一種膽木無菌苗的誘導培養(yǎng)基及膽木脫毒快繁方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及組培快速繁殖技術(shù)領域，更具體地，涉及一種膽木無菌苗的誘導培養(yǎng) 基及膽木脫毒快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽木（TVai/cJea /Yerre)為茜草科烏檀屬植物烏檀，以其枝、干、樹皮 等部位入藥，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，是膽木浸膏片、膽木注射液等中成藥的主要 原料，其被廣泛應用于乳腺炎、急性扁桃體炎，咽喉炎，支氣管炎，腸炎，膽囊炎、肺炎，泌尿 系感染等癥的治療。由于膽木為重要的醫(yī)藥原料，野生資源破壞嚴重，采集野生資源已經(jīng)不 能滿足生產(chǎn)需要，開展規(guī)范化生產(chǎn)是解決藥材短缺的有效途徑，而種苗繁育是規(guī)范化生產(chǎn) 的重要組成部分，由于膽木果實成熟周期較長，種子成熟度不一，加上種子狹小，種皮堅硬， 休眠期長，導致膽木種苗繁育周期較長，苗木供應緊張，遠遠不能滿足市場的需要，這使膽 木在我國境內(nèi)的推廣栽培和資源利用受到了極大的限制。
[0003] 利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立膽木脫毒快繁體系是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)膽木優(yōu)質(zhì)種苗的有效 途徑，現(xiàn)有技術(shù)中有關膽木組培苗生產(chǎn)中都以膽木種子為外植體，闡述了膽木組培方法，其 主要包括外植體消毒、叢生苗的誘導、生根和煉苗移栽等環(huán)節(jié)，從技術(shù)而言，其都屬于膽木 組培脫毒快繁體系，但是其體系中增殖培養(yǎng)基由6-BA和NAA組成，無法有效改善膽木無菌 種子苗繁育中存在的出苗周期長、出苗率低等問題，在增殖培養(yǎng)中由于缺乏椰子乳等有機 物質(zhì)和TDZ等高效生長素，亦無法克服膽木組培中存在的繁殖效率低、年繁殖種苗數(shù)量有 限等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，首先提供一種膽木 無菌苗的誘導培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種膽木無菌苗的增殖培養(yǎng)基。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種膽木無菌苗的生根培養(yǎng)基。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種膽木脫毒快繁方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的： 一種膽木無菌苗的誘導培養(yǎng)基，包括含有0. 1~10. 0%有機添加物、0. 05~0. 2 mg/L DA-6的3/4 MS培養(yǎng)基。
[0009] 優(yōu)選地，所述有機添加物選自椰子水、胡蘿卜泥、土豆泥。
[0010] 更優(yōu)選地，所述誘導培養(yǎng)基是含質(zhì)量濃度為10%的椰子水和0. 1 mg/L DA-6的3/4 MS培養(yǎng)基。
[0011] 優(yōu)選地，當在誘導培養(yǎng)基中添加0. 05~0. 5mg/L 6六3時，可以進一步提高無菌苗 的出苗率，縮短出苗時間，此時含有6六3的誘導培養(yǎng)基的pH值為5. 6~6. 0。
[0012] 本發(fā)明還提供一種膽木無菌苗的增殖培養(yǎng)基，是在所述誘導培養(yǎng)基的基礎上添加 0. 05~1. Omg/L 6-BA、0. 05~0. 1 mg/L的NAA ;或者是在權(quán)利要求1所述誘導培養(yǎng)基的基 礎上添加0. 05~1. 0 mg/L TDZ ;此時增殖培養(yǎng)基的pH值為5. 6~6. 0,視種苗需求數(shù)量可 增殖25~30d。
[0013] 更優(yōu)選地，所述增殖培養(yǎng)基中6-BA濃度為0. 5mg/L，NAA濃度為0. lmg/L ;或者所 述增殖培養(yǎng)基中TDZ濃度0. lmg/L。
[0014] 本發(fā)明還提供一種膽木無菌苗的生根培養(yǎng)基，是在所述誘導培養(yǎng)基的基礎上添加 0· 1%~1. 0%的活性炭或0· 05~0· 1 mg/L的NAA ;此時生根培養(yǎng)基的pH值為5. 6~6. 0。
[0015] 本發(fā)明還提供一種膽木的脫毒快繁方法，包括以下步驟： 51. 將無菌的膽木種子接種于誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至無菌苗的長度為0. 5~1. 0 cm ; 52. 將無菌苗切割成帶有1個頂芽或1~2個腋芽、且長度為1. 0~2. 0 cm的莖段后 接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 53. 待長出微枝長度為2.0~3.0 cm，接種于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)； 54. 將膽木苗進行室內(nèi)煉苗后移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中完成膽木的脫毒快繁。
[0016] 優(yōu)選地，上述步驟SI、S2、S3所述培養(yǎng)條件為溫度為25~28°C、濕度為70%~80%、 光照強度為80~100 lx、光照8~10 h/d。
[0017] 優(yōu)選地，S3在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生根長度為1. 5~2. 0 cm。
[0018] 具體地，S4所述煉苗時將生根培養(yǎng)的膽木苗于隱蔽度為15%~20%的蔭棚，煉苗 7 ~10 d 〇
[0019] 優(yōu)選地，S4所述培養(yǎng)基質(zhì)為10%~15%蛭石，10%~15%牛糞，10%~15%椰糠和 55% ~70% 土壤。
[0020] 優(yōu)選地，S1所述無菌的膽木種子的獲得過程為：將清洗后的膽木果實外植體在超 凈工作臺上用質(zhì)量濃度為75%的乙醇溶液浸泡30~60s，然后用無菌水沖洗3~5次，再用 質(zhì)量濃度為〇. 1%的氯化萊(含1%吐溫)溶液消毒7~15min，然后用無菌水沖洗3~5次， 將種子從消毒后的果實外植體中剝離出即得。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種膽木無菌苗的誘導培養(yǎng)基及膽木脫毒快繁方法，所述誘導培養(yǎng)基包 括含有〇. 1~10. 〇%有機添加物、〇. 05~0. 2 mg/L DA-6的3/4 MS培養(yǎng)基；還通過優(yōu)化脫 毒方法、優(yōu)化無菌苗培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)程序，建立了膽木的脫毒快繁方法；與傳統(tǒng) 繁殖方法相比，具有省工省時省地，成本低，繁殖率高(增殖系數(shù)> 30代/年)、出苗率高、繁 殖時間短、成活率高（> 95%)的優(yōu)點，有效解決了膽木種苗繁育中存在的繁殖周期長、繁殖 效率低、種子苗出苗率低、移栽成活率低、種苗繁育成本高等問題，實現(xiàn)了膽木種苗繁育過 程的快速高效、低成本、生長繁育周期不受季節(jié)及樹齡限制等目的，為膽木種苗的工業(yè)化生 產(chǎn)的奠定了基礎。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。 在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換， 均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領域技術(shù)人員所熟知 的常規(guī)手段。
【具體實施方式】 [0023] 中，污染率是指接種lOd后被細菌或真菌污染的外植體瓶數(shù)占總接 種瓶數(shù)的百分率；褐化率是指接種l〇d后外植體褐化變黑的瓶數(shù)占總接種瓶數(shù)的百分率； 增殖率是指接種l〇d后外植體開始生長的瓶數(shù)占總接種瓶數(shù)的百分率；月增殖系數(shù)是指接 種30d后，與原接種量相比，增殖的倍數(shù)百分率。
[0024] 實施例1膽木外植體消毒程序優(yōu)化 本實驗所用為2014年4月~7月在海南省儋州、五指山、白沙、?？诘仁锌h采收的膽木 (Λ^?/cJea ο/Λ?/Μ?·? Pierre)果實為實驗材料。
[0025] 將膽木果實分為6組，用75%酒精消毒30~60s后、升汞(質(zhì)量濃度0. 1%，含1%吐 溫)消毒7~15min，無菌水漂洗5次至pH=7,重復3次，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱全光照培養(yǎng)， 于10~12d后統(tǒng)計污染率與增殖率。
[0026] 實驗如表1所示，（1)控制升汞消毒時間為lOmin，考察75%酒精消毒時間對消毒 效果的影響，結(jié)果表明：當升萊消毒時間為l〇min，30s、45s和60s的酒精消毒對膽木果實的 消毒效果影響不大，其污染率在30±3%，增殖率在30%±3% ; (2)控制酒精消毒時間為30s， 考察0. 1%升汞消毒時間對消毒效果的影響，結(jié)果表明：當酒精消毒時間為30s，消毒效果隨 升汞消毒時間的遞增而愈好，其中控制酒精消毒時間為30s，0. 1%升汞消毒時間為12min， 其污染率15±2%，增殖率為38%±2% ;酒精消毒時間為30s，0. 1%升汞消毒時間為15min，其 污染率12±2%，增殖率為36%±2%。
[0027] 因此確定膽木果實的最佳消毒程序為：75%酒精消毒30s，0. 1%升汞消毒時間為 12min，其污染率在15 ±2%，增殖率為38 ±2%。
[0028] 實施例2培養(yǎng)基篩選及優(yōu)化 本實施例中所有的培養(yǎng)基都含有3.0%質(zhì)量濃度的蔗糖；所用的3/4 MS培養(yǎng)基、1/2 MS 培養(yǎng)基都是將大量元素的濃度降低至1/2、3/4,其他成分保持不變所得到的培養(yǎng)基。
[0029] 將種子從消毒的膽木果實中剝離出，將消毒后的膽木種子分別接種于MS培養(yǎng)基、 3/4 MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、改良培養(yǎng)基1 (麗Sp 3/4MS培養(yǎng)基+10%的椰子水)、改良培 養(yǎng)基2 (麗S2,3/4MS培養(yǎng)基+10%胡蘿卜泥)、改良培養(yǎng)基3 (麗S3,3/4MS培養(yǎng)基+10% 土豆 泥)、改良培養(yǎng)基4 (MMS4, 3/4MS培養(yǎng)基+10%的椰子水+0. 05 mg/L的DA-6)、改良培養(yǎng)基5 (MMS5, 3/4MS 培養(yǎng)基 +10% 椰子水 +0. 10mg/L DA-6)、改良培養(yǎng)基 6(MMS6, 3/4MS 培養(yǎng)基 +10% 椰子水+0. 2 mg/L DA-6)，然后在全自動光照培養(yǎng)箱，控制培養(yǎng)條件為：溫度25~28°C，濕 度70%~80%，光照強度80~100 lx，光照8~10 h/d，觀測種子的出苗時間和生長狀況。
[0030] 結(jié)果如表2所示，在MS培養(yǎng)基上，膽木種子于47d開始出苗，出苗周期持續(xù)30d， 植物生長較弱小，于接種后120d可達0. 5~1. 0 cm ;在3/4 MS培養(yǎng)基上，膽木種子于50d 開始出苗，出苗周期持續(xù)20d，膽木植株粗壯，但生長較緩慢，于接種后120d可達0. 5~1. 0 cm ;在1/2 MS培養(yǎng)基上，膽木種子于48d開始出苗，出苗周期持續(xù)20d，膽木種苗根系細長， 植株纖細，長勢較弱，生長較緩慢，于接種后120d可達0. 5~1. 0 cm ;在附加了 10%的椰子 乳、土豆泥、胡蘿卜泥等的改良培養(yǎng)基（麗Si、麗S2和麗S3)上，在一定程度上改善了膽木種 苗纖細、生長緩慢等劣勢，但效果不是非常明顯；以附加了 10%的椰子乳的改良培養(yǎng)基為基 礎，在附加了 0. 05~0. 20 mg/L的DA-6改良培養(yǎng)基（麗S4、麗S5和麗S6)有效縮短了膽木 出苗時間，提高了膽木生長狀況，其中尤以MMS5改良效果最