專利名稱：精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物體外診斷試劑及其制備方法，特別是精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法。
背景技術(shù)：
免疫性不育是因抗原抗體反應(yīng)干擾了受孕過(guò)程造成的不育，其中較多見(jiàn)的是精子抗體導(dǎo)致的不育。一些研究指出，大約5％～30％不明原因的不育夫婦和50％～70％的輸精管結(jié)扎男子血清中可檢出直接針對(duì)精子的精子抗體。大約6.8％～13％以及50％～75％的不育男子和輸精管吻合男子精液中可檢測(cè)出直接針對(duì)精子的精子結(jié)合抗體。血清中精子抗體達(dá)到一定水平時(shí)可引起精子凝集、制動(dòng)，干擾精子運(yùn)行，抑制精卵結(jié)合，致使受精障礙而影響生育力。
檢測(cè)結(jié)合于精子表面的精子結(jié)合抗體，是診斷男性免疫性不育，以及男性在接受輸精管復(fù)育術(shù)后，能否恢復(fù)生育能力的重要依據(jù)。而生殖道局部抗體由于可直接作為一種空間屏障直接干擾受精而影響生育力，因此比較篩選一種既可檢測(cè)血清精子抗體，又可檢測(cè)男性生殖道結(jié)合抗體的方法十分必要。近來(lái)有關(guān)精子抗體的臨床重要性，影響生育的機(jī)制，以及檢測(cè)精子抗體的方法比較，國(guó)內(nèi)外均有較多的報(bào)道。目前應(yīng)用的抗精子抗體檢測(cè)方法有精子制動(dòng)試驗(yàn)(SIT)；精子凝集試驗(yàn)(STAT)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)；間接免疫熒光試驗(yàn)(IIF)和混合凝集試驗(yàn)(MAR)。唯MAR方法可檢測(cè)精子表面的結(jié)合抗體和體液中存在的抗精子抗體，該方法簡(jiǎn)便、敏感，且由于不必用預(yù)洗過(guò)的精子，能檢測(cè)精子活率低、數(shù)目少的樣品，出結(jié)果快，為WHO推薦用于男性精子抗體檢測(cè)的首選方法。
目前國(guó)內(nèi)僅有安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司生產(chǎn)的抗精子抗體檢測(cè)試劑盒使用MAR法檢測(cè)抗精子抗體，其產(chǎn)品的專利號(hào)為02112511。該試劑包括2-3％的敏化綿羊紅細(xì)胞懸液，1∶28-1∶210兔抗人IgG，2-3％的敏化綿羊紅細(xì)胞懸液的制備包括取綿羊血、洗滌、醛化處理、鞣化處理、敏化處理等；1∶28-1∶210的制備包括取家兔血、血清分離等。然而，該制備方法步驟多，并且由于該產(chǎn)品使用動(dòng)物來(lái)源的血細(xì)胞，各批次難免有差異，也不能完全排除潛在動(dòng)物來(lái)源病原物質(zhì)的威脅。而國(guó)際生育技術(shù)有限公司出售的Sperm Mar TestKit檢測(cè)精子結(jié)合抗體雖靈敏度高，但價(jià)格昂貴，不能滿足國(guó)內(nèi)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種大大節(jié)約成本、制備方便、性能優(yōu)良的精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑及其制備方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，該試劑是由敏化羧化膠乳液、羊抗人丙種球蛋白血清組成的液體型雙試劑，敏化羧化膠乳液含有標(biāo)記人丙種球蛋白的羧化膠乳。
所述敏化羧化膠乳液還包括輔料，輔料包括磷酸鹽緩沖液a、磷酸鹽緩沖液b、碳化二亞胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
敏化羧化膠乳液包含按體積計(jì)8～20％的羧化膠乳，優(yōu)選8～15％的羧化膠乳，更優(yōu)選12％的羧化膠乳；按重量計(jì)0.15～0.25克％的人丙種球蛋白，優(yōu)選0.20克％的人丙種球蛋白，更優(yōu)選0.15克％的人丙種球蛋白；磷酸鹽緩沖液a的含量為0.1～0.2M、PH值為6.5～8.0；優(yōu)選為0.2M、PH值為7.2；磷酸鹽緩沖液b的含量為0.05～0.15M、PH值為6.7～8.4；優(yōu)選為0.1M、PH值為7.6；碳化二亞胺的含量為0.38～1.9毫克％；優(yōu)選為0.96毫克％；6-氨基己酸的含量為0.1～0.66毫克％；優(yōu)選為0.26毫克％；甘氨酸的含量為22.5～37.5毫克％；優(yōu)選為30.0毫克。
羊抗人丙種球蛋白血清滴定效價(jià)為1∶50～1∶150，優(yōu)選1∶100。
精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，制備方法包括反應(yīng)步驟、純化步驟和保存步驟反應(yīng)步驟取8～20ml的羧化膠乳，加入88ml的蒸餾水混勻，再加入0.15～0.25克的人丙種球蛋白；在20℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌10小時(shí)終止反應(yīng)；純化步驟在4～8℃，以5000～6000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀加蒸餾水100ml混勻，在4～8℃，以5000～6000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄上清，沉淀加入生理鹽水至100ml；保存步驟加入慶大霉素1.0ml混勻，質(zhì)量檢測(cè)，分裝，4～8℃保存。
精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，反應(yīng)步驟還可以為取羧化膠乳8～20ml，加入磷酸鹽緩沖液a 88ml混勻，再加入碳化二亞胺0.38～1.9毫克％，6-氨基己酸0.1～0.66毫克％，在4～8℃以500轉(zhuǎn)/min攪拌60～90min，在4～8℃，以8000～10000轉(zhuǎn)/min離心20～30min，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液b 100ml混勻；加入人丙種球蛋白0.15～0.25克％，加入碳化二亞胺0.38～1.9毫克％；在4～8℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌250～300min，加入22.5～37.5毫克％甘氨酸終止反應(yīng)；所用磷酸鹽緩沖液a和磷酸鹽緩沖液b分別由A液和B液配置而成，A液的制備方法為將分子量為178.05的磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；B液的制備方法為將分子量為156.03磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；磷酸鹽緩沖液a的制備方法為取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸鹽緩沖液b的制備方法為取A液435ml，B液65ml，蒸餾水500ml混合即成。
通過(guò)上面的敘述可以看出，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)可滿足國(guó)內(nèi)各醫(yī)院、計(jì)劃生育部門研究與臨床需要，為診斷男性免疫性不育，以及男性在接受輸精管復(fù)育術(shù)后，能否恢復(fù)生育能力提供重要依據(jù)，具較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，它操作簡(jiǎn)便，快速、敏感、特異。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實(shí)施例1精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，該試劑是由敏化羧化膠乳液、羊抗人丙種球蛋白血清組成的液體型雙試劑，敏化羧化膠乳液含有標(biāo)記人丙種球蛋白的羧化膠乳。敏化羧化膠乳液包含按體積計(jì)8％的羧化膠乳，按重量計(jì)0.25克％的人丙種球蛋白，羊抗人丙種球蛋白血清滴定效價(jià)為1∶50。
精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，制備方法包括反應(yīng)步驟、純化步驟和保存步驟反應(yīng)步驟取8ml的羧化膠乳，加入88ml的蒸餾水混勻，再加入0.25克的人丙種球蛋白；在20℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌10小時(shí)終止反應(yīng)；純化步驟在4℃，以5000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀加蒸餾水100ml混勻，在4℃，以5000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄上清，沉淀加入生理鹽水至100ml；保存步驟加入慶大霉素1.0ml混勻，質(zhì)量檢測(cè)，分裝，4℃保存。
實(shí)施例2精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，該試劑是由敏化羧化膠乳液、羊抗人丙種球蛋白血清組成的液體型雙試劑，敏化羧化膠乳液含有標(biāo)記人丙種球蛋白的羧化膠乳。
所述敏化羧化膠乳液還包括輔料，輔料包括磷酸鹽緩沖液a、磷酸鹽緩沖液b、碳化二亞胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
敏化羧化膠乳液包含按體積計(jì)20％的羧化膠乳，0.20克％的人丙種球蛋白，磷酸鹽緩沖液a的含量為0.1M、PH值為6.5；磷酸鹽緩沖液b的含量為0.05M、PH值為6.7；碳化二亞胺的含量為0.38毫克％；6-氨基己酸的含量為0.1；甘氨酸的含量為22.5毫克％；羊抗人丙種球蛋白血清滴定效價(jià)為1∶150。
精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，制備方法包括反應(yīng)步驟、純化步驟和保存步驟反應(yīng)步驟取羧化膠乳20ml，加入磷酸鹽緩沖液a 88ml混勻，再加入碳化二亞胺1.9毫克％，6-氨基己酸0.66毫克％，在8℃以500轉(zhuǎn)/min攪拌90min，在8℃，以10000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液b 100ml混勻；加入人丙種球蛋白0.25克％，加入碳化二亞胺1.9毫克％；在8℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌300min，加入37.5毫克％甘氨酸終止反應(yīng)；純化步驟在8℃，以5000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀加蒸餾水100ml混勻，在8℃，以6000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄上清，沉淀加入生理鹽水至100ml；保存步驟加入慶大霉素1.0ml混勻，質(zhì)量檢測(cè)，分裝，8℃保存。
所用磷酸鹽緩沖液a和磷酸鹽緩沖液b分別由A液和B液配置而成，A液的制備方法為將分子量為178.05的磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；B液的制備方法為將分子量為156.03磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；磷酸鹽緩沖液a的制備方法為取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸鹽緩沖液b的制備方法為取A液435ml，B液65ml，蒸餾水500ml混合即成。
實(shí)施例3精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，該試劑是由敏化羧化膠乳液、羊抗人丙種球蛋白血清組成的液體型雙試劑，敏化羧化膠乳液含有標(biāo)記人丙種球蛋白的羧化膠乳。
敏化羧化膠乳液還包括輔料，輔料包括磷酸鹽緩沖液a、磷酸鹽緩沖液b、碳化二亞胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
敏化羧化膠乳液包含按體積計(jì)12％的羧化膠乳，按重量計(jì)0.15克％的人丙種球蛋白；磷酸鹽緩沖液a的含量為0.2M、PH值為7.2；磷酸鹽緩沖液b的含量為0.1M、PH值為7.6；碳化二亞胺含量為0.96毫克％；6-氨基己酸的含量為0.26毫克％，甘氨酸的含量為30.0毫克。
羊抗人丙種球蛋白血清滴定效價(jià)為1∶100。
精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，制備方法包括反應(yīng)步驟、純化步驟和保存步驟反應(yīng)步驟為取羧化膠乳12ml，加入磷酸鹽緩沖液a 88ml混勻，再加入碳化二亞胺0.96毫克％，6-氨基己酸0.26毫克％，在4℃以500轉(zhuǎn)/min攪拌60min，在4℃，以8000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液b 100ml混勻；加入人丙種球蛋白0.15克％，加入碳化二亞胺0.96毫克％；在4℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌250min，加入30.0毫克％甘氨酸終止反應(yīng)；純化步驟在4℃，以5000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀加蒸餾水100ml混勻，在4℃，以5000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄上清，沉淀加入生理鹽水至100ml；保存步驟加入慶大霉素1.0ml混勻，質(zhì)量檢測(cè)，分裝，4℃保存。
所用磷酸鹽緩沖液a和磷酸鹽緩沖液b分別由A液和B液配置而成，A液的制備方法為將分子量為178.05的磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；B液的制備方法為將分子量為156.03磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；磷酸鹽緩沖液a的制備方法為取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸鹽緩沖液b的制備方法為取A液435ml，B液65ml，蒸餾水500ml混合即成。
實(shí)施例3為本發(fā)明的最佳實(shí)施例，按實(shí)施例3配制的試劑，用于檢測(cè)。
檢測(cè)方法如下一、直接法適用于檢測(cè)精液中精子結(jié)合抗體。取10μl待檢人新鮮精液和10μl敏化羧化膠乳液于載玻片上混合，再取10μl羊抗人IgG血清充分混勻后蓋上蓋玻片，置37℃孵育3～5分鐘，在200X顯微鏡下觀察結(jié)果，一般觀察5個(gè)視野，計(jì)算活動(dòng)精子結(jié)合膠乳顆粒的百分率。
10％～25％的活動(dòng)精子粘附了膠乳顆粒判為(+)；
25％～50％的活動(dòng)精子粘附了膠乳顆粒判為(++)；50％～75％的活動(dòng)精子粘附了膠乳顆粒判為(+++)；＞75％的活動(dòng)精子粘附了膠乳顆粒判為(++++)；粘附膠乳顆粒的活動(dòng)精子＜10％判為陰性。
應(yīng)用直接法檢測(cè)不育男子(妻子經(jīng)婦科雙合診，輸卵管碘油造影，基礎(chǔ)體溫測(cè)定未發(fā)現(xiàn)不育原因)，接受輸精管吻合術(shù)后1～12月隨訪到的男子，輸精管栓堵不完全和堵后再通男子，禁欲3～7天，取精液作精子結(jié)合抗體測(cè)定，并與進(jìn)口Sperm MarTest試劑作了比較，獲得滿意結(jié)果(見(jiàn)表1)。
表1 兩種膠乳試劑對(duì)不育及輸精管吻合后男子精液中結(jié)合抗體的檢測(cè)結(jié)果比較(％)

二、間接法適用檢測(cè)男、女血清和女性生殖道分泌物中的精子抗體。
1.待檢血清或生殖道分泌液56℃，30分鐘滅活；2.己滅活待檢血清或生殖道分泌液用培養(yǎng)液4倍稀釋(10uL∶30uL)于小試管中；3.加新鮮液化正常人精液40uL于(B)小試管中，(37℃)保溫1小時(shí)，以下按直接法進(jìn)行4.取上述保溫后混合物10μl于載玻片上；5.加10μl敏化羧化膠乳液(LatexAg)，并用蓋玻片充分混勻；6.加10μl羊抗人IgG抗血清(Latex Ab)亦用蓋玻片充分混勻，蓋上蓋玻片，置(37℃)3～5分鐘，在200X顯微鏡下觀察結(jié)果。
我們用精子結(jié)合抗體檢測(cè)藥盒使用間接法對(duì)經(jīng)精子微量凝集試驗(yàn)(MTAT)和精子制動(dòng)試驗(yàn)(SIT)檢測(cè)定為陽(yáng)性和陰性的部份血清(接受輸精管吻合術(shù)后患者和不育患者血清)作測(cè)定，其比較結(jié)果列于表2
表2 間接法檢測(cè)血清與MTAT，SIT的結(jié)果比較

權(quán)利要求
1.精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于該試劑是由敏化羧化膠乳液、羊抗人丙種球蛋白血清組成的液體型雙試劑，敏化羧化膠乳液含有標(biāo)記人丙種球蛋白的羧化膠乳。
2.如權(quán)利要求1所述的精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于所述敏化羧化膠乳液還包括輔料。
3.如權(quán)利要求2所述的精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于，所述輔料包括磷酸鹽緩沖液a、磷酸鹽緩沖液b、碳化二亞胺、甘氨酸、6-氨基己酸。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于，敏化羧化膠乳液包含按體積計(jì)8～20％的羧化膠乳；按重量計(jì)0.15克％～0.25克％的人丙種球蛋白；磷酸鹽緩沖液a的含量為0.1～0.2M、PH值為6.5～8.0；磷酸鹽緩沖液b的含量為0.05～0.15M、PH值為6.7～8.4；碳化二亞胺的含量為0.38～1.9毫克％；6-氨基己酸的含量為0.1～0.66毫克％；甘氨酸的含量為22.5～37.5毫克％。
5.如權(quán)利要求4所述的精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于，所述的敏化羧化膠乳液包含按體積計(jì)12％的羧化膠乳；按重量計(jì)0.15克％的人丙種球蛋白；磷酸鹽緩沖液a的含量為0.2M、PH值為7.2；磷酸鹽緩沖液b的含量為0.1M、PH值為7.6；碳化二亞胺的含量為0.96毫克％；6-氨基己酸的含量為0.26毫克％；甘氨酸的含量為30.0毫克％。
6.如權(quán)利要求1所述精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于，羊抗人丙種球蛋白血清滴定效價(jià)為1∶50～1∶150。
7.如權(quán)利要求1所述精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于，羊抗人丙種球蛋白血清滴定效價(jià)為1∶100。
8.權(quán)利要求1所述精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，制備方法包括反應(yīng)步驟、純化步驟和保存步驟反應(yīng)步驟取8～20ml的羧化膠乳，加入88ml的蒸餾水混勻，再加入0.15～0.25克的人丙種球蛋白；在20℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌10小時(shí)終止反應(yīng)；純化步驟在4～8℃，以5000～6000轉(zhuǎn)/min離心30min，棄上清，沉淀加蒸餾水100ml混勻，在4～8℃，以5000～6000轉(zhuǎn)/min離心20min，棄上清，沉淀加入生理鹽水至100ml；保存步驟加入慶大霉素1.0ml混勻，質(zhì)量檢測(cè)，分裝，4～8℃保存。
9.如權(quán)利要求8所述精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，反應(yīng)步驟還可以為取羧化膠乳8～20ml，加入磷酸鹽緩沖液a 88ml混勻，再加入碳化二亞胺0.38～1.9毫克％，6-氨基己酸0.1～0.66毫克％，在4～8℃以500轉(zhuǎn)/min攪拌60～90min，在4～8℃，以8000～10000轉(zhuǎn)/min離心20～30min，棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液b 100ml混勻；加入人丙種球蛋白0.15～0.25克％，加入碳化二亞胺0.38～1.9毫克％；在4～8℃，以500轉(zhuǎn)/min攪拌250～300min，加入22.5～37.5毫克％甘氨酸終止反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求9所述精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于所用磷酸鹽緩沖液a和磷酸鹽緩沖液b分別由A液和B液配置而成，A液的制備方法為將分子量為178.05的磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)35.61克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；B液的制備方法為將分子量為156.03磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.21克溶于1000ml蒸餾水中；該A液濃度為0.2M；磷酸鹽緩沖液a的制備方法為取A液720ml，B液280ml混合即成；磷酸鹽緩沖液b的制備方法為取A液435ml，B液65ml，蒸餾水500ml混合即成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑，其特征在于該試劑是由敏化羧化膠乳液、羊抗人丙種球蛋白血清組成的液體型雙試劑，敏化羧化膠乳液含有標(biāo)記人丙種球蛋白的羧化膠乳。精子結(jié)合抗體檢測(cè)試劑的制備方法，制備方法包括反應(yīng)步驟、純化步驟和保存步驟。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)可滿足國(guó)內(nèi)各醫(yī)院、計(jì)劃生育部門研究與臨床需要，為診斷男性免疫性不育，以及男性在接受輸精管復(fù)育術(shù)后，能否恢復(fù)生育能力提供重要依據(jù)，具較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，它操作簡(jiǎn)便，快速、敏感、特異。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1790022SQ20051002232
公開(kāi)日2006年6月21日 申請(qǐng)日期2005年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日
發(fā)明者張國(guó)芬, 孟衍建, 馬天根 申請(qǐng)人:孟衍建