhì)置入所述第三受器陣列里的至少一個(gè)受器中并把所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)置入所述第三陣列里的至少一個(gè)其它受器中；使所述置入的最優(yōu)組合物質(zhì)以及所述置入的最優(yōu)三式組合物質(zhì)與感興趣的細(xì)胞接觸；以及獲取指示由于所述感興趣的細(xì)胞與所述最優(yōu)組合物質(zhì)以及與所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)的接觸而產(chǎn)生的、所述感興趣的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的第三數(shù)據(jù)，并且作為響應(yīng)，確定產(chǎn)生第三期望的表現(xiàn)型改變的所述最優(yōu)組合物質(zhì)以及所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)的所述各物質(zhì)的最優(yōu)濃度。
9.權(quán)利要求8所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述置入包括在所述第三陣列中，把所述最優(yōu)組合物質(zhì)置入到多個(gè)所述受器中以及把所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)置入到多個(gè)其它所述受器中。
10.權(quán)利要求8所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述置入還包括在所述第三陣列中把至少一個(gè)其它三式組合物質(zhì)置入到其它所述受器中；所述接觸還包括使所述置入的一個(gè)其它的三式組合物質(zhì)與所述感興趣的細(xì)胞接觸；以及所述獲取包括獲取指示由于所述感興趣的細(xì)胞與所述最優(yōu)組合物質(zhì)、所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)以及所述一個(gè)其它三式組合物質(zhì)的接觸而產(chǎn)生的、所述感興趣的細(xì)胞中的表現(xiàn)型改變的所述第三數(shù)據(jù)，以及作為響應(yīng)，確定產(chǎn)生所述第三期望的表現(xiàn)型改變的所述最優(yōu)組合物質(zhì)、所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)以及所述一個(gè)其它三式組合物質(zhì)的所述各物質(zhì)的最優(yōu)濃度。
11.一種提供優(yōu)化策略以便根據(jù)各種響應(yīng)識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的多種物質(zhì)的最優(yōu)濃度的自動(dòng)方法，該方法包括步驟生成把多種物質(zhì)中的每一種變換成相應(yīng)的類因子名的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；生成進(jìn)一步把每種所述物質(zhì)的至少一種濃度變換成相應(yīng)的因子水平的所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；生成進(jìn)一步把多個(gè)受器的相應(yīng)位置變換到第一、第二和第三受器陣列的每一個(gè)中的所述統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)；根據(jù)被置成與所述第一受器陣列里的所述受器中的所述物質(zhì)的相應(yīng)二式組合接觸的所述感興趣的細(xì)胞的響應(yīng)，確定最優(yōu)組合物質(zhì)；根據(jù)被置成與所述第二受器陣列里的所述受器中的所述物質(zhì)的相應(yīng)三式組合接觸的所述感興趣的細(xì)胞的響應(yīng)，確定最優(yōu)三式組合物質(zhì)；以及根據(jù)被置成與所述第三受器陣列里的某些所述受器中的所述最優(yōu)組合物質(zhì)接觸的以及與所述第三受器陣列里某些其它所述受器中的所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)接觸的所述感興趣的細(xì)胞的響應(yīng)，確定最優(yōu)物質(zhì)濃度。
12.權(quán)利要求11所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述確定步驟根據(jù)在所述第一、第二和第三受器陣列里的所述受器中觀察到的所述感興趣的細(xì)胞的相應(yīng)表現(xiàn)型改變，確定所述最優(yōu)組合物質(zhì)、所述最優(yōu)三式組合物質(zhì)以及所述最優(yōu)物質(zhì)濃度。
13.權(quán)利要求11所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述二式組合各包括二種所述物質(zhì)的每種物質(zhì)的相應(yīng)濃度，并且所述三式組合各包括三種所述物質(zhì)的每種物質(zhì)的相應(yīng)濃度。
14.權(quán)利要求13所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述二式組合中的所述二種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度包括下述之一所述二種物質(zhì)中的一種物質(zhì)的相應(yīng)第一濃度值以及所述二種物質(zhì)中的另一種物質(zhì)的相應(yīng)第二濃度值；以及所述二種物質(zhì)中的一種物質(zhì)的相應(yīng)第三濃度值以及所述二種物質(zhì)中的另一種物質(zhì)的相應(yīng)第四濃度值；以及所述三式組合中的所述三種所述物質(zhì)的所述相應(yīng)濃度包括所述三種物質(zhì)中的每一種物質(zhì)的相應(yīng)第五濃度值。
15.權(quán)利要求14所述的提供優(yōu)化策略的方法，其中所述二種物質(zhì)中的所述一種的所述第一濃度值小于或等于所述二種物質(zhì)中的所述一種的所述第三濃度值；以及所述二種物質(zhì)中的所述另一種的所述第二濃度值小于或等于所述二種物質(zhì)中的所述另一種的所述第四濃度值。
16.一種提供優(yōu)化策略以便根據(jù)各種響應(yīng)識(shí)別多種物質(zhì)的最優(yōu)濃度的自動(dòng)方法，該方法包括步驟利用以統(tǒng)計(jì)方式建立的第一板布局識(shí)別至少一個(gè)二物質(zhì)組合子集以供包含在子集優(yōu)化濃度評(píng)估中；利用以統(tǒng)計(jì)方式建立的第二板布局識(shí)別至少一個(gè)三物質(zhì)組合子集以供包含在子集優(yōu)化濃度評(píng)估中；以及利用以統(tǒng)計(jì)方式建立的第三優(yōu)化板布局從所述識(shí)別的所述二物質(zhì)組合子集以及所述三物質(zhì)組合子集中識(shí)別至少一個(gè)最優(yōu)物質(zhì)濃度。
17.權(quán)利要求16所述的提供優(yōu)化策略的自動(dòng)方法，還包括在組合第一和第二物質(zhì)并且至少一個(gè)物質(zhì)的濃度水平在高、低濃度水平之間改變的情況下進(jìn)行所述的從多種物質(zhì)識(shí)別至少一個(gè)二物質(zhì)組合子集。
18.權(quán)利要求16所述的提供優(yōu)化策略的自動(dòng)方法，還包括在組合第一、第二和第三物質(zhì)的情況下進(jìn)行所述的從多種物質(zhì)識(shí)別至少一個(gè)三物質(zhì)組合子集。
19.權(quán)利要求16所述的提供優(yōu)化策略的自動(dòng)方法，還包括在至少一種物質(zhì)的濃度水平在多個(gè)物質(zhì)濃度水平之間變化的情況下進(jìn)行所述的從所述二物質(zhì)組合子集和所述三物質(zhì)組合子集識(shí)別至少一個(gè)最優(yōu)物質(zhì)濃度。
20.權(quán)利要求16所述的提供優(yōu)化策略的自動(dòng)方法，還包括根據(jù)指示當(dāng)把感興趣的細(xì)胞置成和所述二物質(zhì)組合子集和所述三物理組合子集相接觸時(shí)產(chǎn)生的所述感興趣的細(xì)胞的表現(xiàn)型改變的數(shù)據(jù)，進(jìn)行所述的從所述二物質(zhì)組合子集和所述二物質(zhì)組合子集識(shí)別至少一個(gè)最優(yōu)物質(zhì)濃度。
全文摘要
一種用于識(shí)別能引發(fā)細(xì)胞類型中的表現(xiàn)型改變的試劑的自動(dòng)系統(tǒng)和方法。該方法包括步驟提供包含類因子名、因子水平和試驗(yàn)運(yùn)行的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，以及利用軟件程序通過(guò)自動(dòng)地把各試劑的身份變換成類因子名、把各試劑的濃度或量變換成因子水平、以及把各受器的位置變換成試驗(yàn)運(yùn)行，生成該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)。該方法還包括根據(jù)該統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)表達(dá)，把諸如蛋白胨的單試劑的不同混合物設(shè)置到陣列里的各受器中，使被置入的混合物與細(xì)胞接觸，從相接觸的細(xì)胞獲取試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以及利用包含算法的處理器比較獲取的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，以便識(shí)別優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件的蛋白胨組合和濃度。
文檔編號(hào)G01N35/10GK1930472SQ200580007362
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2005年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者佩里·D·哈蘭, 布賴斯·N·錢(qián)尼, 斯泰西·D·霍爾雷德 申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司