專利名稱：改進(jìn)的培養(yǎng)基添加劑及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的包括多胺和鐵的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，一種含有該細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基和一種使用該細(xì)胞培養(yǎng)添加劑提高細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力或細(xì)胞產(chǎn)率的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)過程中的發(fā)展目標(biāo)特別是提高活細(xì)胞積分(integral of viable cell concentration, IVC)和增加細(xì)胞產(chǎn)物的形成?；罴?xì)胞積分(IVC)直接與產(chǎn)物的濃度相關(guān)聯(lián)(Renard, J. M.等，Biotechnology Letters, 1988,10(2) :91-96)。這個(gè)活細(xì)胞濃度積分能通過提高活細(xì)胞濃度的峰值或延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間而增加。如果細(xì)胞保持高的活性，例如細(xì)胞平穩(wěn)增長(zhǎng)階段可以延長(zhǎng)，那么這個(gè)過程時(shí)間可以延長(zhǎng)。一個(gè)好的細(xì)胞培養(yǎng)基或一種好的細(xì)胞培養(yǎng)過程將提供整個(gè)過程細(xì)胞所有必要的底物，致使細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞活力高或產(chǎn)物形成多。多胺，例如亞精胺或精胺，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)過程中是很普遍的必要成分。盡管如此，據(jù)報(bào)道精胺的毒性是附著在含血清培養(yǎng)基生長(zhǎng)的BHK(幼倉(cāng)鼠腎)細(xì)胞中(Brimton， V. G.等，Biochem. J.，1991,280 :193-198)。牛血清白蛋白含量加快了多胺尤其是精胺的細(xì)胞毒性(Katsuta，H.，Jpn J Exp Med. ,1975,45(5) :345-54)。用 10μΜ 的三價(jià)鐵 (1.6mg/l)對(duì)CHO (Chinese hamster ovary，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞進(jìn)行治療，增加精胺的濃度(0 100 μ Μ,最大為20. 2mg/l)，降低了在血清培養(yǎng)基中劑量依賴性的活力細(xì)胞的數(shù)量 (Gaboriau, F.等，Biochemical Pharmacology，2004，67 1629-1637)。牛血清中含有的牛血清胺氧化酶可以催化多胺的氧化脫氨。專利WO 98/08934公開了一種無血清的培養(yǎng)基， 包含0. 9 18. lmg/1尤其是9. 05mg/l的精胺。多胺氧化形成的產(chǎn)物是形成細(xì)胞毒性的原因(Averill-Bates 等，Arch BiochemBiophys.，1993，300(1) :75_9)。多胺的氧化產(chǎn)物也可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)器。總之，公布的數(shù)據(jù)表明，盡管多胺是細(xì)胞必不可少的，但是對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說它們是有毒的。因此，一個(gè)技術(shù)人員在細(xì)胞培養(yǎng)基中主要關(guān)注于優(yōu)化腐胺(一種二胺)的濃度而不是多胺的濃度。腐胺是多胺的前驅(qū)體，專利WO 2004/078955公開了一些含有培養(yǎng)基的腐胺的例子。專利WO 2007/077217公開了一種包括至少0. 5mg/l多胺的無寡肽培養(yǎng)基，可以提高細(xì)胞特定產(chǎn)率。這進(jìn)一步證明最有效的是腐胺。增加精胺濃度在ang/1以上并沒有顯著增加細(xì)胞產(chǎn)率。該發(fā)明同時(shí)公開了另外加入濃度為1.067mg/l的!^e(II)的培養(yǎng)基。未觀察到多胺和鐵的協(xié)同效應(yīng)。專利W098/089;34公開了一種含有精胺和Fe2+和/或!^e3+濃度為0. 28 1. lmg/1
的培養(yǎng)基。因此，為了改進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和細(xì)胞產(chǎn)率，仍有需要發(fā)展培養(yǎng)基和添加劑作為補(bǔ)充。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種細(xì)胞培養(yǎng)基、 組成及其應(yīng)用，特別是能夠使細(xì)胞培養(yǎng)過程具有增加活細(xì)胞積分和/或提高細(xì)胞產(chǎn)物的形成。本發(fā)明解決了由該獨(dú)立權(quán)利要求規(guī)定的上述發(fā)現(xiàn)的問題。特別是，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，至少含有一種多胺，其濃度至少優(yōu)選高于20mg/l ；和至少含有一個(gè)鐵的；其濃度至少優(yōu)選高于ang/1。很驚奇的發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中多胺的濃度顯著高于平常的濃度，但對(duì)細(xì)胞并沒有毒性，而是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和/或細(xì)胞的產(chǎn)率。如果沒有被理論約束和以非限定性的方式，如果在細(xì)胞培養(yǎng)基中提供細(xì)胞一種二胺，例如腐胺，我們相信能用細(xì)胞能量從腐胺合成細(xì)胞多胺，如精胺。此外，所述的細(xì)胞多胺合成可能需要一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間以建立一個(gè)為了細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)的足夠大的內(nèi)部多胺池。如果在另一方面，在細(xì)胞培養(yǎng)基中多胺濃度增加，細(xì)胞的新陳代謝沒有必要來合成多胺，也不需要為了細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞產(chǎn)率來節(jié)約細(xì)胞能量。眾所周知，雖然鐵的氧化產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞具有毒性，特別是在高鐵濃度和/或長(zhǎng)期的過程中形成的；人人都知道在培養(yǎng)基中，含有濃度為100 μ M的!^2+或者!^3+離子培養(yǎng)基對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的線粒體DNA造成損壞(Itoh，H.等，Arch Biochem Biophys.，1994，313 120-125)，本發(fā)明適用于目前含有添加劑的多胺中的高鐵濃度和含上述物質(zhì)的培養(yǎng)基中。 令人驚奇的是，在培養(yǎng)基中多胺存在下，高鐵濃度促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。由于氨基的存在，多胺明顯能夠螯合金屬陽離子。這些螯合物的穩(wěn)定常數(shù)隨著氨基基團(tuán)的數(shù)量和多胺鏈長(zhǎng)的增加而升高。因此，如果不被理論約束和以非限定性的方式，我們相信，通過螯合物的形成多胺能有效地防止鐵氧化。多胺結(jié)合鐵離子可以穩(wěn)定鐵的氧化狀態(tài)和輔助傳輸鐵到細(xì)胞中去，多胺同時(shí)可作為螯合劑防止1 2+/ 3+離子沉淀。目前使用的高濃度多胺結(jié)合鐵可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力或細(xì)胞產(chǎn)率。根據(jù)發(fā)現(xiàn)，多胺不僅是一種底物，而且也可作為一個(gè)正電荷的離子載體，如過渡金屬，諸如基質(zhì)中的狗2+，F(xiàn)e3+, Cu2+，Zn2+0為了有效形成多胺-鐵配合物，較高的多胺和鐵離子濃度是有益的。所述形成多胺-鐵配合物很容易被細(xì)胞吸收，并保證較好的細(xì)胞內(nèi)的鐵和多胺的供應(yīng)， 以帶來更高的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和/或細(xì)胞產(chǎn)率。因此，根據(jù)本發(fā)明，多胺和鐵在培養(yǎng)基中的濃度應(yīng)提高到本發(fā)明的濃度。根據(jù)本發(fā)明，供給細(xì)胞的多胺和鐵尤其是對(duì)于細(xì)胞高密度生產(chǎn)過程或延長(zhǎng)過程時(shí)間的生產(chǎn)過程是有用的，例如在流加過程或灌注過程中。隨著過程持續(xù)時(shí)間的增加，為避免限定性向培養(yǎng)基中加入多胺和鐵變得很重要。由于多胺和鐵這兩種物質(zhì)對(duì)抗氧化可能是敏感的，因此，保護(hù)它們抗氧化和提高相應(yīng)的細(xì)胞高密度濃度變得很重要；為了提供多胺-鐵配合物的形成，目前供給所述高濃度的兩種物質(zhì)是很有用的。特別地，本發(fā)明解決了上述問題，提供了一種所述培養(yǎng)添加劑，特別是培養(yǎng)基添加劑，進(jìn)一步提供了一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括上述培養(yǎng)添加劑，其中培養(yǎng)添加劑定義為高濃度多胺尤其是精胺或亞精胺和高濃度鐵的特定組合。因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種按照上面所述的培養(yǎng)添加劑， 其中所含多胺的濃度至少優(yōu)選大于25mg/l，30mg/l，35mg/l，40mg/l，45mg/l，或者在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中至少優(yōu)選大于50mg/l。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種按照上面所述的培養(yǎng)添加劑，其中鐵的濃度至少優(yōu)選大于5mg/l，10mg/l, 15mg/l, 50mg/l, 100mg/l，M0mg/l，或者在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中至少，優(yōu)選大于480mg/l。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明所述培養(yǎng)基是指一種培養(yǎng)基質(zhì)，其中的多胺濃度從30mg/l到120mg/l，特別是從40mg/l到120mg/l。在一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施例中，培養(yǎng)基中鐵的濃度從50mg/l到900mg/l，優(yōu)選是從50mg/l到450mg/l。在本發(fā)明的另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，培養(yǎng)基中多胺的濃度從30mg/l到120mg/l，并且鐵的濃度從50mg/l到900mg/ 1，特別是從50mg/l到450mg/l。如果沒有特別說明，這里給出的所有鐵濃度的值涉及到全部鐵的質(zhì)量，而不僅僅是鐵本身。在本發(fā)明中，一種培養(yǎng)添加劑意味著變成了培養(yǎng)基的一個(gè)組成部分，并且能夠在一個(gè)實(shí)施例中定量加入到本領(lǐng)域傳統(tǒng)的培養(yǎng)基中，以提供一種按本發(fā)明所示的培養(yǎng)基，其中按本發(fā)明所示的培養(yǎng)基是指含有至少一種多胺和至少一種鐵的所需濃度的培養(yǎng)基。當(dāng)然，也有可能通過向本發(fā)明的培養(yǎng)基中加入不同成分來制備培養(yǎng)基，從而形成了如本發(fā)明所示的培養(yǎng)基。在一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，培養(yǎng)添加劑包括多胺和鐵從2到10000倍，優(yōu)選10 到1000倍，尤其是100倍，如上面確定的較高濃度培養(yǎng)基，即培養(yǎng)添加劑含有多胺的濃度從60mg/l到1200000mg/l，含有鐵的濃度從100mg/l到9000000mg/l，尤其是從100mg/l到 4500000mg/lo在另一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，培養(yǎng)添加劑含有多胺的濃度從300to 120000mg/ 1，含有鐵的濃度從500mg/l到900000mg/l，尤其是500mg/l到450000mg/l。在另一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，培養(yǎng)添加劑含有多胺的濃度為4000mg/l至12000mg/l，鐵的濃度為5000mg/ 1至90000mg/l，尤其是從5000mg/l至45000mg/l。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明所示培養(yǎng)基含有一定數(shù)量的如本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑，例如提供了一種培養(yǎng)基至少含有一種多胺和至少含有一種鐵，其中培養(yǎng)基中多胺的濃度至少為20mg/l，25mg/l，30mg/l，35mg/ 1，45mg/l，或者特別是50mg/l ；培養(yǎng)基中鐵濃度至少為2mg/l，5mg/l，10mg/l，15. 50mg/l， 100mg/l,240mg/l和至少為480mg/l。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)基包含有一定數(shù)量如本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑，例如提供了一種含有至少一種多胺和至少一種鐵的培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基中多胺的濃度從30mg/l至120mg/l ；培養(yǎng)基中鐵濃度從50mg/l至 900mg/l，優(yōu)選 50mg/l 至 450mg/l。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑是指一種培養(yǎng)基添加劑。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，培養(yǎng)基是指一種細(xì)胞培養(yǎng)基。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中，培養(yǎng)基是指一種富集培養(yǎng)基。下列術(shù)語是同義的，意思相同，“培養(yǎng)基”和“細(xì)胞培養(yǎng)基”。一種“培養(yǎng)基”是指一種基質(zhì)，所述基質(zhì)適合細(xì)胞培養(yǎng)或孵育。這種培養(yǎng)基可能包含維持細(xì)胞完整、或細(xì)胞活力、或細(xì)胞生長(zhǎng)、或細(xì)胞產(chǎn)率的營(yíng)養(yǎng)。作為優(yōu)選的培養(yǎng)基是一種液體培養(yǎng)基。專利WO 2007/036291 描述了一種特別優(yōu)選的培養(yǎng)基，可用于本發(fā)明中。一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基是指一種培養(yǎng)基的特定實(shí)施例，最好與其他成分相結(jié)合，例如一種富集培養(yǎng)基。一種特別優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和細(xì)胞產(chǎn)率所需的所有物質(zhì)。一種優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基特別包含下面的例子，但不局限于此，例如葡萄糖1. 0-6. Og/Ι，氯化鈉2. 8-6. 2g/l，氯化鉀273_945mg/， 氯化鈣 48-290mg/l，氯化鎂 42_330mg/l，磷酸二氫鈉 56_1130mg/l，精氨酸 56_930mg/l， 天冬酰胺44-900mg/l，天冬氨酸^_445mg/l，半胱氨酸35_270mg/l，谷氨酸44_900mg/l，谷氨酰胺 44-900mg/l,甘氨酸 18_180mg/l，組氨酸 42_670mg/l，異亮氨酸 54_877mg/l， 亮氨酸 59-1250mg/l，賴氨酸 73_1120mg/l，蛋氨酸 9_45%ig/l，苯基丙氨酸 35_677mg/l， 脯氨酸17-828mg/l，絲氨酸^_1339mg/l，蘇氨酸M_989mg/1，色氨酸9_441mg/l，酪氨酸 55-565mg/l，纈氨酸52_787mg/l，碳酸氫鈉2. 4g/l。一種優(yōu)選的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可進(jìn)一步包括脂肪酸和核苷酸。下面的術(shù)語是同義的“富集培養(yǎng)基(feed medium) (feeding medium)”和“灌注培養(yǎng)基(perfusion medium)”。術(shù)語“富集培養(yǎng)基(feed medium) ”是指培養(yǎng)基的一個(gè)特定實(shí)施方式，在培養(yǎng)過程中向細(xì)胞培養(yǎng)中加入的物質(zhì)。換言之，一種富集培養(yǎng)基是一種培養(yǎng)基，在第一培養(yǎng)基與細(xì)胞接觸后加入到細(xì)胞培養(yǎng)中的物質(zhì)，例如基礎(chǔ)培養(yǎng)基。向培養(yǎng)基中加入一種富集培養(yǎng)基有多種用途，例如可以延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，提高細(xì)胞活力，增加細(xì)胞濃度，或者增加產(chǎn)物濃度。專利WO 2007/036291描述了一種特別優(yōu)選的富集培養(yǎng)基，可用于本發(fā)明中。一種如本發(fā)明所示的優(yōu)選的富集培養(yǎng)基包含細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和細(xì)胞產(chǎn)率所需的所有物質(zhì)。例如，一種富集培養(yǎng)基并不局限于鹽，首選含有微量元素，碳水化合物，氨基酸，脂肪酸，PH值調(diào)節(jié)劑和核苷酸。僅僅含有一種或多種上述物質(zhì)的富集培養(yǎng)基同樣適用。根據(jù)本發(fā)明多胺和鐵的濃度，即現(xiàn)在的培養(yǎng)添加劑可以以優(yōu)選的實(shí)施方式應(yīng)用于培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基或富集培養(yǎng)基中。因此，在本發(fā)明中，一種培養(yǎng)基或一種含有添加劑的細(xì)胞培養(yǎng)基就是一種如上所述的培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基或富集培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中包含有培養(yǎng)添加劑。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，一種培養(yǎng)添加劑除了包含至少一種多胺和至少一種鐵， 還要含有至少一種溶劑，例如水或鹽水。因此，一種培養(yǎng)添加劑優(yōu)選的實(shí)施方式可以是液體形式。本發(fā)明中培養(yǎng)添加劑加入到一種培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基可以是傳統(tǒng)的培養(yǎng)基。本發(fā)明所示的一種培養(yǎng)基除了含有本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑以外，可以含有其它成分，例如溶劑，其中溶劑可以是水、維生素、鹽、碳源和/或氮源、氨基酸、PH值調(diào)節(jié)劑、微量元素、脂肪酸、核苷酸。特別是，本發(fā)明所示的培養(yǎng)基是一種水相培養(yǎng)基。如今，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)在科學(xué)教科書和手冊(cè)中都有良好的描述。詳細(xì)信息包括在R. Ian Fresney所著的《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》一書中，手冊(cè)，第四版，Wiley-Liss/ N. Y.，2000。培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，例如動(dòng)物細(xì)胞，結(jié)合本發(fā)明所示的添加劑其應(yīng)用本質(zhì)上在本領(lǐng)域內(nèi)已是眾所周知的。這種培養(yǎng)基優(yōu)選的組成是含有一種溶劑，例如水、碳源、氮源、 氨基酸、PH值調(diào)節(jié)劑、微量元素、脂肪酸、核苷酸。在本發(fā)明中優(yōu)選的培養(yǎng)基是標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基，這也可能是適應(yīng)特定細(xì)胞類型的需要，內(nèi)容包括而不限于，羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所 (RPMI) 1640培養(yǎng)基，L-15培養(yǎng)基，達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，最小量伊格爾氏培養(yǎng)基(MEM)，Ham' s F12培養(yǎng)基或Iscoves ‘改良的DMEM培養(yǎng)基。其他優(yōu)選培養(yǎng)基是例如Ham' sFlO或F12培養(yǎng)基，這是專門為CHO細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的。本發(fā)明其它優(yōu)選的培養(yǎng)基特別適用于CHO細(xì)胞培養(yǎng)，并在EP0481791中有實(shí)例描述。本發(fā)明的一種優(yōu)選的培養(yǎng)基也可以是已經(jīng)商業(yè)化的培養(yǎng)基,例如但不局限于CD CHO (Gibco，10743、ProCH05 (Bio ffhittaker, BE12-766Q), HyQSFM4CH0(HyClone, SH30548. 02)。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基中以優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行的可以含有蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可來源于任何重組或從天然物中分離出來的蛋白質(zhì)，比如轉(zhuǎn)鐵蛋白，牛血清白蛋白或胰島素。這種蛋白質(zhì)優(yōu)選是重組產(chǎn)生的，例如重組胰島素，或重組牛血清白蛋白，或重組人血清白蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和含蛋白質(zhì)的。本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和含谷氨酰胺的。在本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和含動(dòng)物成分的。在一實(shí)施例中，本發(fā)明優(yōu)選的培養(yǎng)基也可以包含由動(dòng)物來源、植物來源或酵母的水解物。首選是植物來源的水解物，如大豆蛋白胨或酵母水解物。本發(fā)明的培養(yǎng)基在一實(shí)施例中可以含有肽，所述肽可以是二肽、三肽、寡肽或多肽。在一個(gè)特定首選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和/或培養(yǎng)基是無血清。在一個(gè)特定的首選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和/或培養(yǎng)基是無蛋白質(zhì)的。在一個(gè)特定的首選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和/或培養(yǎng)基不含從動(dòng)物中分離出的物質(zhì)。在一個(gè)特定的首選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和/或培養(yǎng)基是不含水解物的。 在更進(jìn)一步的首選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑和/或培養(yǎng)基是不含肽的。在一個(gè)首選的實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑或培養(yǎng)基中含有一個(gè)或多個(gè)其它細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)素，即一種碳的來源和一種氮的來源，所述碳的來源例如葡萄糖，所述氮的來源例如氨基酸和/或其鹽。根據(jù)本發(fā)明，在一個(gè)首選的實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑可以以一種或多種儲(chǔ)備液的形式存在，比如含儲(chǔ)備液的鐵和多胺。在另一首選的實(shí)施例中，儲(chǔ)備液包含下面兩種物質(zhì)，即至少含有一種多胺和至少一個(gè)鐵。在所述的儲(chǔ)備液中，可以首選高濃度的多胺和/或鐵。該儲(chǔ)備液可以含有其它成分，例如鹽或PH值調(diào)節(jié)劑。該類儲(chǔ)備液可用來添加到培養(yǎng)基、或富集培養(yǎng)基、或細(xì)胞培養(yǎng)基中，形成了本發(fā)明的培養(yǎng)基。此處儲(chǔ)備液也可被定義為“試劑盒”。通過加入“試劑盒”，預(yù)期的多胺和鐵的濃度可以在最終培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)中調(diào)整。該培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑也可以含有其它物質(zhì)，特別是金黃三羧酸(aurin tricarboxylic acid, ΑΤΑ)、二氯乙酸(DCA)和/或琥珀酸。當(dāng)然，一種或更多的酸可以以鹽類及其衍生物的形式存在。根據(jù)本發(fā)明，在一個(gè)首選實(shí)施例中，多胺和鐵可以結(jié)合如本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑或培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)添加劑或培養(yǎng)基可含有二氯乙酸，或其鹽類，或其衍生物，例如二氯乙酸酯(DCA)或其鹽類，例如二氯乙酸鈉。根據(jù)本發(fā)明，在一個(gè)首選實(shí)施例中，多胺和鐵可以結(jié)合本發(fā)明所示的含有琥珀酸及其鹽類，例如六水琥珀酸鈉的培養(yǎng)添加劑或培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，在一個(gè)首選實(shí)施例中，多胺和鐵可以結(jié)合本發(fā)明所示的含有金黃三羧酸(aurin tricarboxylic acid, ΑΤΑ)及其鹽類的培養(yǎng)添加劑或培養(yǎng)基。在一特定首選實(shí)施例中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑包括精胺、檸檬酸鐵、二氯乙酸鈉、 六水琥珀酸鈉和金黃三羧酸。在一特定首選實(shí)施例中，本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑含有100mg/l至900mg/l，優(yōu)選 400mg/l的多胺，尤其是精胺；lmg/1至10mg/l，優(yōu)選4g/l的鐵，尤其是檸檬酸鐵或下述物質(zhì)中的一種或多種5mM到IOOmM,優(yōu)選20mM的二氯乙酸鈉；5g/l至100g/l，優(yōu)選30g/l六
/或培養(yǎng)基是不 /或培養(yǎng)基是不 /或培養(yǎng)基是不水琥珀酸鈉；5mg/l至100mg/l，優(yōu)選25mg/l金黃三羧酸。術(shù)語“多胺”是指確定結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，由碳、氮、氫組成，并含有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基基團(tuán)。在特定優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明所用的多胺是指精胺、亞精胺、去甲精胺、去甲精瞇、高精胺、高精瞇、尸胺、腐胺、胍丁胺、鳥氨酸。水合或脫水的形式、各種鹽的形式或結(jié)合一種或多種的多胺都包括在術(shù)語“多胺”中。術(shù)語“鐵”是指確定的過渡金屬Fe，原子量為55. 845。術(shù)語“鐵”是一通用術(shù)語，即含有一種或多種鐵離子的所有分子，例如狗3+離子和/或!^2+離子。Fe3+離子和/或!^2+ 離子可以以鐵鹽的形式存在。鐵鹽可以含有結(jié)晶水和不含結(jié)晶水。在一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，鐵包含鐵(II)和/或狗(111)離子。在一個(gè)特定優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明所用鐵可選自以下組的物質(zhì)磷酸鐵，焦磷酸鐵，硝酸鐵，硫酸亞鐵，三氯化鐵，乳酸亞鐵，檸檬酸鐵，檸檬酸鐵銨，右旋糖酐鐵，乙二胺四乙酸鐵鈉鹽或上述物質(zhì)含結(jié)晶水或不含結(jié)晶水的形式。鐵也可以與另一個(gè)分子絡(luò)合，例如與載體或螯合劑絡(luò)合。一些特定優(yōu)選的例子中， 鐵和螯合劑絡(luò)合的配合物是指乳酸亞鐵(II)水合物、檸檬酸鐵(III) (CAS :3522-50-7)、檸檬酸鐵銨(III)、右旋糖酐鐵、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽(CAS :15708-41-5)。鐵也可以與下述物質(zhì)絡(luò)合，例如專利US 60487 所描述的即吡哆醛異煙酰腙， 檸檬酸，檸檬酸膽堿，乙酰丙酮，以及其他各種有機(jī)酸，如蘋果酸，琥珀酸，延胡索酸，α -酮戊二酸。專利W02001/016294進(jìn)一步給出了本發(fā)明所用的鐵螯合劑。本發(fā)明所用鐵的一些特定優(yōu)選的例子磷酸鐵(III)，焦磷酸鐵水合物(III)，右旋糖酐鐵，九水硝酸鐵(III)，七水硫酸亞鐵(II)，六水三氯化鐵(III)，檸檬酸鐵(III)，檸檬酸鐵銨(III)。本發(fā)明還涉及到一個(gè)制備培養(yǎng)基的方法，其特征在于，根據(jù)本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑添加到液體培養(yǎng)基中，特別是添加到對(duì)于本領(lǐng)域而言常規(guī)的培養(yǎng)基中。本發(fā)明還涉及到根據(jù)本發(fā)明所使用的培養(yǎng)添加劑來制備培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一方面是一方法，在這個(gè)過程中，細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包含至少一種多胺，其濃度至少為優(yōu)選高于20mg/l ；還包含至少一種鐵，其濃度至少為優(yōu)選高于aiig/Ι。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方式是，用本發(fā)明的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞，包括逐漸增加多胺或者鐵的濃度或者兩者的濃度同時(shí)增加，例如在一個(gè)培養(yǎng)容器中，以至于這些成分的最終優(yōu)選濃度在細(xì)胞培養(yǎng)過程中體現(xiàn)出來。以一種優(yōu)選的方式，增加一種或兩種物質(zhì)的濃度也可通過向培養(yǎng)基中加入多胺和/或鐵或從一種或多種儲(chǔ)備液中加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。本發(fā)明還涉及到了在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中，a)準(zhǔn)備細(xì)胞和第一次用的培養(yǎng)基，b)在適宜培養(yǎng)所述細(xì)胞和所述第一次用培養(yǎng)基的條件下，在所述第一次用培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，c)在所述第一次用培養(yǎng)基接種細(xì)胞之前，或之后，或在培養(yǎng)過程中，其中至少一種多胺或鐵或兩者加入到第一次用培養(yǎng)基中，因此，已有的多胺和加入到步驟a)，b)，c) 中的所有多胺的總量和已有的鐵和加入到步驟a)，b)，c)中的所有鐵的總量形成了如本發(fā)明所示的濃度，尤其是其濃度含有至少一種多胺的濃度至少為20mg/l和至少一種鐵的濃度至少為ang/1。因此，本發(fā)明構(gòu)想了在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的這樣一個(gè)過程，預(yù)測(cè)了出現(xiàn)在培養(yǎng)基中所有多胺的總量和所有鐵的總量，所述所有多胺的總量包括在培養(yǎng)過程中加入的多胺和可能已經(jīng)消耗掉的多胺，所述所有鐵的總量包括在培養(yǎng)過程中加入的鐵和可能已經(jīng)消耗掉的鐵，導(dǎo)致產(chǎn)生本發(fā)明所示理論濃度，其中這個(gè)理論濃度包括至少一種多胺的總量其濃度至少為20mg/l和至少一種鐵的總量其濃度至少為aiig/1。根據(jù)本發(fā)明，所有已知的細(xì)胞培養(yǎng)過程實(shí)施例適合應(yīng)用于本發(fā)明中。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選過程實(shí)施例是一個(gè)細(xì)胞高密度過程。一個(gè)細(xì)胞高密度過程定義為一個(gè)過程，在這個(gè)過程中，細(xì)胞濃度超過1 X 105/ml，優(yōu)選1 X 106/ml，最優(yōu)選1 X 107ml。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的實(shí)施方式是連續(xù)過程、分批過程、分流批量過程、流加過程或灌注過程。在一特定優(yōu)選的實(shí)施方式中，培養(yǎng)細(xì)胞的方法是一種流加過程。該方法的實(shí)施細(xì)節(jié)對(duì)技術(shù)人員來說是眾所周知的。專利WO 2007/036291描述了該方法實(shí)施方式的更多細(xì)節(jié)限定。作為一個(gè)非約束性的例子，一個(gè)典型的流加過程始于培養(yǎng)基接種的細(xì)胞。在細(xì)胞與培養(yǎng)基接觸之后，細(xì)胞培養(yǎng)將會(huì)與另一培養(yǎng)基相接觸，例如一個(gè)富集培養(yǎng)基。接種后， 與富集培養(yǎng)基接觸的細(xì)胞可以但不局限于接觸1至4天?？梢赃B續(xù)、間歇或分批添加富集培養(yǎng)基到細(xì)胞培養(yǎng)基中。通過向培養(yǎng)基中加入富集培養(yǎng)基可以提高培養(yǎng)體積。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選是長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間的方法。一個(gè)長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間定義為生產(chǎn)步驟(η步) 的過程時(shí)間，所述生產(chǎn)步驟至少是4天或更長(zhǎng)，優(yōu)選至少8天或更長(zhǎng)，較為優(yōu)選至少10天或更長(zhǎng)，進(jìn)一步優(yōu)選至少12天或更長(zhǎng)，最優(yōu)選至少14天或更長(zhǎng)。本發(fā)明對(duì)細(xì)胞的類型并不限定。細(xì)胞類型例子包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞和酵母細(xì)胞。細(xì)胞還可以是原代細(xì)胞或干細(xì)胞。這些細(xì)胞可能是自然產(chǎn)生的細(xì)胞而不是被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些細(xì)胞也可以是與一個(gè)或更多的重組基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。這些細(xì)胞可以用病毒轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生任何產(chǎn)物，例如病毒產(chǎn)物。這些細(xì)胞可來源于倉(cāng)鼠、老鼠、人類或其他動(dòng)物。這些細(xì)胞也可以是細(xì)胞株，例如但不限于CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Per. C6細(xì)胞、BHK細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞。因此，本發(fā)明還涉及到了一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中，a)提供本發(fā)明的細(xì)胞和培養(yǎng)基，b)在恰當(dāng)和適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這意味著在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，特別是提供的條件適合細(xì)胞生長(zhǎng)和/或細(xì)胞擴(kuò)增和/或細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)。在一個(gè)特定優(yōu)選的實(shí)施例中，細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中超過兩個(gè)通道或多于4天進(jìn)行培養(yǎng)。在另一個(gè)優(yōu)選的方案中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法是一個(gè)過程，所述過程是指一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)物產(chǎn)生的過程，尤其是一個(gè)蛋白表達(dá)，尤其是從細(xì)胞表達(dá)和分泌。在另外一個(gè)優(yōu)選方案中，本發(fā)明涉及到在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的過程，其中，a)提供細(xì)胞和第一培養(yǎng)基，尤其是常規(guī)培養(yǎng)基，b)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞的適宜條件下，細(xì)胞在所述的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中，a)在培養(yǎng)基接種細(xì)胞之前，和/或b)在培養(yǎng)基接種細(xì)胞之后，和/或c)在培養(yǎng)過程中，和/或d)在培養(yǎng)初期和培養(yǎng)過程中，至少添加一種如本發(fā)明所示的培養(yǎng)添加劑，這樣培養(yǎng)細(xì)胞期間形成了第二培養(yǎng)基，所述第二培養(yǎng)基是指本發(fā)明的一種培養(yǎng)基，以一種先后制備的方式提供，即逐步增加多胺和/或鐵的濃度到本發(fā)明的高濃度。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選方式在從屬權(quán)利要求書中體現(xiàn)。下面的實(shí)施例和附圖可更清楚的說明本發(fā)明。


圖1表示細(xì)胞高密度流加方法中多胺和鐵的協(xié)同效應(yīng)。
圖2表示分批方法中在100mg/l的焦磷酸鐵(III)存在下使用亞精胺作為多胺的來源。圖3表示細(xì)胞高密度流加方法中在100mg/l的焦磷酸鐵(III)存在下精胺濃度的影響。圖4表示分批方法中在40mg/l精胺存在下鐵濃度的影響。圖5表示分批方法中鐵單獨(dú)的影響以及和精胺結(jié)合的影響。圖6表示細(xì)胞高密度流加方法中鐵單獨(dú)的影響以及和精胺結(jié)合的影響。圖7表示精胺和檸檬酸鐵(III)濃度的正面促進(jìn)作用分布。圖8表示精胺和磷酸鐵(III)濃度的影響。圖9表示精胺和右旋糖酐鐵濃度的影響。
具體實(shí)施例方式材料和方法細(xì)胞所有實(shí)驗(yàn)使用的是CHO DG44 宿主細(xì)胞系(Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77 :4216)。宿主細(xì)胞系經(jīng)攜有IgG抗體基因的載體轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)基中使用MTX 進(jìn)行轉(zhuǎn)染擴(kuò)增，生產(chǎn)一種抗體克隆分離和克隆，一種抗體的克隆被分離出來，然后這種克隆可應(yīng)用于所有實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)條件待用培養(yǎng)細(xì)胞保存在一個(gè)搖瓶或轉(zhuǎn)瓶中。儲(chǔ)備培養(yǎng)基每隔兩到三天補(bǔ)充到新的培養(yǎng)基中。這意味著細(xì)胞培養(yǎng)的一小部分用來接種并轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的燒瓶中，并補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基。細(xì)胞在37°C時(shí)在一種培養(yǎng)箱中的CO2氣體中培養(yǎng)。在這種方式下，細(xì)胞在幾次傳代中培養(yǎng)。其中傳代定義為2-4天的培養(yǎng)時(shí)間。在不同的時(shí)間點(diǎn)下，從儲(chǔ)備培養(yǎng)基中取出接種細(xì)胞并進(jìn)行不同規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，例如在6孔板、搖瓶、T型瓶、轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器中進(jìn)行。培養(yǎng)基如下所述的一種培養(yǎng)基(也稱為專用培養(yǎng)基)是用于在所有步驟中培養(yǎng)細(xì)胞的， 如在儲(chǔ)備培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基擴(kuò)大步驟和在生產(chǎn)步驟。基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和細(xì)胞生產(chǎn)所需的所有物質(zhì)?；A(chǔ)培養(yǎng)基包括葡萄糖1. 0-6. Og/Ι，氯化鈉2. 8-6. 2g/l， 氯化鉀 273-945mg/l，氯化鈣 48_290mg/l，氯化鎂 42_330mg/l，磷酸二氫鈉 56_1130mg/l， 精氨酸56-930mg/l，天冬酰胺44_900mg/l，天門冬氨酸^_445mg/l，半胱氨酸35_270mg/ 1，谷氨酸 44-900mg/，谷氨酰胺 44_900mg/l，甘氨酸 18_180mg/l，組氨酸 42_670mg/l，異亮氨酸 M_877mg/1，亮氨酸 59-1250mg/l，賴氨酸 73_1120mg/l，蛋氨酸 9_45%ig/l，苯丙氨酸 35-677mg/l，脯氨酸 17_828mg/l，絲氨酸 ^_1339mg/l，蘇氨酸 M_989mg/1，色氨酸 9-441mg/l，酪氨酸55-565mg/l，纈氨酸52_787mg/l，碳酸氫鈉2. 4g/l?；A(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)一步包括脂肪酸和核苷酸。除非另有說明，在所有批次和流加實(shí)驗(yàn)中使用相同的專有培養(yǎng)基和專有富集培養(yǎng)基。在流加實(shí)驗(yàn)中使用的富集培養(yǎng)基(以下也被稱為“專有富集培養(yǎng)基”)具有對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力和細(xì)胞產(chǎn)率所有必要的物質(zhì)，特別是鹽、微量元素、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、PH值調(diào)節(jié)劑、核苷酸。盡管這里使用的富集培養(yǎng)基含有上述物質(zhì)，但是并不是所有富集培養(yǎng)基含有這些成分。含有一種或多種上述物質(zhì)的富集培養(yǎng)基同樣適用?；A(chǔ)培養(yǎng)基和富集培養(yǎng)基這兩種都是不含血清，不含蛋白，不含蛋白胨，不含肽的。然而，向培養(yǎng)基中補(bǔ)充以上一種或多種添加劑是可能的。所有的培養(yǎng)基都是化學(xué)定義的，包含單個(gè)的明確定義的化學(xué)物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)以分批或流加的模式進(jìn)行。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)是以流加的模式設(shè)計(jì)的，在生產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)時(shí)是通過接種燒瓶中的儲(chǔ)備培養(yǎng)細(xì)胞開始的。培養(yǎng)瓶中以2-4X 105/ml活細(xì)胞接種密度接種。細(xì)胞培養(yǎng)1-4天。在第一次使用富集培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基需要補(bǔ)充。每隔1-3天培養(yǎng)基要分批添加。添加富集培養(yǎng)基要分批進(jìn)行(彈丸式添加)。添加培養(yǎng)基時(shí)可以是連續(xù)的，尤其是在生物反應(yīng)器中時(shí)。在流加實(shí)驗(yàn)時(shí)，可使用兩個(gè)不同的培養(yǎng)基。然而， 也有可能使用一個(gè)或兩個(gè)以上的不同培養(yǎng)基。只要細(xì)胞活力大于50%，培養(yǎng)基就可進(jìn)行接種。因此，培養(yǎng)時(shí)間大約是10-18天。每天都要從培養(yǎng)基中取樣品并進(jìn)行分析，例如細(xì)胞計(jì)數(shù)和代謝物測(cè)量?？贵w在培養(yǎng)基的上清液中的濃度采用ELISA或蛋白A HPLC方法來測(cè)定。儲(chǔ)備液是從測(cè)試物質(zhì)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基和/或添加的培養(yǎng)基來制備的，所述添加的培養(yǎng)基作為補(bǔ)充，以達(dá)到最終濃度。除非另有說明，所有的化學(xué)品均購(gòu)自SigmaGt. Louise， M0)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，給出了 Sigma化學(xué)品目錄號(hào)。在給含有測(cè)試物質(zhì)的生產(chǎn)瓶接種之前，儲(chǔ)備培養(yǎng)細(xì)胞要進(jìn)行離心分離。在相應(yīng)的培養(yǎng)基中，細(xì)胞球是懸浮的。以這種方式， 通過接種培養(yǎng)避免了物質(zhì)傳輸?shù)挠绊?。然而，在?shí)際生產(chǎn)的條件下，接種培養(yǎng)的離心分離是不需要的，并且也不必作的。實(shí)施例1 分別測(cè)試多胺和鐵及組合測(cè)試多胺和鐵該實(shí)施例表示高濃度多胺和鐵的組合的協(xié)同效應(yīng)。制備一種不含鐵和多胺的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)整測(cè)試物質(zhì)(即多胺和鐵)的最終濃度。 然后，所制備的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞接種。該實(shí)驗(yàn)以流加方式進(jìn)行的。使用的富集培養(yǎng)基是不含多胺和鐵的。圖1表示鐵是細(xì)胞生長(zhǎng)必不可少的物質(zhì)。最重要的是，如果精胺和鐵兩種物質(zhì)同時(shí)以高濃度使用，那么可以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。令人驚訝的是，兩種物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)顯示出了協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例2 在分批過程中，亞精胺作為多胺的來源以高濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)的目的表明，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)，亞精胺和精胺具有相似的積極促進(jìn)效應(yīng)。制備一種含有100mg/l的焦磷酸鐵(III)水合物(P6526)和不含有多胺的細(xì)胞培養(yǎng)基。制備了一種亞精胺(S4139)的儲(chǔ)備液。相應(yīng)量的亞精胺儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)節(jié)亞精胺的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖2的圖例中看出。然后，所制備的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞接種。該實(shí)驗(yàn)是以分批方式進(jìn)行的。圖2表示在一分批過程中，如果亞精胺可用，細(xì)胞會(huì)達(dá)到較高濃度。是我們驚訝的是，亞精胺的毒性在高濃度測(cè)試時(shí)未發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例3 在細(xì)胞高密度流加過程中，需要較高濃度的精胺嗎(FBI 17) ？通常情況下，在流加過程中細(xì)胞濃度的峰值高于分批過程的。因此，同分批過程的相比，對(duì)于營(yíng)養(yǎng)濃度的需求要高。尤其是在細(xì)胞高密度的過程中，如細(xì)胞濃度超過IXiO7/ ml，就需要更多精胺和鐵。制備一種含有100mg/l的焦磷酸鐵(III)水合物(P6526)和不含有多胺的細(xì)胞培養(yǎng)基。精胺(S4264)的儲(chǔ)備液制備成濃度為40g/l。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)節(jié)精胺的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖3的圖例中看出。然后，所制備的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞接種。 該實(shí)驗(yàn)是以流加方式進(jìn)行的。所有的培養(yǎng)基添加專有的富集培養(yǎng)基，所述富集培養(yǎng)基含有有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的底物，例如氨基酸和葡萄糖。富集培養(yǎng)基中不含多胺，含有焦磷酸鐵(III)水合物，其濃度為800mg/l。圖3表示隨著精胺濃度的增加細(xì)胞生長(zhǎng)更好。在給定鐵濃度的情況下，精胺的優(yōu)選濃度在實(shí)施例中是從40mg/l到120mg/l。實(shí)施例4 對(duì)于飽和高濃度精胺，需要較高濃度的鐵嗎(SF57) ？在實(shí)施例3中發(fā)現(xiàn)，精胺濃度為40mg/l時(shí)效果最好。細(xì)胞培養(yǎng)基制備成濃度恒定為40mg/l的精胺溶液。焦磷酸鐵(III)水合物(P6526)儲(chǔ)備液制備成濃度為5g/l和50g/ 1。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)整培養(yǎng)基中鐵的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖4的圖例中看出。然后，所制備的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞接種。該實(shí)驗(yàn)是以分批方式進(jìn)行的。圖4表示在精胺存在下，細(xì)胞能承受極高濃度的鐵。實(shí)施例5 在一分批過程中，精胺與硝酸鐵結(jié)合的分析(SF107)該實(shí)施例表示鐵和含有替代鐵的精胺的協(xié)同效應(yīng)。制備一種不含有鐵和多胺的細(xì)胞培養(yǎng)基。制備九水硝酸鐵(CAS :7782-61-8)和精胺的儲(chǔ)備液。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)整測(cè)試物質(zhì)的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖5的圖例中看出。然后，所制備的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞接種。該實(shí)驗(yàn)是以分批方式進(jìn)行的。圖5表示在分批過程中，如果精胺和鐵兩種物質(zhì)都是在高濃度時(shí)使用，細(xì)胞達(dá)到較高濃度，表明了兩種物質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例6 在流加過程中，精胺與檸檬酸鐵結(jié)合的分析(FB188)該實(shí)驗(yàn)分析了在流加過程中細(xì)胞高密度時(shí)，精胺結(jié)合檸檬酸鐵(III)的協(xié)同效應(yīng)。鐵來自于檸檬酸鐵(III) (CAS number :3522-50-7)。細(xì)胞培養(yǎng)基在制備時(shí)不含鐵和多胺。精胺儲(chǔ)備液制備成40g/l (S4264)。檸檬酸鐵(III)儲(chǔ)備液制備成50g/l。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)整培養(yǎng)基中精胺和檸檬酸鐵(III)的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖6的圖例中看出。富集培養(yǎng)基中不含鐵和多胺。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)是以流加方式進(jìn)行的。所有培養(yǎng)基添加含有便于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的物質(zhì)，例如氨基酸和葡萄糖。在第6天，所有培養(yǎng)基進(jìn)一步以檸檬酸鐵(III)進(jìn)行補(bǔ)充以達(dá)到最終濃度400mg/ 1。圖6表示達(dá)到最佳細(xì)胞生長(zhǎng)精胺和鐵都是必須的。此外，一個(gè)非常高的精胺和鐵的濃度是必要的，在細(xì)胞高密度流加過程中特別需要如此高的精胺和鐵的濃度，其中細(xì)胞濃度超過 lX107/ml.。實(shí)施例7 在流加過程中，精胺與不同濃度的檸檬酸鐵結(jié)合的實(shí)驗(yàn)(FB171-3)該實(shí)驗(yàn)的目的是測(cè)試精胺和其它鐵對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的積極促進(jìn)作用是否明顯。在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試在流加過程中檸檬酸鐵與含有精胺和不含精胺結(jié)合時(shí)的影響。制備一種不含鐵和多胺的細(xì)胞培養(yǎng)基。精胺儲(chǔ)備液制備成40g/l。檸檬酸鐵(III)儲(chǔ)備液制備成 50g/l(CASnumber :3522-50-7)。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)整精胺和檸檬酸鐵(III)的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖7的圖例中看出。接種細(xì)胞在不含多胺和鐵的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天以消耗細(xì)胞內(nèi)的鐵和多胺池。那么這些細(xì)胞被用作菌種。實(shí)驗(yàn)是以流加方式進(jìn)行的。所有培養(yǎng)基添加便于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的物質(zhì)，例如氨基酸和葡萄糖。該富集培養(yǎng)基不含多胺，含有濃度為 3200mg/l的檸檬酸鐵(III)。圖7表明精胺與其它鐵一起也具有積極促進(jìn)作用。此外，在精胺存在下，細(xì)胞能允許鐵濃度高達(dá)800mg/l。
實(shí)施例8 在流加過程中，精胺與磷酸鐵(III)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)(171-2)該實(shí)驗(yàn)的目的是看看其它鐵是否同先前分析的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的聚胺濃度具有一樣的積極促進(jìn)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了含有精胺和不含精胺的磷酸鐵(III) (F152;3)。制備一種不含鐵和多胺的細(xì)胞培養(yǎng)基。精胺儲(chǔ)備液制備成40g/l(S4^4)。磷酸鐵(III)儲(chǔ)備液制備成50g/l。相應(yīng)量的儲(chǔ)備液吸入到培養(yǎng)基中以調(diào)整精胺和磷酸鐵(III)預(yù)期的最終濃度，這一點(diǎn)可從圖8的圖例中看出。然后用所制備的細(xì)胞進(jìn)行接種。實(shí)驗(yàn)是以流加方式進(jìn)行的。 所有培養(yǎng)基添加含有便于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的物質(zhì)，例如氨基酸和葡萄糖。該富集培養(yǎng)基不含多胺，含有濃度為800mg/l的磷酸鐵(III)。圖8表明精胺與磷酸鐵(III) 一起也具有積極促進(jìn)作用。令人驚奇的是，在精胺存在下，如此高的鐵濃度對(duì)細(xì)胞是沒毒性的，而是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。實(shí)施例9 在流加過程中，精胺結(jié)合右旋糖酐鐵的實(shí)驗(yàn)(174-1)該實(shí)驗(yàn)的目的是看看其它鐵是否同先前分析的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的聚胺濃度具有一樣的積極促進(jìn)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，采用右旋糖酐鐵(D8517)進(jìn)行測(cè)試。制備一種濃度為 40mg/l的精胺細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基不含鐵。濃度為100g/l的右旋糖酐鐵溶液購(gòu)自Sigma。在開始試驗(yàn)之前，細(xì)胞在沒有鐵的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。以這種方式。細(xì)胞內(nèi)的鐵池消耗了。然而，上面細(xì)胞對(duì)鐵的需要對(duì)于精胺和右旋糖酐鐵的功能是不必要的。細(xì)胞缺鐵會(huì)餓死。這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到上述制備的培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)是以流加方式進(jìn)行的。富集培養(yǎng)基不含精胺和鐵。所有培養(yǎng)基添加便于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞活力的物質(zhì)，例如氨基酸和葡萄糖。在第6天，所有培養(yǎng)基進(jìn)一步以右旋糖酐鐵進(jìn)行補(bǔ)充以達(dá)到最終濃度250mg/l。圖9表示在精胺存在下，達(dá)到最佳細(xì)胞生長(zhǎng)高濃度的右旋糖酐鐵是必須的。令人驚奇的是，如此高的鐵濃度對(duì)細(xì)胞是沒毒性的，而是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)基添加劑，所述培養(yǎng)添加劑含有至少一種多胺濃度至少為20mg/l和至少一種鐵源濃度至少為ang/1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述多胺的濃度至少為35mg/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述多胺的濃度至少為50mg/l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述鐵源的濃度至少為 5mg/L·
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述鐵源的濃度至少為 240mg/l。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述鐵源的濃度至少為 480mg/l。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述鐵源含有!^(II)1 子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述鐵源含有!^e(III)1 子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述鐵源可選自下面一種或多種化合物、或它們的鹽、或它們的水合物或無水形式磷酸鐵(III)、焦磷酸鐵 (III)、硝酸鐵(III)、硫酸亞鐵(II)、三氯化鐵(III)、乳酸亞鐵(II)、檸檬酸鐵(III)、檸檬酸鐵(III)銨、右旋糖酐鐵、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述多胺可選自下面一種或多種化合物、或它們的鹽、或它們的水合物或無水形式亞精胺、精胺、去甲精胺、去甲精瞇、高精胺、高精瞇和尸胺。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述多胺是精胺。
12.—種培養(yǎng)基，含有前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)添加劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述培養(yǎng)基，其特征在于所述多胺的濃度為30mg/l-120mg/l。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基中至少有一種鐵源， 濃度為 50mg/l-450mg/l。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基，其特征在于所述多胺的濃度為 30mg/l-120mg/l 和所述鐵源的濃度為 50mg/l_450mg/l。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑包括一種水溶液、一種碳源和一種氮源。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述的培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑至少含有一種以下物質(zhì)金黃三羧酸(ΑΤΑ)、二氯乙酸(DCA)、琥珀酸和它們的鹽及衍生物。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述的培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑含有下面三種物質(zhì)a)金黃三羧酸(ATA)、b) 二氯乙酸(DCA)、c)琥珀酸和它們的鹽及衍生物。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑不含血清。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑不含谷氨酰胺。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑不含蛋白。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑不含水解產(chǎn)物。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求12至21中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基是富集培養(yǎng)基。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑，其特征在于所述培養(yǎng)基或培養(yǎng)添加劑是以試劑盒的形式提供的。
25.一種制備培養(yǎng)基的方法，其特征在于根據(jù)任一權(quán)利要求1至11或16至M中任一項(xiàng)所述培養(yǎng)添加劑添加至液體培養(yǎng)基中。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基是一種包括一種水溶液、一種碳源和一種氮源的常規(guī)的培養(yǎng)基。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或沈所述的方法制備的一種培養(yǎng)基。
28.權(quán)利要求1至11或16至M所述的制備培養(yǎng)基的培養(yǎng)添加劑的應(yīng)用。
29.一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于a)根據(jù)權(quán)利要求12至M中任一項(xiàng)或權(quán)利要求27所提供的細(xì)胞和培養(yǎng)基，b)在所述培養(yǎng)基中適宜培養(yǎng)所述細(xì)胞的條件下，在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間超過兩個(gè)通道或多于4天進(jìn)行培養(yǎng)。
31.根據(jù)權(quán)利要求四或30所述方法，其特征在于所述方法是一個(gè)連續(xù)過程、一個(gè)半連續(xù)過程、一個(gè)分批過程、一個(gè)分流批量過程、一個(gè)流加過程或一個(gè)灌注過程。
32.根據(jù)權(quán)利要求四至31中任一項(xiàng)所述方法，其特征在于所述方法是一種從所述細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種蛋白的方法。
33.一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于a)提供了細(xì)胞和第一培養(yǎng)基，b)在所述第一培養(yǎng)基中適宜培養(yǎng)所述細(xì)胞的條件下，在所述第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞， 用細(xì)胞接種所述第一培養(yǎng)基之前、或之后、或培養(yǎng)期間，向第一培養(yǎng)基中添加根據(jù)權(quán)利要求 1至11或16至M中任意所述的培養(yǎng)添加劑，這樣培養(yǎng)細(xì)胞期間形成了第二培養(yǎng)基。
34.一種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其特征在于a)提供了細(xì)胞和第一培養(yǎng)基，b)在所述第一培養(yǎng)基中適宜培養(yǎng)所述細(xì)胞的條件下，在所述第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，c)用細(xì)胞接種所述第一培養(yǎng)基之前、或之后、或培養(yǎng)期間，在第一培養(yǎng)基中加入至少一種多胺或至少一種鐵源或兩者。所有多胺的總量和所有鐵源的總量生成權(quán)利要求1至M中任意項(xiàng)所述的濃度，所述多胺的總量是指已存在的和添加到步驟a)、b)和c)中的，所述鐵源的總量是指已存在的和添加到步驟a)、b)和c)中的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的包括多胺和鐵的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，一種含有該細(xì)胞培養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基和一種使用該細(xì)胞培養(yǎng)添加劑提高細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞活力或細(xì)胞產(chǎn)率的方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102317440SQ200980102217
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2009年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日
發(fā)明者克斯廷·厄勒斯, 奧拉夫·克呂格爾, 拉爾斯·科伯 申請(qǐng)人:塞爾卡有限公司