專利名稱：免疫原性的乙型肝炎表面抗原在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是口服疫苗，尤其是可食用植物提供的疫苗。本發(fā)明使用基因工程技術(shù)，生產(chǎn)能夠表達(dá)免疫原性多肽的轉(zhuǎn)基因植物，人類或動(dòng)物在食用了全部或部分的植物后，這種包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的免疫原性多肽，足以激發(fā)免疫應(yīng)答。
發(fā)明的背景乙型病毒性肝炎疫苗，是經(jīng)FDA認(rèn)證，能給人應(yīng)用的第一個(gè)“新生代”的重組疫苗。通過(guò)在重組酵母中表達(dá)編碼乙型肝炎表面抗原的基因，來(lái)產(chǎn)生這種形式的免疫原性亞單位；自遺傳工程酵母純化這種蛋白質(zhì)，并用于腸胃外傳輸。在發(fā)達(dá)的國(guó)家中，重組疫苗已經(jīng)取代了早期應(yīng)用的、來(lái)源于感染個(gè)體血漿中的疫苗。已經(jīng)表明，在高危成年群體和新生兒，應(yīng)用血漿來(lái)源的和重組的乙型肝炎表面抗原疫苗，都是相當(dāng)安全和有效的。然而，重組乙型肝炎表面抗原疫苗的價(jià)格，妨礙了它在發(fā)展中國(guó)家的廣泛應(yīng)用。
乙型肝炎病毒(HBV)的外殼含有三種大小的蛋白質(zhì)，它們共有羧基端序列。這些蛋白質(zhì)稱為乙型肝炎表面抗原(HBsAgs)，包括大(L，含一個(gè)前-S2編碼區(qū))、中(M1，含一個(gè)前-S1編碼區(qū))和小(S，僅含S編碼區(qū))三類。在感染者的血中，發(fā)現(xiàn)這三種蛋白質(zhì)都在感染的病毒顆粒(一般稱為丹氏顆粒)上，病毒顆粒為42納米的球形體。乙型肝炎病毒感染者的血樣中也有空的球形顆粒，平均22納米，主要含有S類蛋白質(zhì)。專用編碼S蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，釋放20納米的空顆粒，與從感染的細(xì)胞中釋放的相似。而且，用具有同樣基因形式的類似球形體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有與感染細(xì)胞22納米球形體相同的免疫原性。酵母來(lái)源的物質(zhì)構(gòu)成了當(dāng)前商業(yè)上可以買到的疫苗ENGERIX(SKB)和RECOMBIVAX(Merck)的活性成分。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，將新近合成的L、M或S蛋白質(zhì)插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER)。S-蛋白含226個(gè)氨基酸，它的N末端和C末端被認(rèn)為是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔面，并且有4個(gè)橫跨膜的螺旋。這三種蛋白質(zhì)在S編碼區(qū)的146位置上都有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，這三種蛋白質(zhì)在糖基化作用的程度和可利用的位點(diǎn)上存在不同。不正確的糖基化作用能夠妨礙病毒顆粒的形成，這大概是由于蛋白質(zhì)的折疊不當(dāng)造成的。還有，蛋白質(zhì)中半胱氨酸之間的多個(gè)二硫鍵，據(jù)認(rèn)為對(duì)組裝病毒顆?；蝾w粒的結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)中抗原環(huán)的結(jié)構(gòu)很重要。錯(cuò)誤組裝的顆?？赡苡绊懠?xì)胞的附件，原因是錯(cuò)誤的折疊妨礙分泌。
乙型肝炎病毒中的前S1和前S2水平，比17-25納米HBsAg顆粒中的水平高，因此，應(yīng)用HBsAg顆粒的免疫，可能不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)在乙型肝炎病毒上表達(dá)的前S序列的高滴度抗體。在人類感染乙型肝炎病毒期間，前S蛋白質(zhì)的水平在復(fù)制活動(dòng)期增加，并且在S蛋白特異性應(yīng)答之前，產(chǎn)生抗-前S抗體和T細(xì)胞。一旦抗-HBsAg抗體升高，抗-前S抗體就下降。
前S1和前S2在病毒粘附和中和中的作用，引起了含有這些序列還有全部S編碼區(qū)的疫苗的研制。合并前S序列的疫苗包括HEPAGEN(Merck)和BIO-HEP-B(BTG)；這兩種都可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生，在規(guī)劃含S和前S蛋白質(zhì)的完整顆粒中，重要的是，應(yīng)該注意影響HBsAg組裝的S、M和L蛋白質(zhì)的相對(duì)數(shù)量，例如高水平的L蛋白質(zhì)，可減少HBsAg顆粒形成和分泌的數(shù)量。
在復(fù)合體開始進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)期間，發(fā)生S、M和L表面蛋白質(zhì)組裝入顆粒，繼之通過(guò)高爾基(Golgi)復(fù)合體將顆粒運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。納米級(jí)的生物結(jié)構(gòu)，例如病毒外殼，應(yīng)用少量的明確的鍵的接觸，通過(guò)類似折疊的蛋白質(zhì)亞單位的聚合作用組裝。當(dāng)游離亞單位合并入生長(zhǎng)的聚合體時(shí)，驅(qū)動(dòng)聚合作用的力，是形成滿意的鍵間相互作用。對(duì)于諸如HBsAg這樣的外殼蛋白質(zhì)，聚合作用的過(guò)程中所必須的步驟是，多肽適當(dāng)?shù)恼先雰?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，隨后在蛋白質(zhì)亞單位之間建立連接。內(nèi)膜體系中蛋白質(zhì)的正常運(yùn)輸和儲(chǔ)存，可能有助于這個(gè)過(guò)程。
Murray的U.S Patent No.4,710,463提出了一個(gè)生產(chǎn)乙型肝炎核心或表面抗原多肽的方法，使用的是一個(gè)單細(xì)胞的宿主。Szu等的U.SPatent No.5,738,855則提出了一個(gè)改良的寡聚糖免疫原，與傷寒桿菌中的Vi抗原相似，能夠被結(jié)合到一個(gè)載體上，例如乙型肝炎表面抗原。在U.S Patent No.4,847,080,EU 0154902 B1和Neurath等的后來(lái)的論文中，不僅識(shí)別了在一種疫苗中所含的肽，還識(shí)別了供肝細(xì)胞結(jié)合和中和的前S1和前S2區(qū)上的肽表位。
病原體感染的哺乳動(dòng)物，當(dāng)戰(zhàn)勝入侵的微生物時(shí)，通過(guò)啟動(dòng)免疫系統(tǒng)的三個(gè)分支中的至少一個(gè)，即粘膜免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫，而發(fā)動(dòng)免疫應(yīng)答。在呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道和分泌腺體的粘膜表面充滿著分泌物，在這些分泌物中有分泌性IgA抗體的產(chǎn)生，它是引起粘膜免疫的主要原因。這些粘膜抗體的作用，是使病原體克隆局限在粘膜表面，這樣以來(lái)就建立了抵抗病原體入侵的第一道防線。分泌腺體或分泌組織的局部免疫作用、或者提呈到腸管相關(guān)的淋巴結(jié)組織(GALT；Peyer′s Patches)或支氣管相關(guān)的淋巴組織(BALT)的抗原，可以啟動(dòng)粘膜抗體的產(chǎn)生。
口服提呈抗原能夠獲得粘膜的免疫作用。專門的上皮細(xì)胞(M細(xì)胞)，覆蓋在沿著腸道的有組織的粘膜淋巴組織中，通過(guò)細(xì)胞吞噬感染的細(xì)菌、病毒和大分子，來(lái)選擇抗原。這些抗原被傳遞到下面的濾泡中，在那里啟動(dòng)免疫應(yīng)答，并且將細(xì)胞分散到粘膜和全身的免疫部位。上皮細(xì)胞也是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)完整部件，包括那些在B細(xì)胞分化中起重要作用的細(xì)胞因子。
口服免疫法也能誘導(dǎo)強(qiáng)大的體液免疫應(yīng)答。體液免疫是血清中產(chǎn)生循環(huán)的抗體的結(jié)果(尤其是IgG和IgM)，從而加速對(duì)入侵病原體的吞噬作用、中和病毒或激發(fā)針對(duì)病原體的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。在乙型肝炎病毒的保護(hù)，與充足的全身性抗體及T細(xì)胞對(duì)HBsAg蛋白的免疫應(yīng)答之間，存在著一種很好的關(guān)系，并且口服免疫法很可能得到這種保護(hù)。
與當(dāng)前可利用的提供全身免疫力的多種多樣的注射疫苗相對(duì)比，刺激粘膜免疫力的非全身性應(yīng)用的疫苗很少見。然而，目前作為首選的疫苗服用途徑的口服服用，對(duì)發(fā)展研制疫苗的新對(duì)策，產(chǎn)生極大的興趣。在設(shè)計(jì)一種成功的口服疫苗時(shí)，應(yīng)該特別注意兩個(gè)方面一個(gè)合適的佐劑的應(yīng)用和一個(gè)合適的抗原傳遞系統(tǒng)的開發(fā)。
當(dāng)研究用于大量口服佐劑的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)抗原時(shí)，它們不能引起粘膜抗體應(yīng)答，而是誘導(dǎo)了一個(gè)無(wú)應(yīng)答或口服耐受狀態(tài)。而霍亂毒素(CT)和埃希氏大腸桿菌熱易變性毒素(LT)除外。食用CT或LT不誘導(dǎo)對(duì)抗體應(yīng)答的耐受，并且另外能夠防止對(duì)不相關(guān)抗原誘導(dǎo)的口服耐受，這些不相關(guān)抗原指的是與CT或LT一道服用的抗原(Elson，C.等，Immunol.1332892-2887(1984))。這些結(jié)果表明，CT/LT支配的全部結(jié)果，是支持免疫應(yīng)答而不是免疫耐受。在其它的研究中也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于以前所食用的不含CT的抗原，CT并不增加對(duì)它的免疫應(yīng)答(Xu-Amano，J.Exp.Med 1781309-1320(1993))。這具有特殊的重要意義，原因是它表明了在CT存在的情況下，不會(huì)產(chǎn)生對(duì)正常食用抗原的免疫應(yīng)答。一般來(lái)講，在口服抗原后，誘導(dǎo)對(duì)抗免疫作用的免疫耐受，可采取兩種不同的方法誘導(dǎo)口服耐受，單獨(dú)使用可溶性或水溶性抗原；然而按照接種疫苗的規(guī)程，抗原通常是和粘膜佐劑一起服用的。
最近，基因工程上的進(jìn)展，已經(jīng)給表達(dá)免疫原性蛋白質(zhì)相對(duì)低成本的轉(zhuǎn)化植物的選擇，提供了有用的工具。單子葉植物和雙子葉植物，都可以穩(wěn)定地被轉(zhuǎn)化。例如，應(yīng)用編碼S蛋白質(zhì)的基因已經(jīng)可以轉(zhuǎn)化煙草，一種雙子葉植物，并且能夠分裂細(xì)胞釋放球形體(或病毒樣顆粒；VLPs)(Mason等PNAS USA，8911745-11749(1992))。當(dāng)將顆粒注射入小鼠體內(nèi)時(shí)，它實(shí)質(zhì)上模仿了商業(yè)疫苗的免疫原特性(Thanavala等，PNAS USA，923358-3361(1995))。這就表明，在植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，蛋白質(zhì)合成和組裝的過(guò)程可能是相似的。遺憾的足，轉(zhuǎn)基因植物中蛋白質(zhì)的合成率低，已經(jīng)阻礙了體內(nèi)形成VLPs的詳細(xì)研究。
Curtiss，III的U.S Patent No.5,679,880提出了一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物，它表達(dá)有一種病原微生物的抗原或抗原決定簇，在動(dòng)物體內(nèi)，可以激發(fā)分泌性免疫應(yīng)答。Lam等的U.S Patent No.5,484,719和5,612,487公開了從轉(zhuǎn)化了表達(dá)HBsAg的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中，可以獲得抗原性顆粒。目前，由于率-限制因子不知道，所以采用新方法合成的HBsAg蛋白，聚合入植物細(xì)胞的抗原性結(jié)構(gòu)，還沒(méi)有方法來(lái)預(yù)測(cè)其功效。另外，以前的研究顯示的轉(zhuǎn)基因植物中(抗原性)顆粒的構(gòu)成，可能涉及到新法合成的蛋白，非特異性地插入各種的細(xì)胞膜中，這就解釋了，在現(xiàn)有資料中描述的、轉(zhuǎn)基因植物的顆粒積聚的低水平的原因。
人們渴望研制一種廉價(jià)的、安全的和高效的口服疫苗，來(lái)激發(fā)全身性的、最好是粘膜的免疫活動(dòng)，以預(yù)防乙型肝炎病毒的感染。而這種疫苗應(yīng)該是基于一種乙型肝炎病毒，或它的主要的抗原決定簇的。一種能增加HBsAg病毒樣顆粒的方法，是可以運(yùn)用融合蛋白，來(lái)改變新合成的蛋白亞單位的細(xì)胞靶位。例如，融合蛋白可以有一個(gè)N-末端引導(dǎo)肽，以進(jìn)入內(nèi)膜系統(tǒng)或者C-末端KDEL(SEQ ID NO22)，它還可以調(diào)節(jié)微粒體的保留序列。在發(fā)展中國(guó)家，一種特別滿意的運(yùn)用方法，是開發(fā)轉(zhuǎn)基因植物的可食用部分，當(dāng)食用時(shí)，就會(huì)始終如一地建立起針對(duì)HBV的口服免疫。
本發(fā)明的概述本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供植物的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有至少兩個(gè)表達(dá)盒，可功能性的降低多聚核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，為包括HBsAg在內(nèi)的免疫原性多肽的表達(dá)，提供新的植物表達(dá)載體。在可食用的植物組織中，該植物表達(dá)載體，能夠用于產(chǎn)生包括HBsAg在內(nèi)的免疫原性多肽。本發(fā)明更深一層的目的是，當(dāng)食用植物組織時(shí)，在可食用的植物組織中，提供的這種的免疫原性多肽，可激發(fā)人和動(dòng)物的免疫應(yīng)答。本發(fā)明中的這些和其它的目的，通過(guò)下面所描述的一個(gè)或者多個(gè)實(shí)施例表現(xiàn)出來(lái)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種植物表達(dá)載體，它包含有兩個(gè)表達(dá)盒。第一個(gè)表達(dá)盒包含有一個(gè)編碼一個(gè)抗原的多聚核苷酸；以及第二個(gè)表達(dá)盒包含有一個(gè)多聚核苷酸，編碼與第一個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸相同的抗原。第二個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸，與第一個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸是不相同的。第一個(gè)表達(dá)盒中，任意包含有一個(gè)編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)編碼HBsAg不相同的多聚核苷酸。隨意地是，第一個(gè)表達(dá)盒中包含的多聚核苷酸，編碼了一個(gè)植物優(yōu)選化的HBsAg多肽，更可取的是，該多聚核苷酸包含有至少一個(gè)植物優(yōu)選化的密碼子；其中第二個(gè)表達(dá)盒中的多聚核苷酸，編碼了一個(gè)天然病毒源性的HBsAg多肽。甚至更為可取的是，第一個(gè)表達(dá)盒中的多聚核苷酸包含有SEOID NO3，并且第二個(gè)表達(dá)盒中的多聚核苷酸包含有SEQ ID NO1。
更可取的是，基因抑制，包括由RNA-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因抑制，在兩種多聚核苷酸在一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其中的基因抑制被降低或消除。隨意地是，植物表達(dá)載體可能有一個(gè)第一種表達(dá)盒的多聚核苷酸以及一種第二個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸，其中以上所提及的多聚核苷酸，均包含有不多于90個(gè)或者不多于60個(gè)毗鄰的相同的核苷酸。
植物表達(dá)載體可進(jìn)一步包包括第一個(gè)表達(dá)盒進(jìn)一步包含有一個(gè)5′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，并且第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)不完全一樣的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。植物表達(dá)載體還可能包含第一個(gè)表達(dá)盒進(jìn)一步包含有一個(gè)3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)，并且第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)不完全一樣的3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。另外，植物表達(dá)載體可能包含第一個(gè)表達(dá)盒中，進(jìn)一步包含有一個(gè)5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)和一個(gè)3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。第二個(gè)表達(dá)盒中，可包含有一個(gè)與第一個(gè)表達(dá)盒不相同的、5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)和一個(gè)不相同的3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。第一個(gè)表達(dá)盒中，可能包含有一個(gè)TEV的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)和一個(gè)vspB的3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)，并且第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)TMV的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)和一個(gè)pin2的3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。此外，植物表達(dá)載體可能包含第一個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)植物優(yōu)選化的HBsAg多肽，并且第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)天然的病毒源性的HBsAg多肽。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，一埃希氏大腸桿菌細(xì)胞，應(yīng)用上述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，一土壤桿菌細(xì)胞，應(yīng)用上述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，一種植物細(xì)胞，應(yīng)用上述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。更可取的是，植物細(xì)胞是從一組包括西紅柿、馬鈴薯、香蕉和胡蘿卜細(xì)胞中選擇出來(lái)的。甚至更為可取的是，植物表達(dá)載體被整合入植物細(xì)胞的細(xì)胞核基因組中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種植物種子，它包含有上述的植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了包含有一個(gè)核酸序列的一個(gè)多聚核苷酸，該核酸序列編碼一個(gè)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。該多聚核苷酸可操縱性地連接了一個(gè)植物功能性的啟動(dòng)子；一個(gè)翻譯增強(qiáng)序列；和一個(gè)終止序列。多聚核苷酸缺乏一個(gè)在翻譯增強(qiáng)序列和HBsAg編碼序列之間的非轉(zhuǎn)錄區(qū)。編碼HBsAg的核酸序列，可能包含有至少一個(gè)已改變了的密碼子，其中已改變的密碼子是一個(gè)植物優(yōu)選化的密碼子。植物-功能性的啟動(dòng)子，可能是從一組包括菜花花葉病毒(CaMV)35S、西紅柿E8、泛化蛋白、甘露糖松(mannopine)合成酶、patatin、和顆粒-限制性淀粉合成酶(GBSS)的啟動(dòng)子中選擇出來(lái)的。該啟動(dòng)子可能包括一個(gè)雙啟動(dòng)子區(qū)。翻譯增強(qiáng)序列，可能是從一組包括煙草蝕刻病毒(TEV)和煙草花葉病毒(TMV)的Ω翻譯啟動(dòng)子中選擇出來(lái)的。終止序列，可能是從一組包括胭脂堿合成酶(nos)、植物的貯藏蛋白(vsp)，或者一種蛋白酶抑制劑-2(pin2)的終止序列中選擇出來(lái)的。
此外，多聚核苷酸可能缺乏一個(gè)在HBsAg編碼序列和終止序列之間的非轉(zhuǎn)錄區(qū)。該多聚核苷酸可進(jìn)一步包含有一個(gè)編碼微粒體保留信號(hào)的核酸序列，被可操縱性地連接到HBsAg編碼序列的3′末端。
微粒體保留信號(hào)，可以是絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(SEQ ID NO4)。該多聚核苷酸，可能缺乏一個(gè)在微粒體保留信號(hào)和終止序列之間的非翻譯區(qū)。多聚核苷酸，可進(jìn)一步包含有一個(gè)編碼信號(hào)肽的核酸序列，被可操縱性地連接到HBsAg編碼序列的5′末端。而信號(hào)肽可能是從一組包括植物貯藏蛋白(VSP)αS信號(hào)肽，和VSPαL信號(hào)肽中選擇出來(lái)的。
另外，該多聚核苷酸可包含有一HBsAg編碼序列，后者進(jìn)一步包含有一個(gè)前-S區(qū)。隨意地是，該多聚核苷酸，可包含有一個(gè)HBsAg編碼序列，后者包含有一個(gè)核酸序列，可在植物中最佳的表達(dá)，見SEQID NO3。該多聚核苷酸，可能是從一組包括HB104、HB105、HB106、HB107、HB111、HB114、HB115、HB116、HB117、HB118、HB119、HB120、HB121、HB122、HB123、HB131、HB140.3HB145和HB165中的多聚核苷酸中選擇出來(lái)的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種表達(dá)載體，包含有上述多聚核苷酸。該表達(dá)載體可能包含有一種可選擇的標(biāo)記物、一種埃希氏大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)，和/或一種土壤桿菌的復(fù)制起點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，一種埃希氏大腸桿菌細(xì)胞，應(yīng)用上述的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。病毒樣顆?？赡苁窃诩?xì)胞內(nèi)被裝配的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，一種土壤桿菌細(xì)胞，應(yīng)用上述的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。病毒樣顆?？赡苁窃诩?xì)胞內(nèi)被裝配的。該土壤桿菌細(xì)胞進(jìn)一步包含有一個(gè)輔助性Ti質(zhì)粒。
另外，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種包含有上述多聚核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。病毒樣顆?？稍诩?xì)胞內(nèi)被裝配的。該植物細(xì)胞是從一組包括西紅柿、馬鈴薯、香蕉和胡蘿卜細(xì)胞中選擇出來(lái)的。而植物表達(dá)載體，可被整合入植物細(xì)胞的細(xì)胞核基因組中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，一種植物種子，它包含有上述的植物表達(dá)載體。
另外，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種包含一些上述的植物細(xì)胞的免疫原性成分。植物細(xì)胞可呈現(xiàn)在植物組織中，是從一組包括果實(shí)、葉片、塊莖、植物器官、種子原生質(zhì)體和愈傷組織中選擇出來(lái)的。該免疫原性成分，可包括植物細(xì)胞的汁液或者提取物。而免疫原性成分，還可包含有一種佐劑。該佐劑可作為一種帶有一免疫原性成分抗原的融合蛋白被表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種在哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答的方法。此方法包括給哺乳動(dòng)物、服用上述的免疫原性成分的步驟，該免疫應(yīng)答是被激發(fā)的。該免疫原性成分可以是口服服用的。所服用的，可包括食用轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞。而多肽的服用方式，是從一組包括肌肉內(nèi)、口服、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、鼻腔內(nèi)的服用方式中選擇出來(lái)的。更可取的是，可以服用一種佐劑。該佐劑是從一組包括霍亂毒素(CT)、埃希氏大腸桿菌熱易變性毒素(LT)、抗獨(dú)特型抗體2F10、移生因子、志賀氏菌樣毒素和intimin中選擇出來(lái)的。而免疫應(yīng)答的激發(fā)，可以從一組包括體液的、粘膜的、細(xì)胞的、體液和粘膜的、體液和細(xì)胞的、粘膜和細(xì)胞的、以及體液粘膜細(xì)胞的針對(duì)免疫原性成分的免疫應(yīng)答中選擇出來(lái)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種分離一重組、在植物原料中表達(dá)的HBsAg多肽的方法。該方法包括，把植物原料放入一種濃度高于0.1％并小于0.5％的清潔劑中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。當(dāng)作為一種食物，食用4次或更少次時(shí)，，可在哺乳動(dòng)物中激發(fā)一免疫應(yīng)答，所含有的抗HBsAg血清抗體的量，應(yīng)高于50毫國(guó)際單位/毫升。該免疫應(yīng)答是初次免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，可以包括上述的一些植物細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是，提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或者植物細(xì)胞，當(dāng)作為一種食物，食用4次或更少次時(shí)，可在哺乳動(dòng)物中激發(fā)一抗-HBsAg的免疫應(yīng)答，血清抗HBsAg抗體的水平，至少應(yīng)增加4倍，或者應(yīng)達(dá)到高于500毫國(guó)際單位/毫升。該轉(zhuǎn)基因植物或者植物細(xì)胞，可以包括上述的植物細(xì)胞。
正如此處所應(yīng)用的，“抗原”是一個(gè)大分子的物質(zhì)，在人或動(dòng)物中，有能力引發(fā)免疫應(yīng)答。
“抗原決定簇”是抗原的一個(gè)部分，即抗原所含有的能與抗體相結(jié)合的特定部位。
“集群抗原”或者“毒力抗原”是一種致病微生物的抗原，該致病微生物與這種微生物克隆或侵入它的宿主的能力有關(guān)。
“多聚核苷酸”、“核酸”等是編碼多肽的多聚核苷酸。多聚核苷酸或者核酸均可能包含有內(nèi)含子、標(biāo)記基因、信號(hào)序列、調(diào)節(jié)元件，如啟動(dòng)子、啟動(dòng)子和終止序列等等。
第一種多聚核苷酸與第二種多聚核苷酸是“不相同的”，第一種多聚核苷酸中至少有一個(gè)核苷酸和高至包括85％個(gè)核苷酸的完全特性是與第二種多聚核苷酸的不一樣的。
“表達(dá)載體”是一種質(zhì)粒，例如pBR322、pUC或ColE1；或一種病毒如腺病毒、辛德畢斯病毒、猿病毒40，α病毒載體以及巨細(xì)胞病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，例如小鼠肉瘤病毒、鼠乳腺癌病毒、莫洛尼鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒。也可應(yīng)用細(xì)菌性載體，例如沙門氏菌屬、小腸結(jié)腸子爾贊氏菌、志賀氏痢疾桿菌屬、霍亂弧菌、分支桿菌株BCG、李斯特單細(xì)胞基因株。微染色體，例如MC和MCI，抗菌素、病毒顆粒、病毒樣顆粒，裝配型質(zhì)粒(質(zhì)粒)和復(fù)制子也能夠被用作表達(dá)載體。更可取地是，一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒有轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的能力，該真核細(xì)胞包括諸如植物組織的細(xì)胞等。
“食物”和“食用性植物”等是指可以作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源或作為膳食補(bǔ)充，而被動(dòng)物或人類直接攝取的任何植物。一種可食用的植物原料包括一種植物或一些由植物所獲得的原料，它適于被哺乳動(dòng)物(包括人類)或其它動(dòng)物攝取。這一術(shù)語(yǔ)既包括可以直接喂養(yǎng)動(dòng)物的未加工植物，也包括動(dòng)物和人類食用的加工植物。
“免疫應(yīng)答”是宿主對(duì)抗原發(fā)生的反應(yīng)。體液免疫表現(xiàn)為針對(duì)抗原發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生抗體，細(xì)胞免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生T輔助細(xì)胞(CD4+)和細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+)等。粘膜免疫應(yīng)答(或分泌性免疫應(yīng)答)產(chǎn)生分泌性抗體(sIgA)。一個(gè)免疫應(yīng)答可以包括上述一種或多種反應(yīng)。
“免疫原”或者“免疫原性多肽”是指一種抗原或者一種可以誘發(fā)免疫應(yīng)答的抗原?？诜秤谜婧松锉磉_(dá)的抗原，更適于誘發(fā)人類或動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答?！懊庖咴猿煞帧卑幸环N或多種免疫原，并隨機(jī)地與載體、佐劑等聯(lián)合在一起。
“融合蛋白”是這樣一種蛋白質(zhì)，它包含至少2、3、4、5、10或更多相同或不同的氨基酸序列，這些氨基酸序列與多肽相連，并不天然地表達(dá)為某單一的蛋白。融合蛋白可以通過(guò)已知的基因工程技術(shù)獲得。
附圖的簡(jiǎn)單描述

圖1描繪了本發(fā)明中的表達(dá)盒的圖形?？s寫35S＝菜花花葉病毒的35S啟動(dòng)子；GBSS＝顆粒-限制性淀粉合成酶，是塊莖中活性特異性的啟動(dòng)子；TEV＝煙草蝕刻病毒；Ω＝煙草花葉病毒Ω非翻譯引導(dǎo)序列；NOS＝胭脂堿合成酶；VSP＝植物的貯藏蛋白；PIN2＝蛋白酶抑制劑-2；TPSS＝核酮糖1的小亞單位轉(zhuǎn)換信號(hào)肽序列；VSPαS和αL是帶有αL的信號(hào)肽，包括一個(gè)假定的空泡靶信號(hào)。圖1B顯示了一個(gè)帶有限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的pHB131和pHB140.3的圖形。
圖2描繪了一個(gè)限制性pHB103質(zhì)粒圖。圖2B則描繪了限制性pHB104質(zhì)粒圖。圖2C描繪了一個(gè)限制性pHB117質(zhì)粒圖。
圖3描繪了抗-HBsAg抗體應(yīng)答，該免疫應(yīng)答在小鼠，在0、10、20天，通過(guò)經(jīng)口喂食HBsAg轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯(每只鼠5克)加10微克的CT所激發(fā)的，并且在60天腹腔注射了0.5微克的酵母源性的rHBsAg(Merck，Sharpe和Domme)進(jìn)行激發(fā)。對(duì)照組小鼠則接受了對(duì)照的馬鈴薯(每只鼠5克)加同樣的佐劑，并且在60天再結(jié)合激發(fā)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠，在喂食馬鈴薯前禁食過(guò)夜。監(jiān)視每一只小鼠以核實(shí)進(jìn)食的總量。其結(jié)果測(cè)定492∶660納米的光密度值來(lái)表示。
圖4A-E描繪了喂食轉(zhuǎn)基因馬鈴薯片的小鼠的各種免疫方案。用5克重組馬鈴薯加10微克霍亂毒素(CT)喂食Balb/c小鼠，每周3次間隔喂食，得出抗體滴度的峰值為70-110毫國(guó)際單位/毫升，通過(guò)一種單亞免疫原性的腹膜內(nèi)注射(從重組酵母(Merck)中提純的HBsAg)，抗體的滴度可急劇上升至1700-3400毫國(guó)際單位/毫升(其實(shí)際的抗體滴度是與馬鈴薯中HBsAg的表達(dá)水平相關(guān))。免疫應(yīng)答的水平是存在劑量相關(guān)性的，即每克馬鈴薯傳遞1.1微克HBsAg馬鈴薯，比每克馬鈴薯傳遞8.3微克HBsAg的馬鈴薯，免疫應(yīng)答的水平要低并且反應(yīng)較短。在同樣的喂食體系(8.3微克/克)下，發(fā)現(xiàn)通過(guò)一單純的皮下應(yīng)用由重組酵母提純的HBsAg，抗體滴度升高，其峰值為1000毫國(guó)際單位/毫升(圖4C)。喂食煮熟的塊莖(5分鐘，100℃)，則沒(méi)有監(jiān)察到免疫應(yīng)答(圖4D)，但在隨后的單純腹腔注射由重組酵母提純的HBsAg，則觀察到了一顯著的增強(qiáng)(圖4E)。
圖5描繪了一植物優(yōu)選化的前-S(前S1/S2)肽編碼序列和相關(guān)的氨基酸序列。為得到所描繪的序列，檢測(cè)了前-S野生型的編碼序列，并且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)RNA多聚酶II終止序列，還有12個(gè)“CG”潛在性的甲基化作用位點(diǎn)。植物優(yōu)選化序列包括沒(méi)有隱蔽信號(hào)和沒(méi)有CG序列。
圖6顯示的是pHB117質(zhì)粒圖。
圖7顯示的是pHB118質(zhì)粒圖。
圖8顯示的足pHB119質(zhì)粒圖。
圖9顯示的足pHB120質(zhì)粒圖。
圖10顯示的是pHB121質(zhì)粒圖。
圖11顯示的是pHB122質(zhì)粒圖。
圖12顯示的是pHB123質(zhì)粒圖。
圖13所示的表證實(shí)，產(chǎn)生病毒樣顆粒的HB114-16塊莖的蔗糖梯度。
圖14顯示了HB114-6塊莖提取物的western印跡雜交試驗(yàn)。
圖15顯示了HB114-6塊莖和葉片RNA的northern印跡雜交試驗(yàn)。
圖16顯示了經(jīng)PCR擴(kuò)增的HB114-16的基因組DNA的凝膠電泳，它證實(shí)了轉(zhuǎn)基因的出現(xiàn)。
圖17所示的HB114-6的Southern印跡雜交試驗(yàn)，證實(shí)至少4個(gè)HB114的插入物。
圖18所示的圖表證實(shí)了儲(chǔ)存9個(gè)月的HBsAg轉(zhuǎn)基因塊莖的穩(wěn)定性。
圖19所示的western印跡雜交試驗(yàn)，分析了轉(zhuǎn)基因NT1細(xì)胞表達(dá)的3種不同形式的HBsAg。
圖20所示的western印跡雜交試驗(yàn)，分析了轉(zhuǎn)基因NT1細(xì)胞表達(dá)的6種不同形式的HBsAg。
圖21顯示的是本發(fā)明中的合成的HBsAg結(jié)構(gòu)。
圖22顯示的是一野生型的HBsAg核苷酸序列(SEQ ID NO1)，以及一植物優(yōu)選化的HBsAg核苷酸序列(SEQ ID NO3)。
圖23顯示的是一野生型的HBsAg氨基酸序列(SEQ ID NO2)，以及一植物優(yōu)選化的HBsAg氨基酸序列(SEQ ID NO40)。
對(duì)發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的免疫原性多肽本發(fā)明中所包含的細(xì)菌、病毒和寄生蟲抗原，均能激發(fā)動(dòng)物，如小鼠、兔、豚鼠、小雞、鵝、鴨、黑猩猩、短尾猿、狒狒或人的免疫應(yīng)答。更可取地是，免疫應(yīng)答是在哺乳動(dòng)物中被激發(fā)的。
病毒抗原可以來(lái)自諸如正粘病毒，例如流感病毒(例如紅細(xì)胞凝集素和核蛋白抗原)；逆轉(zhuǎn)錄病毒，如RSV和SIV；皰疹病毒，如EBV、CMV，或者單純皰疹病毒(例如胸腺嘧啶核苷酶抗原)；Lenti病毒，如HIV(例如，Nef，p24，gp120，gp41，Tat，Rev，和Pol抗原)；棒狀病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒；痘病毒，如牛痘；輪狀病毒和肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如HBsAg)。
細(xì)菌病毒可以來(lái)自諸如，例如分支桿菌屬、幽門螺旋桿菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏痢疾桿菌屬(例如宋內(nèi)氏志賀氏痢疾桿菌1抗原)、埃希氏大腸桿菌(例如CFA/I絲毛抗原和熱易變毒素)、立克次體屬、李斯特菌屬、嗜肺軍團(tuán)菌、假單胞菌屬、弧菌屬(如O-抗原或者霍亂毒素)、Borellia burgdorferi、百日咳桿菌(例如pertactin和腺苷酸環(huán)化酶-溶血素)和破傷風(fēng)桿菌(例如破傷風(fēng)毒素)。
寄生蟲抗原可以來(lái)自，諸如瘧原蟲屬(例如環(huán)孢子體抗原，裂殖子表面抗原)、錐體蟲屬、梨形鞭毛蟲屬、方頭蜱屬、巴貝西蟲屬、內(nèi)阿米巴屬(例如半乳糖特異性凝集素)、艾美蟲屬、利什曼蟲屬(例如gp63)、血吸蟲屬(例如丙糖-磷酸鹽異構(gòu)酶)、布魯格氏絲蟲屬(例如副肌球蛋白)、片吸蟲屬、Dirofilaria屬、吳策屬和盤尾絲蟲屬。
本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施例是一種包含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的免疫原性多肽。HBsAg的核酸序列見SEQ ID NO1(圖22)，HBsAg的氨基酸序列見SEQ ID NO2(圖23)。HBsAg的抗原決定簇包含在三個(gè)HBV編碼的被膜多肽中，并有各自的糖基化形式。兩種最小的多肽(24000和27000道爾頓)，代表了一種有226個(gè)氨基酸的多肽和同一多肽的糖基化形式。這些多肽是通過(guò)HBV的S開放閱讀框的S區(qū)進(jìn)行編碼的。兩種其它的蛋白質(zhì)，代表了一種33000道爾頓、281個(gè)氨基酸的多肽，它包括由HBV的前S2區(qū)編碼的55個(gè)氨基酸和由S區(qū)編碼的226個(gè)氨基酸，以及同一多肽(36000道爾頓)的糖基化形式。兩種其它的蛋白質(zhì)，則代表了一種39000道爾頓(389-400個(gè)氨基酸)的多肽，它包括由HBV的前S1區(qū)編碼的約119個(gè)氨基酸和由前S2和S區(qū)編碼序列，以及同一多肽(36000道爾頓)的一種糖基化形式。在受感染病人的血清中，可發(fā)現(xiàn)所有的這些蛋白均在感染的病毒顆粒(經(jīng)常稱為丹氏顆粒)上，病毒顆粒恢復(fù)成42納米的球形體。血清的樣本中還包含有空的球形顆粒，平均22納米，它主要含有S類蛋白質(zhì)。專用編碼S蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，釋放20納米的空球顆粒，與從感染的細(xì)胞中釋放的相似。而且，用具有同樣基因形式的類似球形體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，與受感染細(xì)胞的22納米球形體，有著相同的免疫原性。
本發(fā)明中的免疫原性多肽至少含有一個(gè)抗原決定簇，可以被抗體所識(shí)別。多肽中的抗原決定簇可以通過(guò)多種方法確定，例如本發(fā)明中的一種多肽，可以采用諸如該多肽的單克隆抗體的免疫親和純化法進(jìn)行分離。然后對(duì)分離的多肽序列進(jìn)行篩查。共同涵蓋整個(gè)多肽序列的一系列短肽，可以通過(guò)蛋白裂解制備。例如，從50-mer多肽片段開始，可以用抗-HBsAg的酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)每一個(gè)片段上的抗原決定簇。逐漸地，可以從已經(jīng)確定的50-mer，檢測(cè)更小的片段和重疊的片段，從而描繪出感興趣的抗原決定簇。
本發(fā)明中的HBsAg多肽，可包含有一個(gè)S多肽，并且進(jìn)一步包含有一個(gè)前-S1多肽。發(fā)明中的多肽還可進(jìn)一步包含有一個(gè)前S2多肽。HBsAg則可能是包含有所有S、前S1和前S2多肽的結(jié)合體。隨意地是，HBsAg多肽可以包含有多于一個(gè)的S、前S1或者前S2多肽。而S、前S1和前S2多肽，可以來(lái)自于相同的或不同種群的HBV。S、前S1和前S2多肽，還可以作為一種融合蛋白或者作為分離多肽加以制備。
在S、前S1和前S2區(qū)的一些抗原決定簇，可有效地連接肝細(xì)胞，并可以被中和。Neurath等的U.S.Pat.No.4,847,080和EU-BI-0154902。前S1序列跨度殘基1-21、12-32、21-47、27-49、32-53、94-117和120-153，已作為免疫原被識(shí)別。(Neurath等，1986)。同樣地，前S2序列跨度殘基120-145，也已作為免疫原被識(shí)別。因此，依照本發(fā)明，作為免疫原性多肽，這些殘基是有用的。其它涉及上述序列的插入、刪除或者替代，也可以顯示出免疫原性，并且這樣采用定點(diǎn)誘變的突變的合成，是在專業(yè)人員的熟練操作下進(jìn)行的。(Maniatis，T(1988)Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory)。一種抗原決定簇與一種攜帶者，如與KLH或者脂質(zhì)體相接合，可能是必需的，但應(yīng)該意識(shí)到它對(duì)免疫原性的影響。上述的抗原決定簇怎樣引發(fā)免疫應(yīng)答，是不十分清楚的，然而，這可能會(huì)涉及到IgA受體、IL-6受體、去唾液酸糖蛋白受體和GAPD。
本發(fā)明的一個(gè)最佳的多肽，含有一個(gè)15個(gè)氨基酸的肽，還是一含有8個(gè)殘基的肽，它與特異性的“一個(gè)”HBsAg決定子簇存在部分的同源。據(jù)報(bào)道，這種有AVYYCTRGYHGSSLY(SEQ ID NO6)序列的肽，有著與特異性的“一個(gè)”決定子簇相似的抗原特性，并且能使B細(xì)胞和T細(xì)胞，對(duì)抗獨(dú)特型抗體2F10和HBsAg的激發(fā)活性加倍(例如，見Thanavala，等的U.S.Pat.No.5744153；5531990；5668253)。此外，這種肽以及它的變異形式，可以成為一種這里論述的免疫原性多肽，和在本發(fā)明中完成的用一種多聚核苷酸來(lái)編碼這樣一種肽。當(dāng)與另一個(gè)HBsAg或者與一本發(fā)明中的免疫原性多肽服用時(shí)，與抗體2F10相似的是，該多肽本身也可以作為一種佐劑使用。
本發(fā)明中的一些多肽，與以前通過(guò)病毒的各種前導(dǎo)信號(hào)和保留信號(hào)分類蛋白所獲得的多肽，是不一樣的。例如，一種這樣的包含一HBsAg氨基酸序列的多肽，與C-末端的絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸序列(SEQ ID NO4)共軛連接，該序列則把蛋白作為靶蛋白運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在一些實(shí)例中，本發(fā)明中的多肽，還可能與以前利用有不同糖基化模式的病毒而得到的蛋白不同，這可能是由于它們?cè)趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)中的停留時(shí)間或者不同的糖基化酶(可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中出現(xiàn))造成的結(jié)果。此外，所獲得的免疫原性多肽，在它們的免疫原性特性上，可能與以前的蛋白質(zhì)相比稍有改變。然而，只要這種免疫原與那些天然的免疫原性多肽有足量的抗原決定簇，不管它們與抗原的足夠多的交叉反應(yīng)，也可以發(fā)動(dòng)一次免疫應(yīng)答。
可取地是，本發(fā)明中的HBsAg多肽有形成病毒樣顆粒(VLPs)的能力。甚至更為可取地是，本發(fā)明中的HBsAg多肽，當(dāng)被一種植物細(xì)胞合成時(shí)，就有能力形成VLPs。本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施例是，HBsAg多肽通過(guò)二硫鍵，有形成交聯(lián)單體的能力。高度交聯(lián)的HBsAg，可以更加穩(wěn)固和更有免疫原性。見例12。
由肝炎的各種致病菌株和分離物以及其它的病原體所提供的、在本發(fā)明中所出現(xiàn)的抗原，以及所有這些菌株和分離物的多肽，均可用于本發(fā)明。本發(fā)明中的免疫原性多肽，例如HBsAg，既可以是全長(zhǎng)的多肽、多肽的片段，也可以是多肽截去的片段。例如，免疫原性多肽的片段，可以包括免疫原性多肽至少6、10、25、50、75、100、150、200、250、300或者350、400、500、750、1000或者1500個(gè)或者更多的氨基酸。本發(fā)明進(jìn)一步包含一種或者多種突變，如在一種免疫原性多肽中的氨基酸的替換、添加、刪除、切除或者是重組。
本發(fā)明中的免疫原性多肽，可以應(yīng)用另一種切除過(guò)的免疫原性多肽、另一個(gè)免疫原性多肽的片段、或者一免疫原性多肽的全長(zhǎng)，進(jìn)行重組和合成。例如，一種免疫原性多肽的片段，可以包括免疫原性多肽至少6、10、25、50、75、100、200、300、400、500、1000個(gè)氨基酸。兩種免疫原性多肽可以來(lái)自同一種或不同種的菌株。另外，本發(fā)明中的一種或更多種(例如2、3、4、5、10、25、或50)的免疫原性多肽，來(lái)自同一種或不同種的菌株，均可以被重組。
更為可取地是，本發(fā)明中的多肽可以通過(guò)重組來(lái)制取。利用這一領(lǐng)域中很普遍的技術(shù)，我們能夠?qū)⒁粋€(gè)編碼多肽的多聚核苷酸，導(dǎo)入一個(gè)能在一定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的表達(dá)載體中。有多種的細(xì)菌的、酵母的、植物的、哺乳動(dòng)物的和昆蟲的表達(dá)系統(tǒng)，都是可以應(yīng)用在這一技術(shù)和任意這樣可用的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明中的多肽，可以應(yīng)用這一領(lǐng)域中最常用的方法，如免疫親合純化法，從真核細(xì)胞如植物細(xì)胞中分離、純化出來(lái)。隨意地是，編碼本發(fā)明中多肽的多聚核苷酸，能在細(xì)胞外翻譯體系中進(jìn)行翻譯。
如果需要，本發(fā)明中的多肽，可以被制成一個(gè)融合蛋白，即也能包含其它的氨基酸序列，如氨基酸銜接物或者信號(hào)序列，還有在蛋白質(zhì)純化中很有用的配體，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)記物和葡萄球菌A蛋白。隨意地是，一個(gè)或多個(gè)抗原，如HBsAg、移生性抗原、病毒性抗原，以及它們的抗原決定簇，和其它能夠引起人或動(dòng)物的分泌性免疫反應(yīng)的成分，都可能在一個(gè)融合蛋白中呈現(xiàn)出來(lái)。在一個(gè)融合蛋白中，可呈現(xiàn)不止一個(gè)的免疫原性多肽，如HBsAg多肽。若有必要的話，在一個(gè)融合蛋白中，可以包含有來(lái)自不同肝細(xì)胞株或分離株的、HBsAg多肽的重組體。多聚核苷酸編碼免疫原性多肽本發(fā)明中的多聚核苷酸，包含小于一個(gè)整細(xì)菌、病毒或者是原生動(dòng)物的基因組，而且可以是單鏈DNA或雙鏈DNA。更可取地是，多聚核苷酸可以從其它成分，如蛋白質(zhì)中純化出來(lái)。多聚核苷酸編碼上述的免疫原性多肽。本發(fā)明中的多聚核苷酸，可以從如培養(yǎng)的細(xì)菌、病毒或原生動(dòng)物的核酸序列的基因組文庫(kù)中分離出來(lái)?？扇〉厥?，該多聚核苷酸，還可以從如血漿、血清或者有HBV感染的個(gè)體肝臟或用HBV感染的培養(yǎng)細(xì)胞的、核酸序列的基因組文庫(kù)中分離出來(lái)。例如PCR的擴(kuò)增方法，可以用編碼免疫原性多肽的細(xì)菌、病毒或原生動(dòng)物的基因組RNA或cDNA，來(lái)擴(kuò)增多聚核苷酸。多聚核苷酸也可以在實(shí)驗(yàn)室中合成，比如使用自動(dòng)合成儀。如果需要的話，該多聚核苷酸抗原被克隆入一種表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化入如細(xì)菌的、酵母的、昆蟲的、植物的或者哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，以致于在這些細(xì)胞中，可以表達(dá)本發(fā)明中的多肽，并從細(xì)胞培養(yǎng)中分離出來(lái)。
該多聚核苷酸，可以包括編碼能自然生成的免疫原性多肽的序列，或可以編碼已變的免疫原性多肽，而后者是不會(huì)在自然狀態(tài)下產(chǎn)生的。利用傳統(tǒng)技術(shù)的定點(diǎn)誘變，可以造成LT或CT多聚核苷酸的一個(gè)或多個(gè)突變。一個(gè)包括單突變、雙突變或更多突變位點(diǎn)的突變多聚核苷酸文庫(kù)，也能用隨機(jī)誘變的技術(shù)得到。誘變技術(shù)通常描述在Curent Protocol in Molecular Biology，Ausubel等eds.，John Wiley(1998)中，隨機(jī)誘變(也指“DNA移動(dòng)”)是Stemmer等的美國(guó)專利Nos.5,605,793，5,811,238，5,830,721，5,834,252和5,837,458的主題。一個(gè)包含有免疫原性多肽的突變的多聚核苷酸，也能夠在實(shí)驗(yàn)室中合成。
更為可取地是，本發(fā)明中的免疫原性的多聚核苷酸，可以被設(shè)計(jì)成為能應(yīng)用植物優(yōu)選化的密碼子，系統(tǒng)地替換掉細(xì)菌的密碼子。例如，HBsAg的編碼序列，或其一部分的密碼子，能應(yīng)用它的使用率加以分析。然后，可以拿它與特定植物中的“富產(chǎn)”蛋白的密碼子使用的頻率相比較。例如見WO96/12801。在植物中使用頻率低或根本不被使用的密碼子，可以通過(guò)諸如定點(diǎn)誘變或?qū)嶒?yàn)室合成的技術(shù)來(lái)修飾。密碼子的修飾是與在植物中大量表達(dá)的蛋白的基因所采用的密碼子一致的。此外，帶有可能的poly-A信號(hào)序列的密碼子片段，可以被修飾成其他攜帶同一氨基酸信號(hào)的密碼子。進(jìn)一步說(shuō)，隱蔽信號(hào)序列、內(nèi)含子剪接位點(diǎn)和潛在的甲基化位點(diǎn)，也能夠被修飾，見WO96/12801；SEQ ID NO3(圖22)。(顯示了一個(gè)編碼HBsAg的核酸序列，已在植物中優(yōu)選化表達(dá))。對(duì)植物優(yōu)選化密碼子的替換，以使其符合病毒、細(xì)菌或者原生動(dòng)物-優(yōu)選化的密碼子，以增強(qiáng)免疫原性多聚核苷酸的表達(dá)量，并且使其編碼的多肽，在植物的特定部位，例如在果實(shí)或塊莖中的編碼多肽或多肽的表達(dá)更加容易。一種免疫原性多聚核苷酸序列，例如HBsAg，至少有1、2、3、4、5、10、20、50個(gè)或更多的密碼子，修改為植物優(yōu)選化的密碼子，被稱為植物最優(yōu)選化?？扇〉厥?，植物優(yōu)選化，進(jìn)一步包括修改編碼可能的信號(hào)序列的密碼子，內(nèi)含子剪接位點(diǎn)和甲基化位點(diǎn)。
更可取地是，編碼一種免疫原性多肽的本發(fā)明中的多聚核苷酸，例如HBsAg，可操縱性地與一個(gè)植物功能性的啟動(dòng)子相連接。如同此處所用的，“可操縱性地連接”是指免疫原性多肽的編碼序列，被融合如一啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄或者翻譯啟動(dòng)子、終止序列等等的結(jié)構(gòu)中，以致于各自的編碼序列均被精確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，各自的核苷酸序列不需要被連續(xù)地融合(如共價(jià)結(jié)合)成相鄰接的確定的序列，但是可以通過(guò)合成銜接頭或銜接物，以促進(jìn)該結(jié)構(gòu)和表達(dá)載體的裝配。
一種啟動(dòng)子可以是一種結(jié)構(gòu)型的啟動(dòng)子，由此，在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可出現(xiàn)一種免疫原性多肽的持續(xù)性表達(dá)。另外，啟動(dòng)子可以被誘導(dǎo)，由一種化學(xué)誘導(dǎo)劑或一種組織特異性物質(zhì)激活啟動(dòng)子，例如在植物達(dá)到一個(gè)所希望的分化階段?？烧T導(dǎo)的啟動(dòng)子，包括一些有能力增加多聚核苷酸的產(chǎn)量的啟動(dòng)子，是通過(guò)將所提供的多聚核苷酸暴露給一種誘導(dǎo)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？烧T導(dǎo)的啟動(dòng)子還包括，但不只限于一種熱休克啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素系統(tǒng)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)的、類固醇誘導(dǎo)的、磷酸鹽缺乏誘導(dǎo)的以及一些化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，包括但不只限于四環(huán)素、乙烯、銅、水楊酸、苯基-1，2，3-硫化二唑。見U.S Pat.No.5,942,662，5,977,441，5,684,239和5,922,564。
一種植物優(yōu)選的啟動(dòng)子是CaMV35S，它包含一個(gè)雙啟動(dòng)子區(qū)。這種啟動(dòng)子是一種結(jié)構(gòu)型啟動(dòng)子，在植物的葉片和塊莖中可有效引起表達(dá)。其它的植物優(yōu)選化的啟動(dòng)子，包括patatin、mas、西紅柿E8(Giovanni等Plant Cell，153-63(1989))、泛素(Quail等，U.SPat.No.5,510,474)、甘露糖合酶(Ellis等，Mol.Gen.Genet.195466-473(1984))，胭脂堿合酶(Ebert等，PNAS，845745-5749(1987))、玄參花葉病毒(FMV)(Rogers等，U.S Pat.No.5,378,619)、蔗糖合酶(Yang等，PNAS，874144-4148(1990))、肌動(dòng)蛋白(Wang，等Mol.Cell.Biol.，123399-3406(1992))，異檸檬酸裂解酶(Harada，等U.SPat.No.5689040)和顆粒限制性淀粉合酶(GBSS)啟動(dòng)子。更可取的是，啟動(dòng)子包含有一雙(或者兩個(gè))啟動(dòng)子。見Artzen，U.SPat.No.5,914,123；Lam，U.S Pat.No.5,612,487；和Maiti，U.SPat.No.5,994,521。
一些可效仿植物功能的啟動(dòng)子，能夠用于表達(dá)一種本發(fā)明中的結(jié)構(gòu)基因，如下U.S Pat.No.5,352,605和U.S Pat.No.5,530,196-CaMV35S和19S啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,436,393-patatin啟動(dòng)子；U.SPat.No.5,436，393-B33來(lái)源于馬鈴薯的一個(gè)patatin基因的啟動(dòng)子序列，并且引起塊莖特異性表達(dá)序列，融合到B33啟動(dòng)子；WO94/24298-西紅柿E8啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,556,653-西紅柿果實(shí)啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,614,399和U.S Pat.No.5,510,474-植物泛素啟動(dòng)子系統(tǒng)；U.S Pat.No.5,824,865脫落酸應(yīng)答基因表達(dá)的-5′順式調(diào)節(jié)因子；U.SPat.No.5,824,857-badnavirus、水稻tungro桿狀病毒(RTBV)；U.SPat.No.5,789,214-化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子片段，來(lái)自煙草PR-la基因編碼區(qū)附近的5′側(cè)區(qū)；U.S Pat.No.5,783,394-覆盆子drul啟動(dòng)子；WO 98/31812草莓啟動(dòng)子和基因；U.S Pat.No.5,773,697-napin啟動(dòng)子、phaseolin啟動(dòng)子和DC3啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,723,765-LEA啟動(dòng)子；U.SPat.No.5,723,757-5′轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下沉器官特異性表達(dá)的區(qū)域；U.SPat.No.5,723,751-與共同基序序列，尤其是作為順式因素啟動(dòng)子的Iwt和PA基序相關(guān)的G-盒，它調(diào)節(jié)異質(zhì)性基因，在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)；U.S Pat.No.5,633,440-P119啟動(dòng)子及其應(yīng)用；U.S Pat.No.5,608,144-2組(Gp2)植物啟動(dòng)子序列；U.S Pat.No.5,608,143-來(lái)自玉米、矮牽?；ê蜔煵輲追N基因衍生來(lái)的核酸啟動(dòng)子片段；U.S Pat.No.5,391,725-豌豆植物，pisum sativum中來(lái)自葉綠體GS2谷氨酰胺合成酶核酸基因的，和來(lái)自細(xì)胞質(zhì)GS3谷氨酰胺合成酶兩個(gè)核酸基因的啟動(dòng)子序列；U.SPat.No.5,378,619-來(lái)自flagwort花葉病毒(FMV)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；U.SPat.No.5,689,040-異檸檬酸裂解酶啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,633,438-小苞子特異性調(diào)節(jié)因素；U.S Pat.No.5,595,896-異質(zhì)性基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，和應(yīng)用植物天門冬酰胺合成酶啟動(dòng)子的植物細(xì)胞；U.SPat.No.4,771,002-驅(qū)動(dòng)一個(gè)1450堿基TR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在章魚肉堿型花冠菌癭腫瘤中表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)域；U.S Pat.No.4,962,028-來(lái)自1，5二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位基因的啟動(dòng)子序列；U.S Pat.No.5,491,288-阿布屬組蛋白H4啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,767,363-種子特異性植物啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,023,179-21bp啟動(dòng)子因素，它能將其在根部表達(dá)的能力賦予一個(gè)通常只在綠色組織中發(fā)揮作用的rbcS-3A啟動(dòng)子；U.SPat.No.5,792,925-與植物尤其是根中有關(guān)的DNA序列組織優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,689,053-Brassica sp.多聚半乳糖醛酸酶啟動(dòng)子；U.S Pat.No.5,824,863-種子皮特異的隱藏的啟動(dòng)子區(qū)域；U.SPat.No.5,689,044-自煙草PR-la基因分離的化學(xué)合成的核酸啟動(dòng)子片段，它可以應(yīng)用苯基-1，2，3-硫化二唑，異煙酸復(fù)合物或水楊酸復(fù)合物誘導(dǎo)合成；U.S Pat.No.5,654,414-自黃瓜殼多糖酶/溶菌酶基因分離的啟動(dòng)子片段，它可以通過(guò)應(yīng)用苯基-1，2，3-硫化二唑誘導(dǎo)合成；U.SPat.No.5,824,872-來(lái)自煙草的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子，它至少在卵巢、花、未成熟胚胎、成熟胚胎、種子、莖干、葉子和根組織中有直接表達(dá)；U.SPat.No.5,223,419-植物中基因表達(dá)的改變；U.S Pat.No.5,290,924-在單子葉植物中基因表達(dá)的重組啟動(dòng)子；WO95/21248-應(yīng)用TMV過(guò)度生產(chǎn)肽和蛋白質(zhì)的方法；WO 98/05199-含有嫩枝分裂組織特異的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列的核酸；EP-B-0122791-菜豆球蛋白啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因；U.SPat.No.5,097,025-植物啟動(dòng)子(sub domain of CaMV 35S)；WO94/24294-應(yīng)用西紅柿E8-衍生的啟動(dòng)子表達(dá)異質(zhì)性基因，例如成熟水果中的5-腺苷甲硫氨酸水解酶；U.S Pat.No.5,801,027-應(yīng)用反式作用蛋白控制轉(zhuǎn)基因植物中基因表達(dá)的方法；U.S Pat.No.5,821,398-編碼合成的植物啟動(dòng)子和西紅柿Adh2酶的DNA分子；WO 97/47756-合成的植物核心啟動(dòng)子和上游調(diào)節(jié)因子；U.S Pat.No.5,684,239-有雙子葉植物外傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子的單子葉植物；U.S Pat.No.5,110,732-植物中選擇的基因表達(dá)；U.S Pat.No.5,106,739-CaMV 35S增強(qiáng)的mannopine合酶啟動(dòng)子和應(yīng)用合酶的方法；U.S Pat.No.5,420,034-種子特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；U.SPat.No.5,623,067-種子特異性的啟動(dòng)子區(qū)；U.S Pat.No.5,139,954-小麥的DNA啟動(dòng)子片段；WO 95/14098-植物中使用的空想調(diào)節(jié)區(qū)和基因盒；WO 90/13658-基因產(chǎn)量達(dá)高水平；U.S Pat.No.5,670,349-HMG啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)和張貼在植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)中收獲的基因產(chǎn)量；U.SPat.No.5,712,112-在植物中含有α淀粉酶基因啟動(dòng)子區(qū)的基因表達(dá)系統(tǒng)。
一種優(yōu)選的多聚核苷酸應(yīng)包括，一個(gè)煙草花葉病毒(TMV)的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(UTR)(Ω)(Gallie等Nucleic Acids Res 204631-4638(1992))，或者一個(gè)煙草蝕刻病毒(TEV)的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(Carrington等，J.Virol.641590-1597(1990))，或者是它們的片段，位于啟動(dòng)子和一種編碼免疫原性多肽的多聚核苷酸序列之間。TMV的5′UTR能促進(jìn)編碼序列的翻譯。多聚核苷酸可進(jìn)一步包含有一個(gè)TMV的3′UTR或者是它的片段，也能夠促進(jìn)翻譯的進(jìn)行。Zeyenko等FEBSLett.354271-273(1994)；Leathers等Mol.Cell.Biol.135331-5347(1993)；Gallie等Nucl.Acids Res.204631-4638(1992)。
更可取的是，表達(dá)載體含有一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。本發(fā)明中能夠應(yīng)用的一些啟動(dòng)子如下U.S Pat.No.5,424,200和U.S Pat.No.5,196,525-CaMV35S啟動(dòng)子序列；U.S Pat.No.5,359,142，U.S Pat.No.5,322，938，U.S Pat.No.5,164,316，和U.S Pat.No.5,424,200-銜接復(fù)制的CaMV35S啟動(dòng)子；WO 87/07664-TMV的Ω′區(qū)；WO 98/14604-PAT1基因的內(nèi)含子1和/或內(nèi)含子2；U.S Pat.No.5,593,874-HSP70內(nèi)含子，存在于植物中的空想基因啟動(dòng)子表達(dá)的未翻譯前導(dǎo)序列；U.SPat.No.5,710,267，U.S Pat.No.5,573,932，和U.S Pat.No.5,837,849-能夠與OCS轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的植物啟動(dòng)子因素；U.S Pat.No.5,290,924-玉米Adhl內(nèi)含子；JP 8256777-翻譯啟動(dòng)子序列。
本發(fā)明中的多聚核苷酸，還可以包括一個(gè)在植物宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄終止序列。典型的終止序列包括，胭脂合酶(nos)(Bevan，Nucleic Acids Res.，128711-8721(1984))、植物儲(chǔ)存蛋白(vsp)(Mason等Plant Cell.5241-251(1993))與抑制性蛋白酶-2(pin2)(An等Plant Cell.1115-122(1989))終止序列。這些序列只能被轉(zhuǎn)錄，而不能被翻譯。
本發(fā)明中的多聚核苷酸，還可以編碼—微粒體保留信號(hào)序列，例如SEKDEL(絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸)(SEQID NO4)，或者KDEL(SEQ ID NO22)，在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，是為了增加表達(dá)性多肽的保留區(qū)。例如HBsAg抗原復(fù)合體的濃聚，可以通過(guò)帶有微粒體保留信號(hào)的新生成的多肽來(lái)獲得，蛋白的這些信號(hào)將被在重復(fù)應(yīng)用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或者其它的細(xì)胞器中。微粒體保留信號(hào)序列能夠可操縱性地連接到免疫原性多肽的3′末端。更為可取的是，該多聚核苷酸缺乏一個(gè)位于微粒體保留信號(hào)和終止序列之間的非轉(zhuǎn)錄區(qū)。該信號(hào)可以與免疫原性多肽相分離，例如，鉸鏈區(qū)。
本發(fā)明中的多聚核苷酸進(jìn)一步可以包含有一個(gè)信號(hào)肽，該信號(hào)肽被可操縱性的連接到免疫原性多肽的5′末端。信號(hào)肽包括，如植物貯藏蛋白(VSP)αS信號(hào)肽或者VSPαL信號(hào)肽。Mason等，Plant Mol.Biol.11845-856(1988)。按照預(yù)先確定的途徑，例如，在細(xì)胞內(nèi)的ER或者假定的貯存囊泡中，信號(hào)肽可用作選擇一種蛋白。因此，在靶位點(diǎn)上，信號(hào)肽可以積累和/或進(jìn)一步加工多肽。通過(guò)鉸鏈區(qū)，信號(hào)肽可以物理性的與一個(gè)免疫原性多肽相分離。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是，本發(fā)明中的多聚核苷酸包含有一種核酸序列，該核酸序列可編碼一種免疫原性多肽，例如HBsAg，可操縱性地與一個(gè)植物功能性的啟動(dòng)子、一個(gè)翻譯增強(qiáng)序列和一個(gè)終止序列相連接。甚至更優(yōu)選的是，本發(fā)明中的多聚核苷酸，在翻譯增強(qiáng)序列和免疫原性多肽編碼序列之間，缺乏一個(gè)非轉(zhuǎn)錄區(qū)。即，一種可轉(zhuǎn)錄翻譯增強(qiáng)序列的RNA聚合酶，不會(huì)停止轉(zhuǎn)錄，只能連續(xù)轉(zhuǎn)錄免疫原性多肽編碼序列。甚至更優(yōu)選的是，該多聚核苷酸，在免疫原性多肽序列和終止序列之間，缺乏一個(gè)非轉(zhuǎn)錄區(qū)。
更優(yōu)選的是，本發(fā)明中的多聚核苷酸包含有一個(gè)天然病毒源性(或者野生型)的HBsAg-編碼核苷酸序列，見SEQ ID NO1。相應(yīng)的HBsAg氨基酸序列見SEQ ID NO2。一個(gè)HBsAg編碼序列可以通過(guò)合成的寡聚體的裝配直接加以合成，或者可以來(lái)自于cDNA文庫(kù)，質(zhì)粒運(yùn)載序列，或其它的載體，如下文將要論述的那些載體。
另外，本發(fā)明中的多聚核苷酸，可以包含有HBsAg編碼序列的合成型式，在一種真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，如一種植物細(xì)胞中，它可以結(jié)合一個(gè)或多個(gè)插入、刪除或者突變，以提高轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄或者翻譯的效率。一個(gè)這樣的編碼HBsAg的S蛋白的合成序列，見SEQ ID NO3(圖22)；其相應(yīng)的氨基酸序列見SEQ ID NO40(圖23)。另一種在植物中被采用的表達(dá)序列，可編碼前S肽，見圖5(SEQ ID NO5)。
與這些HBsAg序列有著高度同源性的核苷酸序列也被考慮了，優(yōu)選的是，被編碼的氨基酸序列保持著相當(dāng)大的或者全部沒(méi)有被改變。尤其是，考慮了至少80％，更好是90％的、與HBsAg多聚核苷酸存在同源的序列。在計(jì)算同源性的百分?jǐn)?shù)中，確定了與多聚核苷酸相同的堿基對(duì)的百分率，并考慮了在核酸序列中的一些插入、刪除或替換。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了編碼HBsAg多肽的抗原決定簇的多聚核苷酸，其中的HBsAg多肽的抗原決定簇主要是可激發(fā)免疫應(yīng)答。因此，在本發(fā)明中，仔細(xì)考慮了HBsAg蛋白的C-末端、N-末端或者其它所有的片段。在本發(fā)明中的多聚核苷酸中，作為一種單一或者重復(fù)序列，這些片段均可以被編碼。片段的長(zhǎng)度，可以至少有12、15、25、50、75、100、200、300、400、500、750、或1000個(gè)核酸。
本發(fā)明中，特別優(yōu)選的多聚核苷酸，包括HB103、HB104、HB105、HB106、HB107、HB111、HB114、HB115、HB116、HB117、HB118、HB119、HB120、HB121、HB122、HB123、HB145、HB165、和HB131、和HB140.3，其中包含有上述結(jié)構(gòu)特征的各種重組體。這些質(zhì)粒的相應(yīng)的表達(dá)盒，見圖1A和1B。最為精選的是HB114，它是用一個(gè)35S啟動(dòng)子和一個(gè)TEV翻譯啟動(dòng)子和一個(gè)蛋白酶抑制劑2(pin2)終止序列構(gòu)筑的。在這種質(zhì)粒中，抗卡那霉素基因是作為一種選擇性標(biāo)記物使用的。其載體來(lái)自根癌土壤桿菌屬的一種二元載體，例如pBIN19(Bevan 1984)或者(pGPTV-KAN)(Becker等Plant Mol.Biol.201195-1197(1992))。該35S啟動(dòng)子是“結(jié)構(gòu)型”啟動(dòng)子，并有一個(gè)雙啟動(dòng)子(Mason等1992)。
更為可取地是，本發(fā)明中的多聚核苷酸，包含有一種表達(dá)盒。即，該多聚核苷酸可操縱性地與一個(gè)啟動(dòng)子相連接。另外，翻譯增強(qiáng)序列和/或終止多聚核苷酸序列，均能包含在一個(gè)表達(dá)盒中。其它的多聚核苷酸，例如信號(hào)序列，也可以出現(xiàn)在一個(gè)表達(dá)盒中。
在本發(fā)明中的一個(gè)優(yōu)選的表達(dá)盒中，編碼植物優(yōu)選化或者野生型的免疫原性多肽的多聚核苷酸，例如HBsAg，可操縱性地與一個(gè)植物功能性的啟動(dòng)子相連接，例如CaMV35S或者西紅柿E8啟動(dòng)子。此外，表達(dá)盒中還可以包括一個(gè)煙草蝕刻病毒(TEV)或者煙草花葉病毒(TMV)的Ω翻譯啟動(dòng)子，它只能被轉(zhuǎn)錄，但不能被翻譯。表達(dá)盒中還可以包括一個(gè)3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)，例如胭脂堿合酶(nos)、植物貯藏蛋白(vsp)或者蛋白酶抑制劑如pin2。一種表達(dá)盒可能在翻譯增強(qiáng)序列和免疫原性多肽編碼序列之間，和/或者在3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)之間，缺乏一個(gè)非轉(zhuǎn)錄區(qū)。(Mason，1992).
本發(fā)明中的表達(dá)盒，包含有啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在植物的特定部位有直接的多肽表達(dá)。例如，包含CaMV35S啟動(dòng)子和本發(fā)明中多聚核苷酸的表達(dá)盒，在本質(zhì)上，可用于轉(zhuǎn)化植物，以致于表達(dá)有本發(fā)明中多聚核苷酸的多肽，可以在植物的葉片中產(chǎn)生。這就需考慮多聚核苷酸表達(dá)的快速分析，以及多聚核苷酸產(chǎn)物的生物化學(xué)特性。
包含有2S白蛋白啟動(dòng)子和本發(fā)明多聚核苷酸的表達(dá)盒，可以被用于使種子-特異性的多聚核苷酸表達(dá)，進(jìn)而在種子的組織中合成本發(fā)明中多肽的產(chǎn)物，例如，菜籽油(Brassica napus)種子。
由一個(gè)patatin啟動(dòng)子或大豆vspB啟動(dòng)子以及發(fā)明中的多聚核苷酸組成的表達(dá)性基因片段，在塊莖組織中，例如馬鈴薯(塊莖茄屬植物)，可以被用來(lái)誘導(dǎo)塊莖特異性的多聚核苷酸的表達(dá)和塊莖特異性地產(chǎn)生多肽。
由果實(shí)成熟特異性啟動(dòng)子和發(fā)明中的多聚核苷酸組成的表達(dá)性基因片段，可以被用來(lái)轉(zhuǎn)化那些在其成熟果實(shí)中，例如香蕉(Musaacuminata)產(chǎn)生發(fā)明中的多肽的植物。表達(dá)載體如果需要的話，含有本發(fā)明中的多聚核苷酸片段的多核苷酸或基因表達(dá)片段，可以被克隆到一個(gè)表達(dá)性載體中，然后被轉(zhuǎn)換到細(xì)胞之中，例如細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物或者是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞之中。這樣，本發(fā)明中的多聚核苷酸片段可以在細(xì)胞培養(yǎng)中得到表達(dá)并被分離出來(lái)。多聚核苷酸片段還可以被包含在質(zhì)粒中，例如PBR322、PUC或者ColE1質(zhì)粒，也可以被包含在腺病毒載體中，如腺病毒II型載體或者腺病毒V型載體。另外也可以使用其他載體，包括但是并不僅僅局限于如下的載體Sindbis病毒、猿病毒40、α病毒載體、巨細(xì)胞病毒、以及一些逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，如鼠科肉瘤病毒、鼠乳腺腫瘤病毒、，莫羅尼鼠科白血病病毒和勞斯肉瘤病毒。還可以使用細(xì)菌性載體，例如沙門氏菌屬、小腸結(jié)腸耶爾森氏菌屬、志賀氏菌屬、霍亂弧菌屬、BCG分枝桿菌菌株、單細(xì)胞基因李斯特菌屬和土壤桿菌屬等等。另外，也可以使用微小染色體，如MC和MC1、噬菌體、病毒顆粒、病毒樣顆粒、cos質(zhì)粒(插入λ噬菌體cos位點(diǎn)的質(zhì)粒)以及復(fù)制子(一個(gè)細(xì)胞中可以在自我控制下進(jìn)行復(fù)制的基因片段)作為表達(dá)性載體。
優(yōu)選的是，除了包含有發(fā)明中的多聚核苷酸片段外，一個(gè)表達(dá)性載體還應(yīng)包括一個(gè)可選擇的標(biāo)記物。可選擇的標(biāo)記物的例子包括卡那霉素基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、新霉素轉(zhuǎn)移酶基因、tfdA基因、Pat基因、hyg基因、氨甲蝶呤抵抗性DHFR基因、去鹵化酶基因和bar基因。表達(dá)載體還可以含有一段大腸桿菌的復(fù)制起始端，例如ColE1或者PBR322的復(fù)制起始端，以便有助于載體在大腸桿菌中的復(fù)制。本發(fā)明中的多聚核苷酸片段的表達(dá)性載體還可以含有一個(gè)根癌土壤桿菌的復(fù)制起始端，以便允許載體在那里的復(fù)制，例如用于根癌土壤桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化時(shí)。
基因抑制效應(yīng)可能影響本發(fā)明中的多聚核苷酸片段的表達(dá)水平。有兩種不同形式的基因抑制效應(yīng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程基因抑制效應(yīng)(TGS)和轉(zhuǎn)錄后基因抑制效應(yīng)(TPGS)。Vaucheret等人，Plant J.植物雜志，16651-9。有一種類型的轉(zhuǎn)錄過(guò)程基因抑制效應(yīng)是順式滅活，在這種情況下，一個(gè)被甲基化的DNA位點(diǎn)可以影響與之相連接的DNA片段。在植物中，甲基化作用可以從鄰近的基因序列傳播到轉(zhuǎn)移基因中，并導(dǎo)致基因抑制效應(yīng)。Prols和Meyer，Plant J.植物雜志，2463-75(1992年)。在一段最優(yōu)化的植物DNA序列中，可能發(fā)生甲基化作用的位點(diǎn)的數(shù)目減少，甚至沒(méi)有這桿的位點(diǎn)，因此，如果在轉(zhuǎn)基因蛋白中使用最優(yōu)化的植物DNA序列，就有可能將這種類型的基因抑制效應(yīng)減到最少。另一種類型的順式滅活發(fā)生在同一核苷酸序列的多個(gè)復(fù)制片段整合在同一位點(diǎn)時(shí)。同樣的是，基因抑制效應(yīng)的發(fā)生機(jī)制似乎與甲基化作用有關(guān)(Ye和Signer，PNAS，USA，9310881-6(1996年)。使用不含有潛在的甲基化位點(diǎn)的一段植物最優(yōu)化序列，可能會(huì)避免這種類型的基因抑制效應(yīng)。
當(dāng)轉(zhuǎn)基因RNA高水平產(chǎn)生時(shí)，就有可能發(fā)生轉(zhuǎn)錄后基因抑制效應(yīng)。如果有不止一個(gè)的轉(zhuǎn)基因模版在產(chǎn)生RNA，那么產(chǎn)生的RNA就可能積累到一個(gè)閾值水平，從而激發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因抑制效應(yīng)(Vaucheret等人，Plant J.植物雜志，16651-9(1998年)。一些研究顯示，在轉(zhuǎn)錄區(qū)域只要有60個(gè)堿基對(duì)的恒定DNA序列，就可以介導(dǎo)這一過(guò)程。Depicker和Van Mantagu，細(xì)胞生物學(xué)的最新觀點(diǎn)Curr.Opin CellBiol.，9373-82(1997年)。在一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物中聯(lián)合同一編碼序列的不同的模版，可以增加編碼同一多聚核苷酸的mRNA水平，但是并不會(huì)激發(fā)RNA-介導(dǎo)的基因抑制過(guò)程。
一個(gè)最佳實(shí)施例是，一個(gè)表達(dá)載體應(yīng)包含有兩個(gè)表達(dá)盒。一個(gè)基因表達(dá)盒由編碼具有免疫原性的多肽(或抗原)的多聚核苷酸組成。另一個(gè)基因表達(dá)盒由與前者不同的多聚核苷酸組成，但編碼同樣的免疫原性多肽。例如，第一個(gè)基因表達(dá)盒由編碼乙肝表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸組成，在這里的多聚核苷酸已被植物最優(yōu)化。見SEQ ID NO3(圖22)。而第二個(gè)表達(dá)性基因盒則可由編碼天然病毒來(lái)源的(即野生型)乙肝表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸構(gòu)成。一個(gè)表達(dá)載體如果由兩個(gè)或多個(gè)編碼同一免疫原性多肽的表達(dá)性基因片段組成的話，則可以通過(guò)增加復(fù)制的數(shù)量米增加這種免疫原性多肽的產(chǎn)量。但是，多個(gè)模版或同一基因序列的順序復(fù)制可能導(dǎo)致不希望出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制效應(yīng)。DepicherVan和Montagu，細(xì)胞生物學(xué)最新觀點(diǎn)，Curr.Opin.Cell Biol.9651-9(1998年)。因此，發(fā)明中的一個(gè)目的就是減少甚至消除轉(zhuǎn)錄過(guò)程基因抑制效應(yīng)。例如，將兩個(gè)或者兩個(gè)以上編碼同一免疫原性多肽、但由不同多聚核苷酸組成的表達(dá)性基因片段，引入一個(gè)表達(dá)性載體之中，從而減少甚至消除RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制效應(yīng)。最佳的是，通過(guò)使用不同的啟動(dòng)子、以及5’末端和3’末端被轉(zhuǎn)錄而不被翻譯的區(qū)域，例如翻譯增強(qiáng)序列和終止序列，從而進(jìn)一步減少表達(dá)性基因盒的組成序列的同一性。表達(dá)盒還可包括不同的多聚核苷酸編碼，例如信號(hào)多肽。
優(yōu)選的是，整合到植物表達(dá)載體的每一個(gè)表達(dá)盒，與另一個(gè)長(zhǎng)度超過(guò)90個(gè)堿基對(duì)的表達(dá)盒相比，二者不具有相同的序列。更理想的是，與另一個(gè)長(zhǎng)度超過(guò)60個(gè)堿基對(duì)的表達(dá)盒相比，二者不具有相同的序列。而最理想的情況是，與另一個(gè)長(zhǎng)度超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)的表達(dá)性基因片段相比，二者不具有相同的序列。也就是說(shuō)，當(dāng)一個(gè)表達(dá)盒中的每一部分(例如編碼啟動(dòng)子或免疫原性多肽的核酸、5′末端和3′末端被轉(zhuǎn)錄而不被翻譯的區(qū)域、以及其他組成部分)與第二個(gè)表達(dá)盒的相應(yīng)部分相比時(shí)，在兩個(gè)表達(dá)盒中的任何一段長(zhǎng)度，沒(méi)有連續(xù)超過(guò)90個(gè)堿基對(duì)(或60個(gè)堿基對(duì)、或30個(gè)堿基對(duì))是完全相同的。
通過(guò)構(gòu)造包括例如兩個(gè)相同的表達(dá)盒組成的一個(gè)植物表達(dá)載體，而每一個(gè)表達(dá)盒都由編碼一個(gè)目標(biāo)免疫原性多肽的多聚核苷酸組成，利用這種方法可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程基因抑制效應(yīng)的差異。在一個(gè)植物細(xì)胞中，這種免疫原性多肽表達(dá)的數(shù)量，可以與一個(gè)植物表達(dá)載體表達(dá)的免疫原性多肽的量相比較，而這個(gè)植物表達(dá)載體由兩個(gè)不同的表達(dá)盒組成，每個(gè)表達(dá)盒都編碼這種目標(biāo)多肽。由兩個(gè)不同的表達(dá)盒組成的植物表達(dá)載體所表達(dá)的免疫原性多肽的數(shù)量更多，從而提示在植物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄后基因抑制效應(yīng)被減弱或是沒(méi)有被激活。理想的是，轉(zhuǎn)錄過(guò)程基因抑制效應(yīng)至少被減少10％、25％、50％、75％或者是100％。
進(jìn)一步而言，一個(gè)植物表達(dá)載體中的每一個(gè)表達(dá)盒可以由相同或者不同的啟動(dòng)子、翻譯增強(qiáng)序列和終止序列組成。每一個(gè)表達(dá)性基因片段還可以包含其他的多聚核苷酸序列，例如編碼信號(hào)序列的多聚核苷酸。優(yōu)選的是，當(dāng)在一個(gè)植物表達(dá)性載體中使用兩個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒時(shí)，每一個(gè)表達(dá)盒包括一個(gè)不同的免疫原性多肽、一個(gè)不同的翻譯增強(qiáng)序列和一個(gè)不同的終止序列。
在另一種最佳實(shí)施例中，單獨(dú)的、不相同的表達(dá)載體，如果它們都有一個(gè)表達(dá)盒編碼同一種多肽(或抗原)，就可以被順序地用于轉(zhuǎn)化一種植物。進(jìn)一步而言，如果兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物含有不同的表達(dá)性基因片段，而這些不同的表達(dá)盒卻編碼同一種多肽(或抗原)，則可以將這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行有性繁殖，這樣，在篩選出的后代的基因組中將這兩個(gè)表達(dá)性基因片段整合在一起。相似的情形下，每一個(gè)傳代植物中都包含有多個(gè)不相同的、但編碼相同多肽(或抗原)的表達(dá)盒，將不同的傳代植物進(jìn)行繁殖，結(jié)果是在每一個(gè)植物的基因組中不相同的表達(dá)盒數(shù)量越來(lái)越多。因此，在一個(gè)表達(dá)性載體上不需要存在多個(gè)表達(dá)盒，但是，基因表達(dá)性片段可以通過(guò)連續(xù)性轉(zhuǎn)化或者有性繁殖的方式，單獨(dú)地引入植物細(xì)胞中。
理想的情況是，發(fā)明中的一個(gè)植物表達(dá)載體至少包括2、3、4、5、10個(gè)甚至更多的表達(dá)盒。每一個(gè)表達(dá)盒可以構(gòu)成同一種多聚核苷酸，或者構(gòu)成不同的多聚核苷酸。含有多聚核苷酸和表達(dá)性載體的植物的轉(zhuǎn)化和重建本發(fā)明的另一方面是，組建的真核細(xì)胞或者原核細(xì)胞，包括與發(fā)明中的多聚核苷酸、或含有發(fā)明中的多聚核苷酸的表達(dá)性基因片段一起轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的是，該細(xì)胞是一個(gè)植物細(xì)胞，但是，其他類型的細(xì)胞，例如昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、以及細(xì)菌的細(xì)胞也可以考慮。當(dāng)使用植物細(xì)胞時(shí)，理想的情況是，多聚核苷酸被整合到植物細(xì)胞核的基因組中，這樣可以保證該多聚核苷酸的穩(wěn)定性，以及可以被順利地傳代下去。本發(fā)明的多聚核苷酸在某些情況下，也可以存在于細(xì)胞染色體之外，例如存在于線粒體中、葉綠體中、或者是細(xì)胞質(zhì)中。一段多聚核苷酸轉(zhuǎn)移到昆蟲細(xì)胞中的理想模式是通過(guò)病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)移，這樣可以在染色體外持續(xù)進(jìn)行復(fù)制，或者整合到染色體中進(jìn)行復(fù)制。將多聚核苷酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物的細(xì)胞或是細(xì)菌細(xì)胞中的方法，在技術(shù)方而已經(jīng)廣為人知。
轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞最好來(lái)源于這樣一種植物，或者可以作為一種糧食被人們消費(fèi)，或者以一種容易分離的形式表達(dá)需要的蛋白質(zhì)或多肽。代表性的植物包括煙葉、香蕉、西紅柿、馬鈴薯、胡蘿卜、大豆、玉米、大米、小麥、以及向日葵。其中特別理想的馬鈴薯宿主包括“渴望者”和FL1607(Frito Lay佛萊托-雷1607)的各種品種，它們可以從位于威斯康星的雷因蘭德(Rhinelander，WI)的佛萊托-雷(FritoLay)有限公司購(gòu)得。另一種理想的西紅柿品種，TA234，可以從史蒂文·坦史斯雷(Steven Tanksley)處購(gòu)得，Dept.of Plant Breeding，CornellUniversity，Ithaca，NY 14853。本發(fā)明進(jìn)一步的特點(diǎn)是，通過(guò)一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的繁殖而獲得的轉(zhuǎn)基因植物種子，與發(fā)明中的多聚核苷酸一起轉(zhuǎn)化。
將外源性核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到植物中的主要方法中，根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)是其中之一。這種方法建立的基礎(chǔ)是冠狀五倍子的一種致病因子，該致病因子可以影響許多種雙子葉植物和裸子植物。當(dāng)目的植物宿主易于被感染時(shí)，這種根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)就可以提供很高的轉(zhuǎn)化率和預(yù)期的染色體整合模式。
土壤桿菌通常情況下感染植物的受傷部位，這些土壤桿菌帶有一個(gè)大的染色體外成分，稱之為Ti(腫瘤誘導(dǎo))質(zhì)粒。腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒包含有腫瘤誘導(dǎo)所需要的兩個(gè)區(qū)域。一個(gè)區(qū)域是T-DNA(被轉(zhuǎn)移的DNA)，這是最終被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移到植物基因組DNA中的一段DNA序列。另一個(gè)區(qū)域是vir(毒力)區(qū)域，這一區(qū)域是被包含在轉(zhuǎn)移機(jī)制之中的。雖然vir區(qū)域是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所必需的，但是，vir區(qū)域的DNA并不轉(zhuǎn)移到被感染的植物中去。通過(guò)感染土壤桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以及隨后的T-DNA轉(zhuǎn)移，都已經(jīng)得到充分的證明。Bevan等人，Int.Rev.Genet.16357頁(yè)(1982)。土壤桿菌系統(tǒng)的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，可以允許常規(guī)性地將DNA轉(zhuǎn)移到多種植物組織的基因組中。例如，煙葉、西紅柿、向日葵、棉花、油菜籽、馬鈴薯、白楊和大豆等都可以通過(guò)土壤桿菌系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
優(yōu)選的是，當(dāng)根癌土壤桿菌介導(dǎo)含有本發(fā)明中的多聚核苷酸的植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，同時(shí)也提供了根癌土壤桿菌側(cè)面的T-DNA邊沿區(qū)域。T-DNA邊沿區(qū)域是23-25個(gè)堿基對(duì)的直接重復(fù)序列，與T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中有關(guān)。側(cè)面的T-DNA邊沿區(qū)域?qū)-DNA和將被轉(zhuǎn)移和整合到植物基因組中的信號(hào)多聚核苷酸括在一起。首選的是，本發(fā)明中的多聚核苷酸或者表達(dá)載體至少含有一個(gè)T-DNA邊沿區(qū)域，尤其是右側(cè)的T-DNA邊沿區(qū)域。另外，被輸送到一個(gè)植物基因組的多聚核苷酸是夾在T-DNA的左右邊界之間，這些邊沿區(qū)域可以來(lái)自于任何的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒(見下文)，這些區(qū)域還可以通過(guò)任何常規(guī)的手段連接到一個(gè)表達(dá)載體或者多聚核苷酸上。
典型的情況下，含有將被轉(zhuǎn)移的多聚核苷酸的載體首先是在大腸桿菌中構(gòu)建和復(fù)制。這個(gè)載體至少含有一個(gè)右側(cè)的T-DNA邊界區(qū)域，并且最好有一個(gè)左側(cè)和右側(cè)的邊界區(qū)域，分別位于所需多聚核苷酸的側(cè)面。同時(shí)還可以存在一個(gè)選擇性標(biāo)記物(例如編碼抗生素耐藥性的基因，如卡那霉素)，以便容易篩選已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后，大腸桿菌載體被轉(zhuǎn)移到土壤桿菌，這一過(guò)程可以通過(guò)結(jié)合配對(duì)系統(tǒng)或者直接攝取的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。一旦進(jìn)入到土壤桿菌之中，含有多聚核苷酸的載體可以與土壤桿菌中的Ti質(zhì)粒進(jìn)行同源性的重組，將T-DNA合并到Ti質(zhì)粒之中。Ti質(zhì)粒還含有一套可誘導(dǎo)的vir基因，在將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中時(shí)發(fā)揮作用。
另外，含有多聚核苷酸的載體可以以反式的形式隸屬于Ti質(zhì)粒的vii基因。在一優(yōu)選的方面，特定細(xì)胞株系的Ti質(zhì)粒被“解除武裝”，也就足說(shuō)T-DNA的致癌基因被消除或受到抑制，從而避免了在轉(zhuǎn)化的植物中形成腫瘤，但是，反式結(jié)構(gòu)的vir基因仍然作用于T-DNA向植物宿主中的轉(zhuǎn)移。見Hood，Trangenic Res.，2208-218(1993年)；Simpson，Plant Mol.Biol.，6403-415頁(yè)(1986)。例如，在一個(gè)二元的載體系統(tǒng)中，大腸桿菌質(zhì)粒載體被構(gòu)建起來(lái)，其中含有側(cè)面與T-DNA邊沿區(qū)域相連接的目標(biāo)多聚核苷酸，以及一個(gè)選擇性標(biāo)記物。這個(gè)質(zhì)粒載體被轉(zhuǎn)移到大腸桿菌之中，然后，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌通過(guò)結(jié)合作用與土壤桿菌配對(duì)。這個(gè)作為受者的土壤桿菌含有一個(gè)第二Ti質(zhì)粒(輔助性Ti質(zhì)粒)，而該質(zhì)粒中含有vir基因，但是已經(jīng)被修飾過(guò)，切除了其中的T-DNA片段。輔助性Ti質(zhì)粒將為植物細(xì)胞的感染提供必要的蛋白質(zhì)，但是只有大腸桿菌修飾的T-DNA質(zhì)粒將被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中去。
根癌土壤桿菌系統(tǒng)允許許多種植物組織進(jìn)行常規(guī)的轉(zhuǎn)化。見Chilton，Scientific American，248-50(1983)；Gelvin，PlantPhysiol，92281-285(1990)；Hooykaas，Plant Mol Biol.，13327-336(1992)；Rogers等，Science，2271229-1231(1985)。表1列出了利用這種系統(tǒng)被轉(zhuǎn)化的代表性植物和代表性的參考文獻(xiàn)。其他有可食部分的植物，或者可以通過(guò)加工提取單獨(dú)的蛋白質(zhì)的植物，也可以利用同樣的方法或相關(guān)的常規(guī)修飾進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
表1植物 參考文獻(xiàn)煙葉Barton，K.等，(1983)Cell，32，1033西紅柿 Fillatti，J.等， (1987)Bio/Technology，5，726-730馬鈴薯 Hoekema，A.等， (1989)Bio/Technology，7，273-278茄子 Filipponee，E.等，(1989)Plant Cell Rep.8，370-373Pepino Atkinson，R.等，(1991)Plant Cell Rep.10，208-212山藥 Shafer，W.等，(1987)Nature，327，529-532大豆 Delzer，B.等，(1990)Corp.Sci.，30320-322豌豆 Hobbs，S.等，(1989)，Plant Cell Rep.8274-277糖用甜菜 Kallerhoff，J.等，(1990)，Plant Cell Rep.9，224-228萵苣 Michelmore，R.等，(1987)， Plant Cell Rep.6439-442鐘形胡椒 Liu，W.等，(1990)，Plant Cell Rep.9360-364芹菜 Liu，C-N等，(1992)，Plant Mol，Biol.1071-1087胡蘿卜 Liu，C-N等，(1992)，Plant Mol，Biol.1071-1087蘆筍 Delbriel，B等，(1993)，Plant Cell Rep.12129-132洋蔥 Donnusse，E.等，(1990)，Plant Sci.69249-257葡萄藤 Baribault，T.等，(1989)，Plant Cell Rep.8137-140香瓜 Fang，G.等，(1990)，Plant Cell Rep.9160-164草莓 Nehra，N.等，(1990)，Plant Cell Rep.9，10-13大米 Raineri，D.等，(1990)，833-38向日葵 Schrammeijer，B.等，(1990)，Plant Cell Rep.955-60油菜籽 Pua，E.等，(1987)，Bio/Technology，5815小麥 Mooney，P.等，(1991)，Plant Cell Tiss.Organ Cult.25209-218燕麥 Donson，P.等，(1988)，Virology，162，248-250玉米 Gould，J.等，(1990)，Plant Physiol.95426-434紫花苜蓿 Chabaud，M.等，(1988)，Plant Cell Rep.7512-516
柿花 Umbeck，P.等，(1987)，Bio/Technology.5263-266胡桃 McGranahan，G.等，(1990)，Plant Cell Rep.8512-516云杉/針葉樹 Ellis，D.等，(1989)，Plant Cell Rep.816-20白楊 Pythoud，F(xiàn).等，(1987)，Bio/Technology.51323蘋果 James，D.等，(1989)，Plant Cell Rep.7658-661其他土壤桿菌菌株，例如毛根土壤桿菌，也可以當(dāng)作載體用于植物的轉(zhuǎn)化。生根菌促進(jìn)許多種類的雙子葉植物根毛的形成，其中含有一個(gè)大的染色體外成分，稱之為Ri(毛根誘導(dǎo))質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒的作用方式與根癌土壤桿菌中的Ti質(zhì)粒相似。采用與利用根癌土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化相似的方法，發(fā)展了利用毛根土壤桿菌進(jìn)行的轉(zhuǎn)化，并且這種轉(zhuǎn)化已被成功地使用，例如，用來(lái)轉(zhuǎn)化紫花苜蓿和白楊，Sukhapinda等，Plant Mol.Biol.8209(1987)。
根據(jù)植物的不同種類和土壤桿菌的傳遞系統(tǒng)，植物組織接種的方式有多種多樣。一種簡(jiǎn)便的方法是葉盤程序，這種方法可以用任何的組織外植體來(lái)進(jìn)行，只要這個(gè)外植體為整個(gè)植物分化的啟動(dòng)提供良好的來(lái)源。在特定的情況下可能還需要添加培育組織。接下來(lái)進(jìn)行其他程序，例如含有根癌土壤桿菌的再生原生質(zhì)體的體外轉(zhuǎn)化，以獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
在不使用土壤桿菌質(zhì)粒的情況下，可以利用基因直接轉(zhuǎn)移程序來(lái)轉(zhuǎn)化植物和植物組織。Potrykus，Bio/Technology，8535-542(1990)；Smith等人，Crop.Sci.，3501-309(1995)。直接轉(zhuǎn)化包括將外源性遺傳物質(zhì)攝入到植物細(xì)胞或者原生質(zhì)中。通過(guò)使用化學(xué)試劑或者是電場(chǎng)，可以加強(qiáng)這種攝取作用。例如，本發(fā)明中的多聚核苷酸可以被轉(zhuǎn)移到一種植物的原生質(zhì)中，方法是用在原生質(zhì)面前使用電穿孔術(shù)，用一個(gè)電刺激處理原生質(zhì)。為了實(shí)現(xiàn)電穿孔，原生質(zhì)被分離并懸浮在甘露醇溶液中。含有發(fā)明中的多聚核苷酸的超螺旋或環(huán)狀的質(zhì)粒DNA被加入其中。將溶液混合均勻，在室溫條件下將其置于大約400伏/厘米的脈沖中10-100毫秒。這時(shí)細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生可逆性的、自然的裂解，從而外源性的遺傳物質(zhì)便被轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)中。然后，外源性的遺傳物質(zhì)被整合到細(xì)胞核中的基因組中。一些單子葉植物的原生質(zhì)也是通過(guò)這一途徑而被轉(zhuǎn)化的，其中包括大米和玉米。
在植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化中，脂質(zhì)體的融合也是一種有效的辦法。在這種方法中，原生質(zhì)被聚集在一起，而其中的脂質(zhì)體則帶有發(fā)明中的多聚核苷酸。當(dāng)原生質(zhì)的細(xì)胞膜融合時(shí)，外源性的遺傳物質(zhì)便被轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)中。Dehayes等人，EMBO J.42731頁(yè)(1985)。同樣的，在煙葉(一種雙子葉植物)和繁葉Lolium(一種單葉植物)中都實(shí)現(xiàn)了直接基因轉(zhuǎn)移，利用的是聚乙烯乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用。Mg2+和聚乙烯乙二醇(PEG)之間的協(xié)同作用會(huì)影響直接基因轉(zhuǎn)移，Ca2+也可能在其中發(fā)揮作用。Negrutiu等人，Pant Mol.Biol.，8363(1997)。另一種選擇是，利用一個(gè)精細(xì)制作的玻璃針，將含有發(fā)明中的多聚核苷酸的質(zhì)粒DNA溶液以微注射的方式直接注射入細(xì)胞之中，這樣，外源性的DNA就被引入到細(xì)胞或原生質(zhì)中。
也可以用“基因槍”法(或稱為微粒加速過(guò)程)來(lái)實(shí)現(xiàn)直接的基因轉(zhuǎn)移，包括用攜帶有發(fā)明中的多聚核苷酸來(lái)微小炮彈來(lái)轟擊植物細(xì)胞。Klein等，Nature，32770(1987)；Sanford，Physiol.Plant.，79206-209(1990)。在該過(guò)程中，用發(fā)明中的多聚核苷酸包裹具有化學(xué)惰性的金屬顆粒，例如鎢或者金，并將之加速射向目的植物細(xì)胞。于是這些顆粒攜帶著發(fā)明中的多聚核苷酸穿入細(xì)胞內(nèi)。研究顯示，“基因槍”法既可以使懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞、原生質(zhì)和植物的未成熟萌芽(這些植物包括洋蔥、玉米、大豆及煙草)出現(xiàn)暫時(shí)的基因表達(dá)，也可以使之出現(xiàn)穩(wěn)定的基因表達(dá)。McCabe等，Bio/Technology，6923(1988)。
除此之外，DNA病毒也可以用來(lái)作用植物中的基因載體。例如，攜帶有經(jīng)修飾過(guò)的、細(xì)菌氨甲蝶呤耐藥基因的花椰菜鑲嵌病毒曾被用于感染一種植物。外源性基因系統(tǒng)性地分布于整個(gè)植物。Brisson等，Nature，310511(1984)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括容易感染，在整個(gè)植物中系統(tǒng)地分布，每個(gè)細(xì)胞中都有基因的多個(gè)拷貝。
一旦植物細(xì)胞被轉(zhuǎn)化后，有多種方法可用于植物的再生。特定的再生方法的選擇，取決于啟始的植物組織類型和需要再生的特定的植物品種。許多植物可以由來(lái)源于植物外植體的瘢痕組織再生，其中包括玉米、大米、燕麥、小麥、黑麥、向日葵、大豆、棉花、油菜籽和西紅柿，但不僅僅局限于這些植物。利用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物組織，并在此基礎(chǔ)上再生植物，這在多種植物中得到了證實(shí)，例如向日葵、西紅柿、白色三葉草、油菜籽、棉花、西紅柿、土豆、玉米、大米和多種蔬菜作物，但不僅僅局限于這些植物。從原生質(zhì)體進(jìn)行植物再生是特別有用的一項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)在許多植物中得到了證實(shí)，例如煙草、土豆、白楊、玉米和大豆，但不僅僅局限于這些植物。Evans等人，Handbook of Plant Cell Culture 1，124(1983)。
通過(guò)使用一個(gè)報(bào)告基因測(cè)量指定結(jié)構(gòu)的表達(dá)效能，可以用來(lái)探查關(guān)于植物轉(zhuǎn)化項(xiàng)目的初步研究以及其他一些類似的研究。典型的報(bào)告基因主要編碼β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、β-牛乳糖、綠色熒光蛋白和熒光素酶。由一個(gè)報(bào)告基因或本發(fā)明中的多聚核苷酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，可以用多種方法分析其表達(dá)水平。例如，標(biāo)準(zhǔn)的Southern或Northern印跡雜交、多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、以及免疫分析技術(shù)，都可使用于所選擇的植物組織。表達(dá)發(fā)明中的免疫原性多肽的植物本發(fā)明包括整個(gè)植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物組織、植物種子、原生質(zhì)體、瘢痕、細(xì)胞培養(yǎng)以及任何一組形成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的植物細(xì)胞，至少能夠表達(dá)一種發(fā)明中的多聚核苷酸。理想的情況是，整個(gè)植株、植物細(xì)胞、植物器官、植物組織、植物種子、原生質(zhì)體、愈合組織、細(xì)胞培養(yǎng)以及任何一個(gè)植物細(xì)胞組，能夠在總的可溶植物材料中，每克至少產(chǎn)生0.001、0.01、1、5、10、25、50、100、500或1000微克發(fā)明中的多肽。最佳的是，根據(jù)發(fā)明所使用的植物，攝取的每克植物材料至少應(yīng)該含有5微克的、理想的是含有7微克至15微克的乙肝表面抗原(HBsAg)。對(duì)于動(dòng)物，例如一個(gè)人，通常情況下會(huì)攝入足量的植物性食物，這樣為身體的每公斤體重提供大約2克至5克的植物物質(zhì)。本發(fā)明進(jìn)一步還包括將發(fā)明中的免疫原性多肽，如乙肝表面抗原，從產(chǎn)生這些多肽的植物細(xì)胞或者植物組織中分離、純化或部分純化。
可以采用ELASA方法分析植物組織的提取物中免疫原性多肽的表達(dá)程度。簡(jiǎn)而言之，可以使用各種技術(shù)，例如聚苯乙烯ELASA盤，使緩沖液中免疫性多肽的中和性抗體被包被上。在室溫下經(jīng)過(guò)的約一個(gè)小時(shí)的孵化，將緩沖液洗掉，例如使用PBS沖洗，而被阻礙用于非特異性結(jié)合的小孔則用含有5％牛奶的PBS沖洗。將待分析的植物提取樣本加入這些小孔中。為了得到免疫原性多肽的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，不同稀釋濃度的、細(xì)菌來(lái)源的免疫原性多肽被加入同一個(gè)盤中。在室溫下孵化一個(gè)小時(shí)后，用緩沖液沖洗該盤?？寡?，例如針對(duì)免疫原性多肽的牛抗血清或免抗血清，用緩沖液和BSA稀釋，在室溫條件下于小孔中孵化1小時(shí)。用緩沖液清洗四次后，檢測(cè)孔中的物質(zhì)，例如，可用稀釋于緩沖液和BSA中的、對(duì)抗與堿性磷酸酶結(jié)合的山羊IgG的兔抗血清來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。用緩沖液清洗后，小孔在二氨基乙醇緩沖液中與對(duì)硝基酚磷酸鹽底物一起孵化。經(jīng)過(guò)10-30分鐘的孵化，通過(guò)加入氫氧化鈉終止反應(yīng)，并在410納米處讀取吸收劑量。
通過(guò)比較產(chǎn)生發(fā)明中的多肽的植物與不產(chǎn)生發(fā)明中的多肽的植物的生長(zhǎng)情況，可以用來(lái)檢測(cè)本發(fā)明中的多肽對(duì)產(chǎn)生多肽的植物的毒性作用。最佳的是，產(chǎn)生發(fā)明中的多肽的植物，與不產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的植物有著同樣或相似的生長(zhǎng)速率。發(fā)明中的免疫原性多肽的構(gòu)成成分本發(fā)明可以在整個(gè)植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物組織、植物種子、原生質(zhì)體、瘢痕、細(xì)胞培養(yǎng)、以及任何一組植物細(xì)胞(該組植物細(xì)胞形成結(jié)構(gòu)和/或功能單位，至少能夠表達(dá)一種發(fā)明中的多聚核苷酸)中提供含有免疫原性的多肽化合物，例如乙肝表面抗原(HBsAg)。本發(fā)明包括的植物材料，如葉、果實(shí)、塊莖，最好能被人或動(dòng)物食用。本發(fā)明還進(jìn)一步包括發(fā)明中的免疫原性多肽，這些多肽已經(jīng)從由產(chǎn)生它們的植物細(xì)胞或植物組織中分離、加工、提純或部分提純。例如，植物材料可以進(jìn)行提取、研磨、粉碎、干燥、勻化等等，產(chǎn)生最終產(chǎn)品，其形式可能是提取物、汁、液體、粉末或者片劑。在對(duì)嬰兒進(jìn)行某些疾病的預(yù)防時(shí)，它有特別的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢陨a(chǎn)出含有疫苗的果汁，如西紅柿汁、大豆汁和胡蘿卜汁，或者是含有疫苗的牛奶，從而使服用變得容易。植物成分還可以通過(guò)另一種方法進(jìn)行處理，即加入各種味道，使其變得更加美味。還可以通過(guò)加工，使植物中的抗原成分得到濃縮或純化，從而增強(qiáng)這些成分的免疫原性。雖然通常并不給予優(yōu)先的考慮，但是植物中的提取物也可以進(jìn)行獲取、滅菌和重新生成注射液，這樣如果需要的話，可以通過(guò)腸外途徑使用。
理想的是，任何對(duì)植物材料進(jìn)行濃縮或使之達(dá)到條件的加工過(guò)程，都應(yīng)該避免使免疫原性多肽，如HBsAg顆粒，發(fā)生明顯的變性，這樣多肽的抗原性不會(huì)丟失。合成物可能的免疫原性可以在體外用抗HBsAg的抗體進(jìn)行篩檢。本發(fā)明還可以提供含有發(fā)明中的多聚核苷酸的合成物。
本發(fā)明的合成物還可以含有制藥上可以接受的載體。這一載體自身不應(yīng)誘導(dǎo)對(duì)宿主有害的抗體產(chǎn)生。制藥上可以接受的載體，在制藥界中是人所熟知的。這些的載體包括大的緩慢代謝的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖(例如具有乳膠功能的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠和類似物)、多聚乳糖酸、多聚乙醇酸、氨基酸聚合物(例如多聚谷氨酸、多聚賴氨酸及類似物)、氨基酸共聚物、擬肽、擬脂質(zhì)和無(wú)活性的病毒顆粒等等，但是載體并不僅僅局限于上述這些物質(zhì)。
制藥中可接受的鹽也可在發(fā)明中的化合物中使用，例如，象鹽酸、溴化氫、磷酸鹽或硫酸鹽這樣的無(wú)機(jī)鹽，以及象醋酸鹽、proprionate、蘋果乳酸鹽和安息香酸鹽這樣的有機(jī)鹽。特別有用的蛋白底物有血清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子、甲狀腺球蛋白、卵白蛋白、破傷風(fēng)類毒素、以及制藥界中人所熟知的其它蛋白。發(fā)明中的合成物還可以包含液體或賦形劑，例如水、鹽水、甘油、右旋糖、丙二酸糊精、乙醇及類似物，它們可以單獨(dú)地，也可以聯(lián)合的形式加入化合物中。發(fā)明中的合成物中還可以包含如濕潤(rùn)劑、乳化劑或pH緩沖因子這樣的物質(zhì)。脂質(zhì)體也可以被用作發(fā)明中的化合物的載體。
如果需要，發(fā)明中的化合物中也可以包含協(xié)同刺激分子，這種分子可以促進(jìn)免疫原向淋巴細(xì)胞的呈遞，例如B7-1或B7-2，以及白介素-2、白介素-12這樣的細(xì)胞因子。在某些條件下，佐劑也可以包含在發(fā)明中的化合物之中。這些可以使用的佐劑包括但不局限于MF59-0、氫氧化鋁、N-乙?；?胞壁酸-L-蘇氨酸-D-同型谷氨酸鹽(thr-MDP)、N-乙?；?(-)-胞壁酸-L-丙氨酰基-D-同型谷氨酸鹽(CGP 11637，被稱為nor-MDP)、N-乙?；谒?L-丙氨?；?D-同型谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-雙甘油棕櫚?；?sn-丙三醇-3-羥基磷?；?-乙胺(CGP 19835A，被稱為MTP-PE)、細(xì)菌的質(zhì)粒DNA、抗HB抗體、含有免疫刺激性CpG的寡脫氧核糖核酸酶、親脂性的胞壁酸二肽衍生物(MDP-lys(L18))、磷酸鋁或者硫酸鋁、丙肝病毒核心蛋白和RIBI(它含有從細(xì)菌中提取的三種成分)、單磷?；|(zhì)a、海藻糖和2％鯊烯/80乳劑中的細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
理想的佐劑包括霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、抗獨(dú)特型抗原2F10、集落因子、志賀氏細(xì)菌性痢疾樣毒素、內(nèi)素、單磷?；|(zhì)a、OPTIVAX(U.S.Patent No.5622649)，外表面蛋白a(OspA)、氟化鈉、聚氨基葡萄糖、以及其中的亞單位、其中的突變體。(Clements等人，Vaccine，6269-277(1988年)；deHaan等人，Vaccine，14260-266(1996)；De Magistris，“作為粘膜輔助物的熱變性毒素的非毒性衍生物，”粘膜免疫遺傳學(xué)方法與佐劑。IBC生物醫(yī)學(xué)圖書館，Southborough，MA，PP.1.8.1-1.8.12，1996年(根據(jù)1995年10月16-18日IBC會(huì)議上Rockville的發(fā)言)；Dickinson等人，Infect.Immun.，631617-1623(1995)；Di Tommaso等人，Infect.Immun.，64974-979(1996)；Fontana等人，Infect.Immun.，632356-2360(1995)；Holmgren等人，Vaccine，111179-1184(1993)；Nedrud等人，Reg.Immunol，3217-222(1991)；Pride等人，J.Exp.Med.，177127-134(1993)；以及Thanavala等人的美國(guó)專利等。
佐劑可以與免疫原性化合物同時(shí)提供，也可以或者是在其前面，或者是在其之后。佐劑也可以整合到免疫原性化合物中而被提供，如轉(zhuǎn)基因植物的共同表達(dá)產(chǎn)物；佐劑還可以單獨(dú)地以一種方便的形式被提供，如液體形式，與產(chǎn)物一起獲得。理想的是，佐劑最好是一種免疫學(xué)上可以接受的物質(zhì)，可以促進(jìn)一種免疫反應(yīng)而沒(méi)有嚴(yán)重的毒性作用。
發(fā)明中的化合物可以包含持續(xù)釋放制劑、腸制劑、片劑、咀嚼片劑、膠囊、溶劑、腸外溶劑、鼻內(nèi)噴霧劑或粉末、藥片、栓劑、透皮貼片和懸浮劑。通常情況下，根據(jù)需要的劑量和使用的化合物的類型，化合物中至少含有0.01、0.1、1、3、5、10、20、30、40、50、60、70、或者80％的發(fā)明中的多肽或多聚核苷酸。激發(fā)免疫反應(yīng)的方法發(fā)明中的免疫原性多肽可以用于在許多動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)，例如牛、豬、鼠、豚鼠、兔、禽類(如雞、鴨、鵝)、黑猩猩、狒狒、短尾猿以及人類。理想的是，發(fā)明中的免疫原性多肽引起IgG和/或IgA抗體產(chǎn)生(見例21和23)，和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(見例24)。
首選的是，發(fā)明中的一種免疫原性多肽最好是粘膜免疫原，例如乙肝表面抗原HBsAg。為了達(dá)到發(fā)明中的目的，粘膜免疫原應(yīng)具有特異性地激發(fā)粘膜免疫系統(tǒng)的功能。更好的實(shí)施例是，發(fā)明中的粘膜免疫原以一種劑量依賴性的形式，激發(fā)粘膜免疫系統(tǒng)和/或刺激體液免疫反應(yīng)，而不會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性耐受，也不需要過(guò)量的抗原。這里系統(tǒng)性耐受指的是，當(dāng)某種抗原反復(fù)地給予哺乳動(dòng)物后，導(dǎo)致隨后特異性的抗體-抗原反應(yīng)減弱的現(xiàn)象。
目前認(rèn)為，發(fā)明中的免疫原的粘膜反應(yīng)包括免疫原刺激粘膜免疫系統(tǒng)時(shí)產(chǎn)生的任何反應(yīng)。典型的情況下，通過(guò)給被研究的哺乳動(dòng)物口服免疫原，就可以激活消化道相關(guān)性的淋巴組織(GALT)。通過(guò)這種將免疫原引入粘膜表面的途徑，就可以提供接近小腸M細(xì)胞的途徑，M細(xì)胞覆蓋著集合淋巴結(jié)和消化道相關(guān)性的淋巴組織(GALT)的其它淋巴叢。然而，這里膜的定義特異性地包括可能與發(fā)明中的免疫原接觸的所有粘膜。(例如通過(guò)吸入途徑可接觸的氣道粘膜，通過(guò)栓劑可接觸的直腸粘膜，等等)。
可以通過(guò)發(fā)明中的免疫原性多肽激發(fā)抗體產(chǎn)生，并與其他物質(zhì)一起，提供模型系統(tǒng)以優(yōu)化抗體對(duì)抗原的反應(yīng)，例如抗-HBsAg抗體對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)的反應(yīng)，還可以提供針對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)、其它細(xì)菌、病毒或原生動(dòng)物的預(yù)防性或治療性處理。例如，在給予HBsAg多肽后，通過(guò)檢測(cè)和/或定量抗-HBsAg抗體的滴度，可以確認(rèn)HBsAg的抗原決定部位，該部位對(duì)增加抗-HBsAg抗體的滴度尤其有效。通過(guò)分析針對(duì)不同長(zhǎng)度的HBsAg多肽產(chǎn)生的HBsAg抗體，可以確認(rèn)HBsAg抗原決定部位針對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的抗體反應(yīng)。還可以通過(guò)使用抗-HBV ELISA分析方法，檢測(cè)激發(fā)抗-HBsAg抗體產(chǎn)生的特定的HBsAg多肽的抗原決定部位，接下來(lái)可以確定哪一條多肽含有最有效的、激發(fā)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的抗原決定部位。然后就可以構(gòu)建HBsAg多肽或者融合蛋白，其中含有抗原決定部位，或者含有編碼這些抗原決定部位的多聚核苷酸，并可以將其用于激發(fā)強(qiáng)烈的HBsAg抗體反應(yīng)。
可以通過(guò)給予動(dòng)物或人免疫原性多肽，以在動(dòng)物或者人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)。最好的選擇是是口服免疫原性多肽?？梢圆捎迷跇I(yè)界熟知的給予多肽的各種方法，包括口服、肌肉注射、皮內(nèi)注射、腹膜腔內(nèi)注射、或者是皮下注射，另外還包括用生物飛彈(“基因槍”)注射。也可以采用經(jīng)鼻的途徑給藥內(nèi)。理想的是，免疫原性多肽最好同時(shí)伴隨有一個(gè)蛋白載體，這樣以便于口服。還可以使用聯(lián)合給予的方法，用來(lái)激發(fā)抗-HBsAg的免疫反應(yīng)。例如，可以通過(guò)一種途徑，如口服，給予一個(gè)劑量的免疫原性合成物，同時(shí)可以通過(guò)另外的途徑再給予一個(gè)支持劑量，例如通過(guò)經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)或直腸內(nèi)的途徑。
含有免疫原性多肽的發(fā)明中的化合物，或者是它的一個(gè)聯(lián)合體，其給予方式應(yīng)與其中使用的特定成分相一致，其使用的劑量應(yīng)有效地激發(fā)針對(duì)免疫原性多肽的免疫反應(yīng)，例如，由ELASA方法測(cè)定的抗-HBsAg抗體的滴度。
發(fā)明中的抗原性化合物的劑量取決于許多因素，其中包括物種、年齡、使用該化合物的人或動(dòng)物的一般情況、以及化合物的給予方式，但不僅僅局限于這些。單純采用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，就可以很容易地確定發(fā)明中的化合物的有效劑量。這里所述的體外模型或體內(nèi)模型，就可以用于確定合適的劑量。一般情況下，對(duì)于大型的哺乳動(dòng)物，如狒狒、黑猩猩或者是人，至少需要給予0.001、0.001、0.1、1.0、1.5、2.0、5、10毫克/公斤的抗原。最好是給予10-100微克/公斤。如果需要的話，協(xié)同刺激分子或佐劑可以與抗原性化合物同時(shí)使用，也可以在使用化合物之前、或者之后使用。發(fā)明中的免疫原性多肽既可以用于治療，也可以用于預(yù)防方面。通常地，我們希望植物或植物中被食用部分的數(shù)量足以提供足夠的免疫原性多肽，例如HBsAg，在動(dòng)物或人消耗的食物中，免疫原性多肽至少占到0.1，、1、2、5、10、50、100、500微克/克食物。進(jìn)一步而言，植物的提取物可以進(jìn)行制備和/或濃縮，以提高每克制備和/或濃縮的食物中多肽的含量，也可以服用這種經(jīng)制備和/或濃縮的食物。
在人或動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)給予發(fā)明中的化合物激發(fā)的免疫反應(yīng)，包括激發(fā)IgG和/或IgA抗體的產(chǎn)生，和/或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，都可以通過(guò)改變劑量、改變給藥途徑、以及強(qiáng)化配方來(lái)加強(qiáng)。發(fā)明中的化合物的給予可以采用單一劑量的時(shí)間表，或首選多劑量的時(shí)間表，這時(shí)疫苗接種的基本過(guò)程包括1-10種不同的劑量，在隨后一定的時(shí)間間隔給予其它劑量，以保持和/或加強(qiáng)免疫反應(yīng)，例如，在1-4月給予一個(gè)次要?jiǎng)┝?，并且如果需要的話，幾月后再給予一次或多次隨后劑量。理想的情況是，其中至少有一次是通過(guò)口服的途徑給藥，這樣既可以激發(fā)粘膜的免疫反應(yīng)，而且還有費(fèi)用較低、服用方便等優(yōu)點(diǎn)?？诜緩绞侵钢苯邮秤棉D(zhuǎn)基因植物或發(fā)明中的植物部分。最好對(duì)植物材料進(jìn)行多次攝取，如三次、四次、五次、十次甚至更多，每次攝取之間至少應(yīng)該間隔3天，最好是至少間隔7到14天。
在動(dòng)物或人體中給予免疫原性多肽，可以引起抗體滴度的增加和/或激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且至少可以持續(xù)1周、2周、1月、2月、3月、4月、6月、1年甚至更長(zhǎng)?？梢赃x擇在初次給藥后的1月、2月、3月、4月、5月、6月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間后，給予一次或者多次的免疫原性多肽的加強(qiáng)注射，用以保持動(dòng)物或人體內(nèi)的免疫反應(yīng)。還可以選擇在首次注射引起免疫反應(yīng)的化合物后，以植物或食物的形式服用發(fā)明中的多肽，用來(lái)加強(qiáng)免疫反應(yīng)。理想的免疫接種方法包括使用當(dāng)前抗原性復(fù)合體的一個(gè)或多個(gè)強(qiáng)化劑量，來(lái)增強(qiáng)受體的免疫反應(yīng)。相應(yīng)地考慮到，即可以將方便的轉(zhuǎn)基因植物作為主要的免疫原，也可以將其作為同種免疫原或其它免疫原的一個(gè)“強(qiáng)化劑”。例如，食用含有CT佐劑的轉(zhuǎn)基因西紅柿片，在隨后的7到16周腹腔內(nèi)或皮下給予酵母菌來(lái)源的重組rHBSAg(商品)，最后的的結(jié)果見圖4A-E。相似地，也可以用重組HBSAg進(jìn)行首次免疫接種，而將轉(zhuǎn)基因西紅柿和CT佐劑作為強(qiáng)化劑給予，保持抗體滴度的增加。最初的是，對(duì)于首次經(jīng)腸外途徑給予目前常用疫苗的個(gè)體，使用口服增強(qiáng)疫苗的效果得到了證實(shí)。更好的是，一種口服疫苗可以單獨(dú)地用于免疫接種計(jì)劃，并且能夠達(dá)到有效的保護(hù)作用。使用復(fù)合體的頻率和劑量不應(yīng)太大，否則會(huì)激發(fā)抗原的免疫耐受，這種情況可以通過(guò)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法加以確以。
為了確定發(fā)明中的、由植物產(chǎn)生的免疫原性多肽在口服時(shí)的免疫原性，可以將表達(dá)發(fā)明中的免疫原性多肽的植物的提取物、或植物組織喂給動(dòng)物，例如鼠或人。例如，可以將表達(dá)發(fā)明中的多肽的植物的提取物或植物組織喂給一組小鼠。而另一組小鼠則給予從表達(dá)相同抗原的大腸桿菌中提純的重組多肽，這里的相同抗原來(lái)源于一個(gè)重組質(zhì)粒?？梢杂肊LISA方法測(cè)定血清和粘膜中的抗體反應(yīng)。
現(xiàn)在已知，人體內(nèi)HBsAg抗體的滴度達(dá)到10mIU/mL時(shí)就有保護(hù)作用。目前推薦的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度至少可以達(dá)到100mIU/mL，以允許抗體滴度隨著時(shí)間的推移而下降。理想的是，經(jīng)過(guò)四次或更少次數(shù)的喂養(yǎng)后，由發(fā)明中的HBsAg免疫原性多肽引起的首次免疫反應(yīng)，可以使血清中抗-HBsAg抗體的水平超過(guò)50mIU/mL。當(dāng)發(fā)明中的化合物作為免疫增強(qiáng)劑時(shí)，理想的情況是經(jīng)過(guò)四次或更少次數(shù)的喂養(yǎng)后，血清中抗-HBsAg抗體水平能夠至少增加四倍，或者超過(guò)500mIU/mL。
在口服HBsAg免疫接種的研究中，霍亂毒素(CT，10微克/支)或者LT被用作了佐劑。例如，在表達(dá)乙肝表面抗原(HBsAg)的馬鈴薯塊莖切片上放置霍亂毒素(CT)，然后與抗原一起被動(dòng)物食用。CT在增強(qiáng)與HBsAg相關(guān)的免疫反應(yīng)方面非常有效。前期數(shù)據(jù)表明，作為HBsAg的口服佐劑，CT較大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素LTR192G的變異體更為有效，該變異體由土倫大學(xué)的John Clements發(fā)明。有意義的是，在喂養(yǎng)重組塊莖后可以檢測(cè)到分泌型的IgA抗體，而腸外給予HBsAg則不會(huì)產(chǎn)生這種抗體。
在闡明本發(fā)明中的例證中，是用5克表面覆蓋了10微克CT的重組馬鈴薯，以每周三次的間隔喂養(yǎng)小鼠。該方案中抗體滴度的峰值達(dá)到70-110mIU/mL，通過(guò)從重組酵母菌(Merck)中提純的、單一的亞免疫原的腹腔內(nèi)劑量的HBsAg的增強(qiáng)作用，抗體滴度可達(dá)1700-3400mIU/mL。測(cè)量得到的真實(shí)滴度與馬鈴薯中HBsAg的表達(dá)水平相關(guān)。該劑量反應(yīng)水平是劑量相關(guān)性的，表現(xiàn)在攜帶1.1μg/g HBsAg的馬鈴薯與攜帶8.3μg/g HBsAg的馬鈴薯相比，前者所致的免疫反應(yīng)較低，持續(xù)時(shí)間較短。上述同樣的喂養(yǎng)方案可以增強(qiáng)從重組酵母菌(MERCK)中提純的、單一的皮下注射劑量的HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，使抗體滴度的峰值達(dá)到1000mIU/mL。沸煮后(5分鐘，100℃)的塊莖不產(chǎn)生可檢測(cè)到的免疫反應(yīng)，但在如果隨后給予從重組酵母菌(MERCK)中提純的、單一的腹腔內(nèi)劑量的HBsAg，就可以見到顯著的增強(qiáng)作用。
以下文字僅供說(shuō)明目的，而不是要將先前所述及的本發(fā)明中的廣泛應(yīng)用加以范圍限制。在本文中所引用的所有參考文獻(xiàn)被列于此，以供參考。
例證例1.HB101和HB102載體的合成pHB101將來(lái)自pMT-SA(由中國(guó)科學(xué)院李和國(guó)(翻譯名)友情提供)Pst I/HindIII切割片段的HBsAg編碼區(qū)域，亞克隆入pBluescriptKS(分層基因)形成pKS-HBS。通過(guò)BstBI使pKS-HBS的HBsAg基因在含終止密碼子的3’端打開116個(gè)堿基對(duì)，通過(guò)加入Klenow酶和dCTP/dGTP使其所產(chǎn)生的末端鈍化，然后，用BamHI酶在Pst I位點(diǎn)上游16bp的位置將整個(gè)編碼區(qū)域切斷。將pBI121(Clontech實(shí)驗(yàn)室，Palo Alto，CA)用Sac I消化，末端用綠豆核酶鈍化，然后用BamHI釋放GUS編碼區(qū)域使載體分離。將HBsAg編碼片段與缺乏GUS的pBI121連接而產(chǎn)生pHB101，由pBI121衍生而來(lái)的菜花花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)其表達(dá)。
pHB102(圖1A)菜花花葉病毒35S啟動(dòng)子的重復(fù)啟動(dòng)子與煙草蝕刻病毒(TEV)5’端非翻譯引導(dǎo)序列相連，其作為翻譯啟動(dòng)子(Carrington等，J Virol.，641590-1597，(1990))，通過(guò)以下方式從pRTL2-GUS(Carrington等，Plant Cell 3953-962，(1991))切割得到用NcoI酶將pRTL2-GUS進(jìn)行消化，末端用綠豆核酶鈍化，通過(guò)HindIII的消化將啟動(dòng)子-引導(dǎo)片段釋放出來(lái)。用HindIII和SmaI消化pHB101以釋放35S啟動(dòng)子片段，載體得到純化。隨后，啟動(dòng)子-引導(dǎo)片段與經(jīng)HindIII/Sma I消化過(guò)的pHB101連接，產(chǎn)生pHB102。在二種構(gòu)建中，HBsAg編碼區(qū)域均位于nopaline合成酶終止子的上游。通過(guò)土壤桿菌tumefaciens介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化作用整合入植物基因組DNA的DNA界限是由質(zhì)粒所含有的左側(cè)和右側(cè)區(qū)域指示的，質(zhì)粒還含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，可以通過(guò)卡那霉素進(jìn)行選擇。例2.HBsAg cDNA本地的5’與 3’端非翻譯區(qū)域的HB102發(fā)生的缺失pHB103(圖1A)Mason H.，等(1992)以及前文均描述了質(zhì)粒HB102的構(gòu)建。經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，病毒非翻譯序列的選擇性缺失可以改善植物中重組蛋白的聚集。因此，除了非編碼病毒序列的缺失外，HB103和HB102的構(gòu)建是一致的，非編碼病毒序列的缺失可以降低轉(zhuǎn)錄率或翻譯效率。來(lái)自質(zhì)粒pKS-HBS(Mason等1992)的HBsAg編碼區(qū)域通過(guò)加入寡HBNco(5’CATGCCATGGAGAACACAACATCAGG3′)(序列號(hào)7)與HBSac(5’GCC GGA GCT CAA ATG TAT ACC CAA AGA CA3′)(序列號(hào)8)經(jīng)PCR方法得到放大。這使編碼區(qū)域在啟始密碼子中引入NcoI位點(diǎn)，終止密碼子中引入SacI位點(diǎn)。利用NcoI和SacI位點(diǎn)將PCR片段克隆入中間載體指定的pIBT201.1(Haq等Science 268714-716(1995))，形成質(zhì)粒pIBT201.1HBsC#10。
來(lái)自pIBT201.1HBsC#10的XhoI到SacI片段被亞克隆入pBluescript SK+以產(chǎn)生中間性pBSSKHBsC#6。未修飾的XhoI到SacI片段被亞克隆入pIBT211.1以建立中間性pIBT211.1HBsC#9。pBI101(Clontech，Jefferson等EMBO J.133901-3907，(1987))與SacI、EcoRI消化得到的Nos終止子片段連接到pIBT210.1的相同位點(diǎn)，并除去VSP終止子，可以獲得載體pIBT211.1。來(lái)自pIBT211.1HBsC#9的HindIII/EcoRI片段被亞克隆入植物轉(zhuǎn)移載體pBI101以產(chǎn)生pHB103，該質(zhì)粒的HindIII與EcoRI位點(diǎn)之間含有35S啟動(dòng)子和重復(fù)性啟動(dòng)子、TEV先導(dǎo)序列、HBsAg編碼區(qū)域和Nos終止序列，圖1A和圖2A分別表示了HB103的表達(dá)盒子和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)圖。例3.對(duì)HB103的修飾下列構(gòu)造都是對(duì)HB103的修飾，其中，一35S啟動(dòng)子被人為地與天然病毒來(lái)源(野生型)的HBsAg cDNA連接，圖1A顯示了相關(guān)的盒子。
35S-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS構(gòu)建pHB105(圖1A)包含了HBsAg編碼序列C末端Ile密碼子的一個(gè)缺失，以及編碼C末端延伸SEKDEL的一個(gè)插入(序列號(hào)4)。中間性克隆的構(gòu)建是通過(guò)三個(gè)片段的連接，包括pIBT201.1HBsC#10的XhoI到AccI片段，寡核苷(aSEKDELs-F5′ATACTCTGAGAAAGATGAGCTATGAGAGCT3′(序列號(hào)9)和aSEKDELs-R5′CTCATA GCTCATCTTTCTCAGAGT3′(序列號(hào)10))與pBluescript SK+的XhoI到SacI片段退火后得到的AccI到SacI片段。其產(chǎn)生的質(zhì)粒pBSSKHBsCK#3被亞克隆形成pHB105，如同前面在pHB103中所描述的將XhoI/SacI片段亞克隆入pIBT211.1，再將HindIII/EcoRI片段亞克隆入pBI101。35S-TEV-VSPαS-HB sAg-NOS的構(gòu)建pHB106(圖1A)包含一個(gè)編碼大豆VSP“αS”信號(hào)肽(Mason等1988)的插入，造成HBsAg編碼序列N末端延長(zhǎng)21個(gè)氨基酸，其編碼序列為CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATACC(序列號(hào)11)。pBSSKHBsC#6用NcoI消化，與來(lái)自pVSP-αSig-GUS的67bp的NcoI片段連接(DeWald，Ph.D.論文，德克薩斯州A&M大學(xué)生物化學(xué)與生物物理教研室1992)。產(chǎn)生的質(zhì)粒pSKHBsC-αS#90被亞克隆形成pHB106，如同前面在pHB103中所描述的將XhoI/SacI片段亞克隆入pIBT211.1，再將HindIII/EcoRI片段亞克隆入pBI101。35S-TEV-VSPαL-HBsAg-NOS的構(gòu)建pHB107(圖1A)包含一個(gè)編碼大豆VSP“αL”信號(hào)肽(Mason等1988)的插入，造成HBsAg編碼序列N末端延長(zhǎng)34個(gè)氨基酸，其編碼序列為CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATGCGTACGATATGTTCCCTCTCCGAATGAACACTGGCTATGGTGCC(序列號(hào)12)。pBSSKHBsC#6用NcoI消化，與來(lái)自pVSP-α前導(dǎo)-GUS(DeWald 1992)的106bp的NcoI片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pSKHBsCαl#L1被亞克隆形成pHB107，如同前面在pHB103中所描述的將XhoI/SacI片段亞克隆入pIBT211.1，再將HindIII/EcoRI片段亞克隆入pBI101。
35S-TEV-VSPαS-HBsAg-SEKDEL-NOS的構(gòu)建pHB108包含一個(gè)編碼大豆VSP“αS”信號(hào)肽(Mason等1988)的對(duì)pHB105的插入，造成HBsAg編碼序列N末端延長(zhǎng)21個(gè)氨基酸，其編碼序列為CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATACC(序列號(hào)13)。pBSSKHBsCK#3用NcoI消化，與來(lái)自pVSP-α-Sig-GUS(De Wald 1992)的67bp的NcoI片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pSKHBsCKS#23被亞克隆形成pHB108，如同前面在pHB103中所描述的將XhoI/SacI片段業(yè)克隆入pIBT211.1，再將HindIII/EcoRI片段亞克隆入pBI101。35S-TEV-VSPαL-HBsAg-SEKDEL-NOS的構(gòu)建pHB109包含一個(gè)編碼大豆VSP“αL”信號(hào)肽(Mason等1988)的對(duì)pHB105的插入，造成HBsAg編碼序列N末端延長(zhǎng)34個(gè)氨基酸，其編碼序列為CCATGGCAATGAAGGTCCTTGTTTTCTTCGTTGCTACAATTTTGGTAGCATGGCAATGCCATGCGTACGATATGTTCCCTCTCCGAATGAACACTGGCTATGGTGCC(序列號(hào)14)。pBSSKHBsCK#3用NcoI消化，與來(lái)自pVSP-α-Leader-GUS(De Wald 1992)的106bp的NcoI片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pSKHBsKalphaL#29被亞克隆形成pHB109，如同前面在pHB103中所描述的將XhoI/SacI片段亞克隆入pIBT211.1，再將HindIII/EcoRI片段亞克隆入pBI101。35S-TEV-TPSS-HBsAg-NOS的構(gòu)建pHB110(圖1A)包含一對(duì)pHB103的插入，該插入編碼來(lái)自豌豆rbcS N末端d中間肽和部分成熟肽(Nawrath等，“在高等植物中的多羥丁酸產(chǎn)物的酶的質(zhì)粒靶位”“生物降解的塑料和多聚物”Doi Y，F(xiàn)ukuda K，Elsevier，Amsterdam，pp.136-149(1994))，造成HBsAg編碼序列N末端延長(zhǎng)82個(gè)氨基酸，其編碼序列為CCATGGCTTCTATGATATCTTCTTCCGCTGTGACAACAGTCAGCCGTGCCTCTAGGGGGCAATCCGCCGCAATGGCTCCATTCGGCGGCCTCAAATCCATGACTGGATTCCCAGTGAAGAAGGTCAACACTTGACATTACTTCCATTACAAGCAATGGTGGAAGAGTAAAGTGCATGCAGGTGTGGCCTCCAATTGGAAAGAAGAAGTTTGAGACTCTTTCCTATTTGCCACCATTGACCAGAGATTCCATGG(序列號(hào)15)。
PUC-TPSS(Nawrath等1994)加入引物5′TPSS(5′GGATCCATGGCTTCTATGATATCTT-3′序列號(hào)16)與3′TPSS(5′GGATCC ATGGAATCTCTGGTCAATGGTGG-3′序列號(hào)17)，行PCR擴(kuò)增，用于在rbscS序列的兩端加入NcoI位點(diǎn)。pBSSKHBsC#6用NcoI消化后，與含TPSS編碼區(qū)域的經(jīng)NcoI消化的PCR產(chǎn)物連接，產(chǎn)生的質(zhì)粒pHB211.1TPSS#23被亞克隆形成pHB110，如同前面在pHB103中所描述的那樣將XhoI/SacI片段亞克隆入pIBT211.1，再將HindIII/EcoRI片段亞克隆入pGPTV-Kan(Becker等1992)。例4.不同的終止序列影響蛋白的聚集例3中討論的構(gòu)建包含煙草蝕刻病毒(TEV)非翻譯引導(dǎo)序列和nos 3′末端。載體pHB104(圖1A)和pHB114(圖1A)分別含有vsp和pin23′終止端而不是nos 3′末端。這些載體的每個(gè)mRNA聚集的蛋白質(zhì)水平比HB103高。通過(guò)將pIBT210.1HBsC#10的SacI到EcoRI片段亞克隆入pHB103，使Nos終止子被VSP終止子替代，從而獲得pHB104。圖1顯示了其表達(dá)盒子。
pHB114包含400bp的土豆pin2終止子(An等，1989)。用BamHI和EcoRI消化pDP687(Pioneer Hi-Bred International，Johnsoncity，IA)，400bp的pin2終止子被亞克隆入pBluescriptKS，形成的pBlueKS-pin2用SacI和EcoRI消化獲得pin2終止子片段，將其與pHB103連接SacI和EcoRI消化，形成pHB114。例5用煙草鑲嵌病毒Ω(TMV)引導(dǎo)區(qū)構(gòu)建pHB111(圖1A)包含有煙草鑲嵌病毒Ω非編碼區(qū)(Gallie等1992)而不是煙草侵蝕病毒的非編碼區(qū)。來(lái)自質(zhì)粒pBSG660(BiosourceTechnologies，Inc，Vacaville，CA)的，一個(gè)包含35S啟動(dòng)子3′末端和Ω非編碼區(qū)的EcoRV/XhoI片段，被亞克隆入pIBT211.1HBsC#9的EcoI/XolI位點(diǎn)，產(chǎn)生中間性質(zhì)粒pHB211Ω-5′。為了刪除煙草侵蝕病毒(TEV)引導(dǎo)序列，將pHB211Ω-5′用XhoI和NcoI消化，然后用綠豆核酶鈍化殘端，形成的質(zhì)粒pHB211用HindIII到EcoI片段消化，其表達(dá)盒子被克隆入pGPTVKAN(Becker等，1992)以產(chǎn)生pHB111。例6.替代的啟動(dòng)子序列來(lái)自菜花花葉病毒的35S啟動(dòng)子，是一種幾乎在所有植物組織中均表達(dá)的強(qiáng)的基本啟動(dòng)子。其他試驗(yàn)的啟動(dòng)子有patatin啟動(dòng)子，一種土豆中主要的儲(chǔ)存蛋白，以及顆粒限制性淀粉合酶(GBSS)啟動(dòng)子。兩種啟動(dòng)子在塊莖中引起強(qiáng)烈的表達(dá)。這些結(jié)構(gòu)被確定為HB145和HB165(圖1A)，顯示在圖1中。由于葉組織不能用這些結(jié)構(gòu)分析，所以必須引入微小塊莖來(lái)檢測(cè)表達(dá)水平。A.Patatin-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS構(gòu)建pHB145在pHB105的CaMV35S啟動(dòng)子的位置含有土豆塊莖特異的patatin基因啟動(dòng)子。將來(lái)自pPS20-GUS(Wenzler等Plant Mol Biol1241-50，1989)的HindIII/BamHI patatin片段亞克隆入pIBT210.1的HindIII/XhoI位點(diǎn)，得到pIBT210.1。來(lái)自pBSSKHBsCK#3的NcoI/SacI片段與用NcoI和SacI消化的pIBT240.1連接，形成的質(zhì)粒其HindIII到EcoRI片段亞克隆入pBI101得到pHB145。B.GBSS-TEV-HBsAg-SEKDEL-NOS構(gòu)建pHB165在pHB105的CaMV 35S啟動(dòng)子的位置含有土豆塊莖特異的顆粒限制性淀粉合酶(GBSS)基因啟動(dòng)子(Visser等，Plant Mol.Biol.，17691-699(1991))。pPGB1(Visser等1991)用SalI和SacI消化并與pBSSKHBsCK#3的XhoI到SacI片段得到pHB165。C.Pin2-TEVΩ-HBsAg-pin2構(gòu)建pHB131包含天然的HBsAg編碼序列，與煙草鑲嵌病毒(TMV)Ω5′非編碼區(qū)域融合的土豆pin2啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)該序列，由土豆pin23′元素使其終止。Pin2啟動(dòng)子可由創(chuàng)傷誘導(dǎo)，可能使塊莖中的HBsAg有控制地表達(dá)。其構(gòu)建包括一個(gè)中間步驟以便在SacI-EcoR1片段上獲得pin2-3′元素，pRT38的SacI-PstI片段被亞克隆入pBluescriptKS形成pKS-RT38。Pin2啟動(dòng)子(Palm等proc.Natl.Acad Sci USA 87603-607，1990)來(lái)自pRT24(Robert Thornburg，愛(ài)荷華州立大學(xué)生物化學(xué)和生物物理系，Ames，IA 50011)，pRT24(1kb)的HindIII-BamHI片段和pkS-ΩHB/BamHI-SacI(750bp)片段，與用HindIII/SacI消化的pUC-V(含有大豆vspB終止子)相連得到pHB231，然后得到來(lái)自pSK-RT38的含有pin2-3′終止子的SacI-EcoRI片段(Robert Thornburg，愛(ài)荷華州立大學(xué)生物化學(xué)和生物物理系，Ames，IA 50011)，并與含有pin2-TMVΩ啟動(dòng)子引導(dǎo)元素的pHB231/HindIII-NcoI、含有HBsAg編碼序列的pHB103/NcoI-SacI片段以及pGPTV-Kan/HindIII-EcoRI相連接，得到pHB131，D.Patatin-TMVΩ-HBsAg-vspB構(gòu)建pHB140.3含有天然的HBsAg編碼序列，與煙草鑲嵌病毒(TMV)Ω5′非編碼區(qū)域融合的土豆塊莖特異的patatin基因啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)該序列，由大豆vspB3′元素使其終止。用誘突變引物“Omega-Bam”(5′-GATCGGATCCTTACAACAATTACCAAC-3′序列號(hào)18)。使用pHB211作為煙草鑲嵌病毒(TMV)Ω5′非編碼區(qū)域的源，使用誘突變引物“Omega-Barn”和下流引物，“NOS”(5′-CGGCAACAGGATTCAATC-3′序列號(hào)19)，約800bp的PCR片段被克隆入帶T尾的pBluescriptKS形成pKS-ΩHB。pPS20/HindIII-BamH1片段(2.35kb patatin啟動(dòng)子)與pKS-ΩHB/BamHI-SacI(750bp)、pUC19/HindIII-SacI(2.7kb)連接，形成pPS-ΩHB。最后，含大豆vspB終止子的pUC-V/SacI-EcoR1片段被接入pPS-ΩHB形成pHB240.3，它包含與煙草鑲嵌病毒(TMV)Ω5′非編碼區(qū)域融合的patatin啟動(dòng)子，由大豆vspB3′元素使其終止。用HindIII和EcoRI消化pHB240.3可以得到表達(dá)盒子，接入pGPTV-Kan得到pHB140.3。例7.HBsAg的植物優(yōu)選化密碼子在植物和動(dòng)物中，密碼子的使用是有差別的，DNA序列中的許多信號(hào)并不保守(Ausubel，F(xiàn).等，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，vol 3，pp.A.1C.3)。例如，一種合成酶基因的表達(dá)在植物中要比在天然細(xì)菌性序列中要增加10-20倍。
對(duì)天然HBsAg基因的分析顯示，9.7％的密碼子在單子葉中是不利的，8.8％的密碼子在雙子葉中是不利的(例如土豆)，尤其是在29CnG三聚體和16CG二聚體基因的開始部分附近有一個(gè)RNAPolII終止序列，這些信號(hào)將影響轉(zhuǎn)錄的延伸和穩(wěn)定性，從而降低HBsAg蛋白。因此，可以在保留相同或相似的天然氨基酸的同時(shí)改變不適宜的密碼子、不需要的信號(hào)序列、切割位點(diǎn)和甲基化位點(diǎn)。對(duì)于HBsAg，可以改變681個(gè)堿基中的160個(gè)堿基，而保留蛋白的天然氨基酸順序，參見序列3(圖22)和序列5(圖5)。其AT成分占52.42％，不利的信號(hào)被改變了。載體被提供了上述的VSP3′終止信號(hào)，其中一個(gè)載體被提供了一個(gè)αL信號(hào)肽。這些載體是經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的HB115-HB117.(圖1A和21)A.35S-TEV-sHBsAg-VSP構(gòu)建pHB115(圖1A和21)包含一個(gè)編碼HBsAg蛋白的植物優(yōu)化合成序列。為了使用密碼子，并發(fā)現(xiàn)有潛在問(wèn)題的序列，對(duì)天然的HBsAg序列進(jìn)行瀏覽，包括假的mRNA加工信號(hào)，如多聚核苷酸序列、剪切位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、“ATTTA”等不穩(wěn)定mRNA序列(Ohme-Takagi等，Proc.Nacl.Acad.Sci.USA 9011811-11815 1993)、“DST”序列(Newman等，Plant Cell 5701-714，1993)以及胞嘧啶甲基化圖形“CCGG”。
利用植物優(yōu)選的密碼子和缺乏潛在問(wèn)題的序列設(shè)計(jì)植物優(yōu)化基因，然后采用Stemmer等1992描述的方法從重疊寡核苷中聚集該基因，最終產(chǎn)物用NcoI和SacI消化，克隆入pGem5Zf+?？寺?7和#3各有一個(gè)錯(cuò)誤，所以將#7的5′與#3的3′結(jié)合，從#7中分離出HincII/SacI片段，從#3中分離出NcoI/BbsI片段，將這些片段用BfaI切割，與用NcoI和SacI切割的pGEM5Zf+載體連接，形成的克隆#8進(jìn)行測(cè)序，命名為psHB312，并在NcoI和SacI位點(diǎn)被亞克隆入pIBT210.1(微小#1 8)，然后在HindIII和EcoRI位點(diǎn)再亞克隆入pGPTV-Kan形成pHB115。后來(lái)發(fā)現(xiàn)這個(gè)克隆的HB編碼區(qū)域含有一個(gè)核苷錯(cuò)誤(nt595位置不是“T”而是“G”，這導(dǎo)致單個(gè)氨基酸的替代，即色氨酸替代了甘氨酸)，這促使了改正的pHB117的產(chǎn)生(見下)。
pHB117(圖6和圖21)對(duì)HBsAg基因的核苷錯(cuò)誤進(jìn)行修正，這與pHB115是一樣的。通過(guò)定點(diǎn)突變，psHB312中的錯(cuò)誤核苷(595位的“G”)被修正為“T”(Axia Genetics plc，英國(guó)劍橋)，被命名為pHBV10。NcoI到SacI片段被亞克隆入pIBT210.1，形成pIBT210.1HBV，然后HindIII/EcoRI片段被亞克隆入pGPTV-Kan產(chǎn)生pHB117。B.35S-TEV-VSPαL-sHBsAg-VSP構(gòu)建pHB116(圖1A和21)含有大豆VSP“αL”序列，該序列被插入pHB115的HBsAg合成基因的5′端。來(lái)自pSKHBsC-αL#29的NcoI片段與NcoI和SacI消化的psHB312以及載體pIBT210.1的NcoI到SacI片段連接(微小#4αL)，然后在HindIII和EcoRI位點(diǎn)亞克隆入pGPTV-Kan(Becker，D等1992)。C.35S-TEV-αS-sHBsAg-VSP構(gòu)建pHB118(圖7和21)含有大豆“αS”序列，該序列被插入pHB117的HBsAg合成基因的5′端。含有來(lái)自pIBT210.1HBsCKaS(pHB308)的“αS”序列的NcoI片段與psHB317連接形成psHB318，然后HindIII到EcoRI片段與pGPTV-Kan連接形成pHB118。D.35S-TEV-αL-sHBsAg-VSP構(gòu)建
pHB119(圖8和21)含有大豆“αL”序列，該序列被插入pHB117的HBsAg合成基因的5′端。含有來(lái)自pIBT210.1HBsCKaL(pHB309)的“αL”序列的NcoI片段與psHB317連接形成psHB319，然后HindIII到EcoRI片段與pGPTV-Kan連接形成pHB119。E.E8-sHBsAg-pin2構(gòu)建pHB120(圖9和21)含有E8啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子通過(guò)pin23′末端與sHBsAg連接。含有psHBV10的sHBsAg基因的NcoI到SacI片段與經(jīng)EcoRI和SacI消化的pBluescript II SK+和EcoRI到NcoI E8啟動(dòng)子，形成psHB520。來(lái)自psHB520的HindIII到SacI片段與含有pin2終止子的經(jīng)HindIII和SacI消化的HB131連接，形成pHB120。F.35S-TEV-sHBsAg-SEKDEL-pin2pHB121(圖10和21)含有內(nèi)質(zhì)保留信號(hào)，該信號(hào)插入在sHBsAg基因的3′端。將寡核苷5′ATCTCTGAGAAGGATGAGCTTTAA3′(序列號(hào)20)和3′GACTCTTCCTACTCGAAATTTAGA 5′(序列號(hào)21)與BbsI消化的psHBV10雜交，并連接產(chǎn)生psHB521。來(lái)自psHB521的NcoI到SacI片段與來(lái)自HB131的HindIII到SacI片段(包括含pin2終止子的pGPTV-Kan載體)以及來(lái)自含35S啟動(dòng)子的pIBT210.1的HindIII到NcoI片段連接，形成pHB121。G.35S-TEV-αS-sHBsAg-SEKDEL-pin2pHB122(圖11和21)將sHBsAg上的αS信號(hào)與KDEL(序列號(hào)22)信號(hào)結(jié)合，來(lái)自pHB121的BstXI片段含有帶SEKDEL(序列號(hào)4)和pin2終止子的sHBsAg3′末端，將它接入pHB118代替sHBsAg基因的3′端和vsp終止子，形成pHB122。H.35S-TEV-αL-sHBsAg-SEKDEL-pin2pHB123(圖12和21)將sHBsAg上的αL信號(hào)與KDEL(序列號(hào)22)信號(hào)結(jié)合，來(lái)自pHB121的BstXI片段含有帶SEKDEL(序列號(hào)4)和pin2終止子的sHBsAg3′末端，將它接入pHB119代替sHBsAg基因的3′端和vsp終止子，形成pHB123。例8.土豆植株的轉(zhuǎn)化通過(guò)無(wú)污染的葉盤的共同培養(yǎng)使土豆獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化(SolanumtuBerosum″Frito-Lay 1607″)。Haq，T.等(1995)；Wenzler，H等(1989)。其總結(jié)步驟如下切割外植體，將離軸的一面朝上放在LCI盤上三到四天，將外植體放置于土壤稀釋液中十分鐘(用手晃動(dòng))，然后在消毒紙巾上進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移，將外植體離軸的一面反向朝上放在LCI盤上三到四天，經(jīng)共同培養(yǎng)后，將外植體放在含有卡那霉素和羧卞青霉素的LClCK盤上五到七天，直到產(chǎn)生硬結(jié)，將已產(chǎn)生良好硬結(jié)的外植體放在LC2CK盒內(nèi)二周，二周后將外植體放在新鮮的LC2CK介質(zhì)上使根形成，在em介質(zhì)中加入羧卞青霉素以防止細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)。
生長(zhǎng)土壤桿菌-LB干系在有卡那霉素存在的情況下對(duì)一克隆進(jìn)行一夜的培養(yǎng)；YM干系在卡那霉素存在的情況下對(duì)一個(gè)克隆進(jìn)行36到48小時(shí)的培養(yǎng)。
由于位點(diǎn)的插入隨機(jī)性，在獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件中存在一些表達(dá)的變異是意料之中的事，因此，可以通過(guò)編碼區(qū)域特異的探針進(jìn)行Northern雜交來(lái)篩查獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因系。當(dāng)使用35S啟動(dòng)子的時(shí)候，篩查的是來(lái)自葉片的所有的RNA；當(dāng)使用patatin啟動(dòng)子的時(shí)候，得到在無(wú)污染培養(yǎng)物中產(chǎn)生的微小塊莖的RNA。篩查patatin啟動(dòng)子的構(gòu)造是從微小塊莖開始的，微小塊莖是從新生的轉(zhuǎn)化芽中切下的莖干節(jié)點(diǎn)在含高濃度蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行亞培養(yǎng)形成的。把最有希望的轉(zhuǎn)化系通過(guò)節(jié)點(diǎn)的無(wú)污染培養(yǎng)進(jìn)行繁殖，生根的小植株被轉(zhuǎn)種到土壤中，在溫室中成長(zhǎng)。
為了得到塊莖，植株生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)二個(gè)階段其一，在頭一個(gè)半月到二個(gè)月內(nèi)，或在足夠的植物生長(zhǎng)發(fā)生之前，采用長(zhǎng)光照(16小時(shí))，如果在冬季則用燈光補(bǔ)充照射，其二，在此后的一個(gè)半月到二個(gè)月，采用短光照(12小時(shí))。經(jīng)過(guò)這樣三到四個(gè)月的培育方案，每個(gè)三加侖的罐中可以得到六百到八百克的塊莖。第一次收獲得到的塊莖在經(jīng)過(guò)一個(gè)月的休眠期后可以用來(lái)啟動(dòng)新的植株。例9.植物細(xì)胞HBsAg的聚集增加通過(guò)改善植物表達(dá)載體，增加外來(lái)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，可以增加植物細(xì)胞中HBsAg的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)錄、mRNA合成和聚集、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化后合成與聚集可以受表達(dá)載體成分的影響。早期的研究證實(shí)，存在一個(gè)臨界的細(xì)胞閾值濃度，在該濃度下，由HBsAg亞單位組成的VLPs的聚集加速，VLPs比未聚集的亞單位更穩(wěn)定；當(dāng)HBsAg mRNA(通過(guò)Northern雜交信號(hào)密度測(cè)定)與rHBsAg蛋白(通過(guò)ELISA測(cè)定)進(jìn)行印跡雜交時(shí)，它與結(jié)構(gòu)HB103和HB107成線形關(guān)系。這一結(jié)果的可能解釋是如果HBsAg能有效的指向ER，那么它對(duì)植物胞漿蛋白酶就會(huì)更穩(wěn)定或更有抵抗力。例10轉(zhuǎn)化的土豆植株在暖房的罐里栽培，表達(dá)HBsAg的轉(zhuǎn)基因植株盡管產(chǎn)生塊莖，但表現(xiàn)出生長(zhǎng)習(xí)慣的改變，并將限制植物中表達(dá)抗原的絕對(duì)水平。表2顯示了圖1中轉(zhuǎn)化不同結(jié)構(gòu)的土豆葉組織和塊莖組織HBsAg蛋白分析的結(jié)果，每一個(gè)結(jié)構(gòu)的HBsAg水平用相對(duì)于表達(dá)最高的轉(zhuǎn)化個(gè)體的總可溶性蛋白的百分比表示。轉(zhuǎn)化pHB114的系中HBsAg的表達(dá)水平有相當(dāng)大的變異，每個(gè)塊莖從0.2到16ug不等。HBsAg蛋白形成微粒，并可能被糖基化，抗原上出現(xiàn)三個(gè)潛在的N糖基化序列，同時(shí)有許多O連接糖基化的可能位點(diǎn)。認(rèn)為在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)僅有一個(gè)N連接的位點(diǎn)被糖基化，而且只能達(dá)到40-50％。早期對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的研究數(shù)據(jù)表明，植物可以將HBsAg裝配入病毒樣微粒(VLPs)，后者與來(lái)自重組酵母和感染個(gè)體的樹液的VLPs體積相似(雖然其體積大小有差異性)。盡管認(rèn)為皮下層的蛋白水平最高，但塊莖中抗原的具體位置并不清楚。在提取緩沖液中加入β巰基乙醇可以增加純化或提取HBsAg的量。
表2最佳個(gè)體中HBsAg的表達(dá)結(jié)構(gòu)mRNA/蛋白的斜率 葉組織(％) 塊莖組織(ug/g)HB102 0.0010.016 0.18HB103 0.0010.023 0.33HB105 0.0040.048 1.25HB106 0.0040.035 0.8HB107 0.0050.11 2.4HB110 ND 0 NDHB104 0.0040.19 6.5HB114 0.0050.22 16HB145 ND 0.063 1.1
HB165ND0.021 --HB111ND0.041 0.33HB115ND0.132HB116ND0.176 2例11.轉(zhuǎn)基因土豆系HB114-16的塊莖特點(diǎn)這個(gè)例子描述的試驗(yàn)表現(xiàn)了土豆“FL1607”系HB114-16塊莖產(chǎn)生的重組HBsAg的特性，HB114-16是從pHB114轉(zhuǎn)化來(lái)的。這些數(shù)據(jù)表明，這些塊莖產(chǎn)生的HBsAg的結(jié)構(gòu)是一種有希望的免疫疫苗蛋白，可以比得上用于商業(yè)疫苗的酵母重組HBsAg。特別是，組裝的HBsAg病毒樣微粒(VLP)的形式比未經(jīng)組裝的亞單位更加穩(wěn)定，免疫原性更強(qiáng)，被認(rèn)為是疫苗抗原至關(guān)重要的特性。
通過(guò)蔗糖梯度沉降了解病毒樣顆粒的成分。為了了解HBsAg的沉降是否與煙草表達(dá)中描述的病毒樣顆粒一樣，我們通過(guò)蔗糖梯度沉降，檢測(cè)了HB114-16塊莖和非轉(zhuǎn)基因塊莖對(duì)照的提取物(Mason等1992)。將塊莖在液氮攪拌器中磨成粉末，得到塊莖的粗提物，然后加入兩倍重量的1X PBS(pH7.2)，0.1％Triton X-100，10mM EDTA，將混有冷凍粉末的緩沖液冷凍，然后在冰上緩慢解凍，再次懸浮的提取物在4℃14000xg轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，0.5毫升的表層懸浮物分層在線形蔗糖梯度的5-30％之上(10mM磷酸鹽，pH7.0，0.15M NaCl)，為了比較，同時(shí)對(duì)含2μg純化酵母衍生的重組HBsAg(rHBsAg)微粒(1XPBS(pH7.2)，0.1％Triton X-100，10Mm EDTA，含或不含F(xiàn)L1607土豆提取物)進(jìn)行了試驗(yàn)，在Beckman SW41離心儀中4℃33000rpm轉(zhuǎn)速下梯度離心5小時(shí)，在梯度片段進(jìn)行HBsAg的ELISA(Auszyme單克隆，Abbott試驗(yàn)室)，ELISA的吸光度對(duì)％蔗糖作圖。圖13顯示，所有的HBsAg樣本的高峰都分布在約8％到22％蔗糖的范圍內(nèi)。塊莖物質(zhì)整體向高密度區(qū)輕微移動(dòng)，但在所有的樣本中HBsAg沉積物最多是位于10％到15％之間。加入非轉(zhuǎn)基因FL1607塊莖的酵母rHBsAg顯示出和純化酵母rHBsAg相似的面貌，但ELISA信號(hào)要弱一些。非轉(zhuǎn)基因FL1607塊莖在梯度中沒(méi)有顯示ELISA信號(hào)。這些數(shù)據(jù)表明，塊莖來(lái)源的HBsAg與酵母來(lái)源的HBsAg共同沉降，提示塊莖來(lái)源的HBsAg象病毒樣顆粒那樣聚集。
Western印跡雜交為了觀察與抗體發(fā)生反應(yīng)的HB114-16塊莖中的HBsAg多肽，我們進(jìn)行了Western印跡雜交實(shí)驗(yàn)。樣品在減弱的SDS-PAGE樣品緩沖液(100mM DTT，2％SDS)中煮沸5分鐘進(jìn)行降解，經(jīng)過(guò)電泳，在PVDF膜上印跡并用抗HBsAg兔多克隆抗血清標(biāo)記探針，圖14顯示了Western雜交實(shí)驗(yàn)以及同時(shí)行庫(kù)馬西染色的雙重凝膠電泳。染色的凝膠表明，無(wú)論是HB114-16(laneHB)還是非轉(zhuǎn)基因FL1607(lan-)樣品，上面裝載的塊莖總蛋白的數(shù)量相似。在Western印跡雜交中，10ng酵母來(lái)源的rHBsAg(lan+)產(chǎn)生預(yù)料中的一個(gè)約25kDa的單體以及在Mr產(chǎn)生一個(gè)約40kDa的二聚體(在帶的左側(cè)用Y標(biāo)記)。塊莖來(lái)源的物質(zhì)(laneHB)包含一個(gè)約28kDa的單體以及一個(gè)可能代表二聚體的寬帶(在帶的左側(cè)用P標(biāo)記)。塊莖來(lái)源的單體可能是糖基化的，因此體積比酵母來(lái)源的單體大。非轉(zhuǎn)基因塊莖(lane-)中有一些微弱的非特異條帶，但與單體和二聚體的區(qū)域并無(wú)重疊反應(yīng)。有趣的是，二聚體與單體的相對(duì)比例在塊莖物質(zhì)中要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酵母rHBsAg。盡管這個(gè)分析是在減弱的條件下進(jìn)行的，塊莖物質(zhì)中二聚體的高比例表明，它于硫酸氫鹽的交叉連接更高更穩(wěn)定，因此潛在地對(duì)降解更耐受，尤其是口服時(shí)。
對(duì)從土豆系HB114-16塊莖制備的總RNA進(jìn)行Northern印跡雜交實(shí)驗(yàn)，如Mason所述(Mason等1996)。作為陰性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因土豆系FL1607塊莖的RNA同時(shí)檢測(cè)。每個(gè)樣品取5ug在MOPS/醋酸/EDTA緩沖液中用甲醛在65℃下變性十五分鐘，在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，通過(guò)毛細(xì)印跡轉(zhuǎn)移到Zeta探針膜上(BioRad)，將膜在Stratalinker(Stratagene)上用紫外線固定，然后用亞甲基藍(lán)染色以證實(shí)RNA的完整性和負(fù)荷密度。通過(guò)隨機(jī)性接觸抗原標(biāo)記用NcoI和SacI消化pHB114得到的700bpDNA片段(包括HBsAg編碼序列)，完成探針的準(zhǔn)備，在65℃，0.25M磷酸鹽，pH7.2，7％SDS，1mM EDTA條件下將印跡與探針雜交16小時(shí)，膜用清洗緩沖液1(40mM磷酸鹽，ph7.2，1mM EDTA，5％SDS)清洗兩遍，每次在65℃下各三十分鐘，然后將膜用塑料包埋，用磷酸鹽圖象儀(Molecular Dynamics)對(duì)其進(jìn)行量化。
圖15顯示了得到的結(jié)果。含有相同數(shù)量的每種RNA樣品走雙重條帶；印跡雜交后一組條帶是經(jīng)亞甲基藍(lán)染色的。右側(cè)的照片顯示一半膠的亞甲基藍(lán)染色印跡，它表示來(lái)自葉組織樣品的總RNA要高于來(lái)自塊莖樣品的總的RNA。通過(guò)核糖體RNA條帶的完整性判斷RNA的質(zhì)量的好的。左側(cè)的照片顯示獲得的雜交類型，HB114-16RNA在約1kb處有一條主要條帶，在塊莖和葉組織中都如此，代表了HBsAg的全程轉(zhuǎn)錄，1kb條帶下面的斑點(diǎn)代表降解的RNA，葉組織RNA樣品中大約在3kb位置的微弱條帶可能代表了有一個(gè)異常插入造成的HBsAg單位的轉(zhuǎn)錄通讀，非轉(zhuǎn)基因FL1607塊莖和葉組織RNA均沒(méi)有顯示雜交信號(hào)。
對(duì)從HB114-16葉組織分離的基因組DNA進(jìn)行PCR分析。圖16顯示了通過(guò)引物TEV(5’-GCA TTCTACTTCTATTGCAGC序列號(hào)23)和PIN2獲得的一條主要的單帶，兩種引物分別是HBsAg基因的5′和3′側(cè)區(qū)。這條條帶的面積與從質(zhì)粒pHB114擴(kuò)增的條帶相同，在對(duì)照組FL1607基因組DNA中則看不到這條條帶。從膠上切下PCR片段，測(cè)序，以證實(shí)從pHB114序列沒(méi)有突變，序列是完全一致的。這表明轉(zhuǎn)移HB114-16系的HBsAg基因沒(méi)有發(fā)生突變或改變。
用與PCR分析中同樣的基因組DNA樣品進(jìn)行Southern印跡雜交。每種DNA樣品取15μg，10ng pHB114載體在0.8％瓊脂糖凝膠分餾前用各種限制性內(nèi)切酶消化或不消化，用鹽酸處理進(jìn)行去純化，中和，通過(guò)毛細(xì)印跡法轉(zhuǎn)移到Zeta探針膜上(BioRad)，將膜在Stratalinker(Stratagene)上用紫外線固定。通過(guò)隨機(jī)性接觸抗原標(biāo)記HindIII和SacI消化pHB203得到的2kbDNA片段(包括S35啟動(dòng)子、TEV 5-URT和HBsAg編碼序列)，完成探針的準(zhǔn)備，在65℃0.25M磷酸鹽，ph7.2，7％SDS，1mM EDTA的條件下將印跡與探針雜交16小時(shí)，膜用清洗緩沖液1(40mM磷酸鹽，ph7.2，1mM EDTA，5％SDS)清洗兩遍，每次在65℃下各三十分鐘，然后將膜用塑料包埋，用磷酸鹽圖象儀(Molecular Dynamics)對(duì)其進(jìn)行量化。圖17顯示了雜交后形成的類型、凝膠在轉(zhuǎn)移到Zata探針前的溴化二氨乙苯啡啶染色、T-DNA盒子的圖譜和作為探針的DNA部分。NcoI和HindIII消化形成二個(gè)片段，一是在T-DNA內(nèi)側(cè)，和探針(INT)雜交，另一個(gè)片段在T-DNA的插入位點(diǎn)延伸。在用NcoI或HincII消化的HB114-16系，除了內(nèi)帶外至少可以數(shù)出四條帶(見條帶Nco右側(cè)的數(shù)字和條帶HincII左側(cè)的數(shù)字)。對(duì)這些數(shù)據(jù)最可能的解釋是；至少有四個(gè)T-DNA拷貝含有HBsAg表達(dá)盒，該表達(dá)盒整合在HB114-16細(xì)胞核基因組DNA的不同位點(diǎn)(見條帶上的數(shù)字)。含有FL1067DNA的條帶和探針不雜交。EcoRI消化表現(xiàn)出意外的結(jié)果，可能是由于存在部分消化或星活性，從而被忽略。保存九個(gè)月的塊莖的HBsAg的穩(wěn)定性。一些HB114-16塊莖系是在1998年5月收獲的，每一個(gè)株系用紙包分別包裹并儲(chǔ)藏在4℃的環(huán)境中。自11個(gè)株系各取出一個(gè)塊莖，在二周的收獲時(shí)間內(nèi)用ELISA法分析HBsAg(Auszyme單克隆，Abbott試驗(yàn)室)。九個(gè)月后，分析同樣11個(gè)株系的二個(gè)塊莖。圖18的柱形圖顯示黑色柱表示的是1998年5月測(cè)定的HBsAg的量，白色柱顯示的是1999年2月的量，塊莖在經(jīng)過(guò)九個(gè)月的老化之后，相同新鮮重量的塊莖明顯產(chǎn)生更多的HBsAg。其可能的原因是，塊莖的部分脫水使它在儲(chǔ)存后重量較剛剛收獲時(shí)低；另一種解釋是，剛收獲時(shí)一些HBsAg是不適當(dāng)折疊的單體亞單位，在儲(chǔ)存過(guò)程種，這些單體正確折疊，并聚集形成病毒樣微粒，從而使更多的HBsAg被檢測(cè)出來(lái)；最后，在儲(chǔ)存過(guò)程中可能發(fā)生單體的進(jìn)一步合成，它們進(jìn)一步聚集形成ELISA能檢測(cè)的形式。(已知，土豆塊莖細(xì)胞在4℃是有生理性活動(dòng)，淀粉和糖的變化以及最終發(fā)芽證實(shí)了這一點(diǎn))。這些數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)基因塊莖產(chǎn)生的HBsAg在4℃儲(chǔ)存條件下至少九個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。例12.煙草細(xì)胞中經(jīng)修飾的HBsAg的表達(dá)和脫硫交叉連接的分析這個(gè)例子描述了轉(zhuǎn)基因煙草NT1細(xì)胞對(duì)合成型植物優(yōu)化HBsAg基因的穩(wěn)定表達(dá)，該基因在亞細(xì)胞靶位通過(guò)不同方法被修飾。這些研究顯示某些修飾使單體通過(guò)雙硫橋交叉連接的程度顯著增強(qiáng)，由于HBsAg交叉連接增多，其潛在的免疫原性更穩(wěn)定，交叉連接的增強(qiáng)可以形成更好的疫苗抗原。另外，由于酵母來(lái)源的重組HBsAg(rHBsAg)只有在提取出來(lái)并用化學(xué)制劑促進(jìn)雙硫橋形成后才有高度的交叉連接(Wampler D.，Lehman E.，Boger，J.，McAleer，W.&Scolnick，Multiplechemical forms of the hepatitis B surface antigen produced in yeast.ProcNat Acad of Sci，USA 1985；82，6830-6834)，當(dāng)口服時(shí)，不經(jīng)過(guò)純化和/或化學(xué)處理的植物來(lái)源的HBsAg代表了一種潛在免疫原性更強(qiáng)的物質(zhì)。
我們用質(zhì)粒pHB117，pHB118，pHB119，pHB121，pHB122和pHB123通過(guò)土壤桿菌介導(dǎo)的DNA傳輸創(chuàng)造了轉(zhuǎn)基因煙草NT1細(xì)胞系。這些結(jié)構(gòu)在例7中有詳細(xì)的介紹，但我們還是在表3中簡(jiǎn)單描述了其修飾情況，它們都包含有例7中所描述的合成性植物優(yōu)化HBsAg基因，這兒的修飾是通過(guò)N末端或/和C末端的延伸。我們的基本原則提示N末端的植物信號(hào)肽將使ER更有效地指向新生的HBsAg肽，允許更有效的單體折疊和交叉連接的病毒樣微粒的聚集。αS信號(hào)肽包含二十一個(gè)氨基酸，αL信號(hào)肽含有來(lái)自同一個(gè)大豆vspA基因的一個(gè)額外的14殘基，該基因包含一個(gè)潛在的空泡定位信號(hào)(Mason等1988)。此外，C末端ER保留信號(hào)“SEKDEL”(序列號(hào)4)可以通過(guò)對(duì)內(nèi)膜內(nèi)容物的下降進(jìn)行補(bǔ)救從而在ER中聚集亞單位，粗經(jīng)單體更加有效的關(guān)聯(lián)和交叉連接。
表3本例中使用的質(zhì)粒名稱N-末端延伸 C末端延伸pHB117 無(wú) 無(wú)pHB118 vspAαS信號(hào)肽 無(wú)pHB119 vspAαL信號(hào)肽 無(wú)pHB121 無(wú) SEKDELpHB122 vspAαS信號(hào)肽 SEKDELpHB123 vspAαL信號(hào)肽 SEKDEL我們用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草NT1細(xì)胞(Newman TC，Ohme-TakagiM，Taylor CB，Green PJ.DST sequences，highly conserved among plantSAUR genes，target reporter transcripts for rapid decay in tobacco.PlantCell 1993；5701-714)。對(duì)選擇性地在300mg/L卡那霉素上生長(zhǎng)的細(xì)胞群落進(jìn)行HBsAg表達(dá)的分析。每克細(xì)胞用2毫升緩沖液(PBS，pH7.2，50mM抗壞血酸鹽，10mM EDTA，0.2mM PMSF，0.1％Triton-X-100)進(jìn)行提取，提取物在4℃16000xg轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心提純，對(duì)上層液用Bradford分析法進(jìn)行總的可溶性蛋白(TSB)檢測(cè)，并用Auszyme單克隆ELISA法檢測(cè)HBsAg(Abbott試驗(yàn)室)。不同系株間的表達(dá)差別很大，但每一結(jié)構(gòu)中表達(dá)最高的系進(jìn)一步進(jìn)行繁殖以做進(jìn)一步的研究。下面的表4顯示了一個(gè)代表實(shí)驗(yàn)的表達(dá)數(shù)據(jù)，此處，每個(gè)結(jié)構(gòu)中挑選的系得到了檢測(cè)，所有的系表達(dá)的可溶性蛋白水平相似，在HB117-9系，所有的修飾形式比未修飾者表達(dá)的HBsAg都高，在HB118-3系表達(dá)最高。我們?cè)诮忉屵@些數(shù)據(jù)時(shí)必須十分謹(jǐn)慎，因?yàn)槲覀儧](méi)有對(duì)RNA水平進(jìn)行定量，而這將有些不同。但是，在每一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，這些系在二十個(gè)隨機(jī)事件中被選擇作為最好的系，如此看來(lái)修飾形式至少和未修飾HBsAg表現(xiàn)的一樣好。
表4轉(zhuǎn)基因NT1細(xì)胞株的HBsAg和總蛋白水平細(xì)胞系 總可溶性蛋白(mg/ml) HBsAg(ng/mgTSP)HB117-9 4.78 67HB118-3 4.28 261HB119-5 3.88 121HB121-113.40 118HB122-8 4.80 133HB123-1 4.46 155NT1對(duì)照 3.12 0免疫沉淀法和交聯(lián)的分析在部分條件減弱的情況下，我們?cè)诿庖叱恋矸謱雍?，用Western印跡雜交法檢測(cè)了NT1細(xì)胞提取物的HBsAg多聚體形式，提取細(xì)胞，用前述方法檢測(cè)了TSP和HBsAg。含有1毫克的樣品用含1％Triton-x100，0.5％抗壞血酸鹽，0.1％SDS的PBS稀釋十倍，然后與1微克山羊抗HBsAg(Fitzgerald Industries，Concord，MA)混合，在23℃下孵育一小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)，然后與15微升的蛋白G Plus-瓊脂糖(Calbiochem)混合，在旋轉(zhuǎn)攪拌器中4℃下孵育16小時(shí)。根據(jù)供應(yīng)商的建議，瓊脂糖基質(zhì)在25微升含80mM DTT的1.5X SDS-PAGE樣品緩沖液中懸浮之前，先對(duì)其進(jìn)行pellet和清洗。酵母rHBsAg樣品用同樣的方法進(jìn)行免疫沉降。
在實(shí)驗(yàn)一，對(duì)來(lái)自HB117-9系、HB118-3系和HB121-11系的樣品進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PAGE樣品緩沖液中免疫沉淀后的樣品在50℃下加熱五分鐘(部分條件減弱)16000xg下離心兩分鐘，10微升懸浮物在4-20％的梯度微膠(BioRad)上負(fù)荷，剩下的物質(zhì)重新懸浮，在100℃下加熱20分鐘(嚴(yán)格降低條件)，16000xg下離心兩分鐘，10微升懸浮物在第二膠上負(fù)荷。樣品進(jìn)行電泳，電印跡在PVDF膜上，用于IP中同樣的山羊抗HBsAg血清標(biāo)記探針。圖19顯示了獲得的Weston印跡雜交。A道是暴露于部分條件降低(50℃五分鐘)下的樣品，B道是嚴(yán)格條件下的樣品(100℃20分鐘)。道1中的酵母rHBsAg顯示了在部分條件降低的情況下多聚體的梯度，它明顯沒(méi)有嚴(yán)格條件下的顯著。用IP純化的酵母rHBsAg(道2)可以見到相似的圖形，盡管恢復(fù)量沒(méi)有想象的大。注意到所有道均含有約50kDa的信號(hào)，代表了山羊IgG的重鏈，既可以用作IP鉤，又可以作為Weston印跡雜交的探針，并包含在對(duì)照組道7中，HBsAg二聚體和三聚體信號(hào)在該信號(hào)的兩邊，并與之截然分開。樣品HB117-9(未修飾的HBsAg)的HBsAg單體與酵母rHBsAg單體共同遷徙。在部分降低的條件下表現(xiàn)有二聚體和微弱的多聚體信號(hào)，這表明HBsAg在植物細(xì)胞表達(dá)中容易交叉連結(jié)成多聚體。甚至在嚴(yán)格條件下，樣品HB117-9也有一個(gè)強(qiáng)的二聚體信號(hào)。樣品HB117-9中有一對(duì)微弱的低Mr信號(hào)，而在酵母來(lái)源的物質(zhì)中則沒(méi)有，這提示存在一個(gè)單切割導(dǎo)致了兩個(gè)HBsAg片段。為了了解這種切割是在活細(xì)胞中發(fā)生還是提取物的結(jié)果，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。非轉(zhuǎn)基因NT1細(xì)胞樣品(道6)顯示了一個(gè)微弱的非特異信號(hào)，它在HBsAg單體和二聚體之間遷徙，并與兩條帶截然分開。
道4包含NT1細(xì)胞樣品HB118-3，其HBsAg的N末端有“αS”植物信號(hào)肽的延伸修飾。該樣品的單體信號(hào)遷徙位置較Mr略高，提示在這些NT1細(xì)胞中植物信號(hào)肽沒(méi)有被切割。最有意思的是，在條件部分降低的樣品HB118-3中二聚體信號(hào)比單體信號(hào)強(qiáng)，多聚體(可到十聚體)可以被區(qū)分，其上的污跡表明有更高的多聚體存在，甚至在嚴(yán)格條件下，也容易辨認(rèn)出三聚體和四聚體信號(hào)，表明單體間的雙硫交叉連接非常穩(wěn)定，可以耐受HB118-3細(xì)胞的減少。與HB117-9樣品一樣，兩個(gè)微弱的Mr下信號(hào)提示有部分蛋白溶解性裂解。
實(shí)驗(yàn)1中的道5含有來(lái)自NT1細(xì)胞株HB 121-11的樣品，其HBsAg C末端“SEKDEL”的延伸修飾(序列號(hào)4)。部分降低條件的樣品顯示了一個(gè)遷徙位置較Mr略高的單體，這與C末端的延伸修飾是一致的。此外，多聚體直至十聚體很容易被觀察到，表明其交叉連接的程度比HB117-3細(xì)胞明顯增加。嚴(yán)格條件下使大多數(shù)多聚體成為單體，但仍然存在強(qiáng)的二聚體信號(hào)。象HB117和HB118株一樣，兩個(gè)微弱的Mr下信號(hào)提示HB121樣品有部分蛋白溶解性裂解。
實(shí)驗(yàn)2中，檢測(cè)了來(lái)自所有六個(gè)轉(zhuǎn)基因株的樣品。在這種情況下，在部分降低條件(50℃，5分鐘)下和嚴(yán)格條件下(100℃，20分鐘)進(jìn)行獨(dú)立的IP反應(yīng)，目的是為了獲得更加量化的結(jié)果。圖20顯示了其結(jié)果，A道樣品是部分降低條件，B道樣品是嚴(yán)格條件。樣品HB117-9、HB118-3、HB121-11的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)1是一致的，盡管在部分降低條件時(shí)高倍的多聚體的界限不足十分清楚。B道中的HB118-3樣品(嚴(yán)格條件)的四聚體十分清楚，Mr以上的印跡顯示更高的多聚體存在，再次表現(xiàn)出高度穩(wěn)定的交叉連接。
實(shí)驗(yàn)2中的道4包含NT1樣品HB118-3，其HBsAg的N末端有“αL”植物信號(hào)肽的延伸修飾。在A道中，信號(hào)肽加工的單體顯示出與可能代表未加工形式的較大信號(hào)大致相同的摩爾數(shù)比。同時(shí)顯示的有多聚體，在嚴(yán)格降低條件下它大部分轉(zhuǎn)化成單體和二聚體。
第6和第7道分別包含了樣品HB122-8和HB123-1，其HBsAg的N末端和C末端都有延長(zhǎng)。在這些樣品中(B道)，四聚體甚至在嚴(yán)格條件下也很明顯。HB123-1株攜帶了αL植物信號(hào)肽延伸和C末端的SEKDEL延伸(序列號(hào)4)，與單獨(dú)攜帶αL植物信號(hào)肽的HB119-5一樣，它顯示出明顯的信號(hào)肽的部分性加工。由此看來(lái)，在這些NT1細(xì)胞中，長(zhǎng)的αL信號(hào)肽的加工比短的αS信號(hào)肽的加工更有效。
總之，培養(yǎng)煙草NT1細(xì)胞的HBsAg表達(dá)容易形成雙硫交叉連接多聚體。當(dāng)大豆vspA信號(hào)肽的αS或αL與植物優(yōu)化的HBsAg基因的N末端融合，將使交叉連接得到極大的加強(qiáng)。這些數(shù)據(jù)表明，植物產(chǎn)生的HBsAg，特別是當(dāng)它與植物信號(hào)肽融合時(shí)，在天然或未加工宿主物質(zhì)經(jīng)口傳播中是出色的疫苗抗原。例13.土豆中口服佐劑的表達(dá)土豆塊莖切成薄片直接喂養(yǎng)小鼠時(shí)，其中的大腸桿菌LTB亞單位可以表達(dá)為一種具有免疫原性的形式，氨基酸序列SEKDEL(序列號(hào)4)的表達(dá)增加(Taq，T.等1995)。在這里強(qiáng)調(diào)，LT-B蛋白可以用作疫苗載體。通過(guò)使用編碼該蛋白序列的植物優(yōu)化密碼子，還可以進(jìn)一步增加LT-B蛋白的表達(dá)。表5顯示了不同的表達(dá)水平。
表5LT-B，ng/mg編碼區(qū)域(質(zhì)粒) 修飾 總的可溶性蛋白天然LT-B(pLTB110) 優(yōu)化翻譯啟始位點(diǎn)70LTB-SEKDEL(pLTK110)C末端SEDKEL延伸 190合成的LT-B*(pTH110) 植物優(yōu)化密碼子，除 4640去假的多聚腺苷酸和剪接信號(hào)*pTH110的構(gòu)建見Mason，H.等(1998)，Vaccine，161336-1343例14.塊莖中共同表達(dá)HBsAg和粘膜佐劑大腸桿菌突變株LT的轉(zhuǎn)基因土豆植物在混合與穩(wěn)定含有疫苗抗原和佐劑的準(zhǔn)備物時(shí)，為了避免后勤中出現(xiàn)問(wèn)題，如果提供的可食用物質(zhì)所含的抗原和佐劑成分無(wú)須作準(zhǔn)備，將是很方便的。至此，可以制造轉(zhuǎn)基因土豆植物，它們的塊莖共同表達(dá)并聚集HBsAg和大腸桿菌突變株LT。
植物中可以共同表達(dá)大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)及其突變株的A、B亞單位的質(zhì)粒載體已被構(gòu)建。這些也是同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)的主題，申請(qǐng)?zhí)枮镹o.60/113507。為了在土豆植物中共同表達(dá)HBsAg和LT，將質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)化雙載體的宿主，該載體中含有一個(gè)HBsAg表達(dá)盒并有抗菌素耐藥性，用該質(zhì)粒對(duì)土豆植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。以往質(zhì)粒的一個(gè)例子是pSLT102，它表達(dá)聚集的LT-K63(LT-A的S62到K63突變)，并載有卡那霉素耐藥基因NPT-II。用于準(zhǔn)備含有抗菌素耐藥的載體的合適的質(zhì)粒有pGPTV-HYG(潮霉素)和pGPTV-BAR(三磷化氫)(Becker，D.等1992)。用HindIII和EcoI消化pHB117得到HBsAg盒，并與用同樣方法消化的Pgptv-HYG和pGPTV-BAR連接，構(gòu)建出所希望的質(zhì)粒，然后用產(chǎn)生的雙載體，在含20mg/L潮霉素或1mg/L三磷化氫的介質(zhì)上轉(zhuǎn)化表達(dá)LT-K63的宿主土豆株。例15.用土豆塊莖中表達(dá)的HBsAg口服免疫小鼠用表達(dá)HBsAg的土豆片(每個(gè)動(dòng)物每次投食5克土豆)喂養(yǎng)BALB/c小鼠，如圖3和4A-E中顯示，小鼠產(chǎn)生了HBsAg特異性IgM和IgG血清免疫反應(yīng)，而喂養(yǎng)未轉(zhuǎn)化土豆的一組對(duì)照動(dòng)物沒(méi)有產(chǎn)生抗體。在這些實(shí)驗(yàn)中，霍亂毒素(Sigma，St.Louis，MO)被用作口服佐劑，十微克的佐劑放在土豆片上與抗原一起被動(dòng)物攝取。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)了兩遍，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組總共有十只小鼠。這些實(shí)驗(yàn)中的土豆塊莖僅表達(dá)1.1微克的HBsAg/毫克土豆，因此，每只小鼠每次喂食僅攝入5.5微克HBsAg，這或許直接反應(yīng)了中等程度的初始反應(yīng)。盡管如此，兩組小鼠在第60天用亞免疫劑量的酵母來(lái)源的rHBsAg刺激，僅有那些喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因土豆的小鼠產(chǎn)生繼發(fā)性抗HBsAg反應(yīng)，證實(shí)其建立了記憶細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)分析免疫反應(yīng)的免疫球蛋白的種類和亞類時(shí)，在所有的亞類中都觀察到在IgG反應(yīng)之后出現(xiàn)IgM反應(yīng)，血清中沒(méi)有測(cè)到IgA反應(yīng)。例16番茄植株的轉(zhuǎn)化番茄植物的轉(zhuǎn)化可以根據(jù)Frary/Fillati等(Biotechnology 5726-730，1987)的方案，并如此修飾將消毒種子(100種子～380毫克)(Tanksley TA234TM2R)浸在20％的CHLOROX漂白液中20分鐘，在消毒的milli-Q水中仔細(xì)清洗(清洗兩次或兩次以上)，播種在含有1/2 MSO的Magenta盒中(每個(gè)盒子約30顆種子)。在切割子葉前一天，將2毫升已培養(yǎng)一周的NT-1懸浮培養(yǎng)液吸到KCMS介質(zhì)盤上(NT-1細(xì)胞在KCMS液體介質(zhì)中每周傳代培養(yǎng))，懸浮液上覆蓋消毒的濾光器，在黑暗中培養(yǎng)一夜，播種八天后割下子葉，種子放在經(jīng)消毒水弄濕的消毒紙巾上，在葉柄處切下子葉，切除末梢，如果子葉大于一厘米則將它一切為二，外植體放在飼養(yǎng)盤上，近軸面向下，25℃條件下，經(jīng)16小時(shí)光照期和一夜的培養(yǎng)。
為了轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化前1周，將土壤桿菌劃線培養(yǎng)于LB選擇性培養(yǎng)板上，并在30℃下孵育。在劃線培養(yǎng)的培養(yǎng)板上，選取單個(gè)的菌落接種于液體選擇性培養(yǎng)基中，并接種在有150微克硫酸卡那霉素的3毫升YM培養(yǎng)基中孵育。30℃強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。將1毫升的培養(yǎng)液接種于49毫升加有2.5毫克硫酸卡那霉素的YM培養(yǎng)基中，并在一250毫升的培養(yǎng)瓶中，30℃強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。在600納米下測(cè)量其光密度，最佳的光密度值應(yīng)在0.5-0.6之間。
土壤桿菌培養(yǎng)液8000rpm離心(Sorvall離心機(jī)，ss34轉(zhuǎn))十分鐘，倒去YM培養(yǎng)基，將小球在2％MS-O中再次懸浮，最后的吸光度應(yīng)該在0.5和0.6之間。將25毫升土壤桿菌培養(yǎng)液吸入消毒的Magenta盒子中，將二至三個(gè)盤子中的外植體轉(zhuǎn)移到Magenta盒子的接種體中，孵育五分鐘，并偶爾搖動(dòng)。將外植體轉(zhuǎn)移到消毒的紙巾上，回到飼養(yǎng)盤，近軸面朝下，飼養(yǎng)盤用Nesco膜封上，將外植體在25℃下共同培養(yǎng)24小時(shí)，其中有16小時(shí)的光照期，然后近軸面朝上轉(zhuǎn)移到選擇性介質(zhì)(2Z)，盤子用微孔帶密封，回到25℃，度過(guò)16小時(shí)的光照期。
每三周將外植體轉(zhuǎn)移到新的IZ選擇培養(yǎng)基板上。當(dāng)開始出現(xiàn)嫩枝時(shí)，將它們轉(zhuǎn)移到IZ的Magenta盒中。例17.轉(zhuǎn)基因西紅柿的再生在4-6周內(nèi)，應(yīng)該出現(xiàn)第一批嫩枝。當(dāng)嫩枝有至少2厘米長(zhǎng)，并且包括至少1個(gè)結(jié)節(jié)時(shí)，自外植體切下嫩枝，將它們放在Magenta盒中，每盒放4個(gè)，Magenta盒內(nèi)含有選擇反應(yīng)素的西紅柿根培養(yǎng)基。根應(yīng)該在大約2周內(nèi)開始出現(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)的溫室生長(zhǎng)條件為一天16小時(shí)；平均溫度24.5℃；每次加水施肥100ppm的EXCELL(15-5-15)，具有額外的鈣和鎂；馬鈴薯生長(zhǎng)在METRO-MIX360中；西紅柿生長(zhǎng)在Cornell Mix+OSMO中；盡可能提高全部的植物質(zhì)量，以用于生物對(duì)照。例18.ELISA方法測(cè)定血清抗-HBsAg的特異性抗體應(yīng)用市場(chǎng)上可以買到的AUSAB酶聯(lián)免疫測(cè)定(EIA)診斷試劑盒(Abbott Diagnostics，Chicago，IL)，來(lái)評(píng)價(jià)小鼠血清中抗-HBsAg-特異性抗體，其它文章中描述過(guò)這種方法的應(yīng)用(Pride，M.等，1998)。AUSAB定量板的應(yīng)用，使得吸收值換算到毫國(guó)際單位/毫升(mIU/mL)。例19.抗-HBsAg應(yīng)答的同型分布應(yīng)用鼠型亞一同型試劑盒(Bio-Rad；Richmond，CA)，測(cè)定抗-HBsAg應(yīng)答的同型分布，在HBsAg-包被的珠子上孵育血清、唾液和糞便的提取物，并且應(yīng)用鼠抗-粘膜亞類-特異型抗血清(Bio-Rad，enzymeimmunoassay(EIA)grade Mouse Typer panel)發(fā)現(xiàn)結(jié)合的抗體。例20.應(yīng)用ELISA發(fā)現(xiàn)CT(LT)特異性抗體的產(chǎn)生這種測(cè)定可作陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)用。已經(jīng)證明，在口服CT/LT后，可獲得全身的抗體應(yīng)答，并且如果應(yīng)答是可以比較的就準(zhǔn)許評(píng)價(jià)。正如Mason等1992，1998所描述的可測(cè)定CT-B。例21.測(cè)定粘膜分泌物中的抗體應(yīng)答為測(cè)定粘膜分泌物中的抗體水平，應(yīng)按如下方法收集糞便和唾液標(biāo)本糞便自個(gè)體的動(dòng)物搜集新鮮排空的糞便球，并將其貯存在Eppendorf管中，放于-70℃。在測(cè)定之前，用PBS(每個(gè)糞球用50微升)懸浮糞球，然后，將管置在室溫中15分鐘，并且隨后劇烈振蕩，20℃孵育15分鐘。然后，再振蕩樣本，從1000xg離心5分鐘。收集上清液并且立即用于ELISA測(cè)定。如deVos或Dick.J.Immunol.Method.141285-288(1991)所描述的。
唾液在給小鼠腹腔注射0.1ml的1mg/ml毛果蕓香鹼溶液后，搜集唾液于毛細(xì)管中，小心搜集所有病例中的第一次唾液。將樣品轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，放于-70℃保存直至測(cè)定。例22.制備單細(xì)胞懸液應(yīng)用一個(gè)無(wú)菌的不銹鋼篩，輕輕挑開脾臟組織，從中獲取單細(xì)胞懸液。從小腸壁中，切下派氏集合淋巴結(jié)，分離派氏淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞。在Joklik′s改良的培養(yǎng)基中分離細(xì)胞(GIBCO，GrandIsland，NY)，這種改良的培養(yǎng)基中含有每ml或0.5mg/ml膠原酶中，有1.5mg的中性蛋白酶Dispase(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)，就同以前所描述的(Kiyono，H.等PNAS USA79596-600(1982))。例23.B細(xì)胞ELISPOT如上面所描述的，用脾臟和派氏集合淋巴結(jié)中分離的細(xì)胞進(jìn)行這種測(cè)定，脾臟和派氏集合淋巴結(jié)，用于全身(脾臟)和粘膜誘導(dǎo)(派氏集合淋巴結(jié))免疫應(yīng)答的比較?？乖匦院退蠭gM，IgA和IgG點(diǎn)式細(xì)胞(SFC)在細(xì)胞懸濁液中應(yīng)用別處描述的(見，如Current Protocolsin Immunology)抗原特異的ELISPOT計(jì)數(shù)。例24.在口服攝取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯后，分析鼠全身的腸相關(guān)組織中的Th1和Th2細(xì)胞作為給小鼠喂食表達(dá)HBsAg或任何免疫原性多肽的轉(zhuǎn)基因植物的結(jié)果，能夠檢查產(chǎn)生的T-細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)的本質(zhì)和動(dòng)力學(xué)特征。用合成的和微膠囊密封的肽，口服免疫那些富含T細(xì)胞的脾臟和派氏集合淋巴結(jié)，來(lái)激發(fā)抗原-特異性T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。在喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的小鼠中，也能夠進(jìn)行類似的研究。
也進(jìn)行分析轉(zhuǎn)基因HBsAg表達(dá)植物喂養(yǎng)小鼠的全身和粘膜相關(guān)組織中Th1和Th2型細(xì)胞的頻率。諸如派氏集合淋巴結(jié)等粘膜組織中，Th1和Th2細(xì)胞的頻率，可能影響同種特異應(yīng)答的發(fā)生。能夠應(yīng)用的三種方法為(i)細(xì)胞因子特異性單細(xì)胞測(cè)定，定量分泌特殊細(xì)胞因子的抗原特異性細(xì)胞的數(shù)量，(ii)應(yīng)用特異的ELISA測(cè)定方法，測(cè)定分泌的細(xì)胞因子，和(iii)細(xì)胞因子特異性的PCR分析。前兩種方法允許測(cè)定多種細(xì)胞因子合成和分泌的水平，而第三種方法將要判定mRNA產(chǎn)物中是否伴隨這些變化。聯(lián)合這些方法，將能允許判定是否一種特殊細(xì)胞因子的增加，是細(xì)胞因子mRNA表達(dá)增加的一個(gè)直接結(jié)果。
脾臟和派氏集合淋巴結(jié)中，T細(xì)胞的體外增殖。在第三次喂食動(dòng)物的一周后，將動(dòng)物殺死，依照前面描述的方法，搜集脾臟、轉(zhuǎn)化細(xì)胞(Pride，M等1993)。依照上述的方法，收集派氏集合淋巴結(jié)和細(xì)胞。在96-孔平底板中，鋪上T細(xì)胞(每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞)，同時(shí)加入5×105個(gè)光照射的同源脾細(xì)胞，以作為抗原提呈細(xì)胞。在加入抗原后，按照所描述的方法培養(yǎng)細(xì)胞120小時(shí)。應(yīng)用[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷摻入法，通過(guò)液體閃光分光鏡檢查判定增殖的情況。用三份相同的孔中[3H]-TdR摻入的平均cpm來(lái)表達(dá)結(jié)果。
計(jì)數(shù)T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子應(yīng)用ELISPOT方法，采用配對(duì)抗-細(xì)胞因子的單克隆抗體，來(lái)確定在體外培養(yǎng)的、再次受刺激的抗原-特異性T細(xì)胞中，T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子數(shù)量。
細(xì)胞因子特異性的ELISA測(cè)定。采用ELISA(Current Protocols inImmunology)應(yīng)用與在ELISPOT測(cè)定中所用的相同的抗-細(xì)胞因子mAbs，來(lái)測(cè)定脾細(xì)胞和派氏集合淋巴結(jié)T細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子的量。
細(xì)胞因子-特異性的PCR分析。為探查在CD4+T細(xì)胞(脾細(xì)胞和派氏集合淋巴結(jié))中的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6特異性mRNA，執(zhí)行并修改了此前所描述的(Kiyono，H等1982)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR擴(kuò)增方案。為了RNA的分離，應(yīng)用了硫氰酸胍/酚/氯仿抽提方法程序(Chomczynski & Sacchi，Anal.Biochem.162156(1987))。RNA被抽提，然后應(yīng)用2.5U/μl的Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)進(jìn)行細(xì)因子特異性的RT-PCR。PCR產(chǎn)物通過(guò)在2％的瓊脂凝膠的電泳分離，由溴乙啶(0.5微克/毫升)染色，并在UV(紫外)光下觀察。
IFN-γ、IL-4特異性mRNA的定量，應(yīng)用重組的mRNA(rcRNA)作為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR。根據(jù)其它地方所描述的方法(Wang，等，PNAS USA 869717-9721(1989))，構(gòu)建IFN-γ、IL-4和β-肌動(dòng)蛋白的銜接rcRNA。所進(jìn)行的PCR反應(yīng)，包括了50微升的PCR緩沖液，3亳摩爾濃度的氯化鎂，0.2毫摩爾濃度的dNTP，30pmol的IFN-γ、IL-4和β-肌動(dòng)蛋白的mRNA上游和下游引物，200納克的基因組DNA(間隔基因)以及2.5單位的Taq多聚酶(Perkin-Elmer Cetus，F(xiàn)osterCity，CA)85℃。其相應(yīng)的引物列于表6。在加熱至94℃3分鐘，樣本經(jīng)30個(gè)循環(huán)，即每一次熱循環(huán)(Perkin-Elmer Cetus)包括-30秒的變性(94℃)、一秒的退火(59℃)和一個(gè)45秒的擴(kuò)增(72℃)。在反應(yīng)過(guò)程的最后進(jìn)行一次5分鐘的擴(kuò)增(72℃)。PCR產(chǎn)物應(yīng)用WizardPCR Preps DNA純化系統(tǒng)(Promega Corp.，Madison，WI)進(jìn)行純化。在這種包含有IFN-γ、IL-4和β-肌動(dòng)蛋白的合成基因構(gòu)建完成以后，將PCR的產(chǎn)物插入到含有T7多聚酶啟動(dòng)子(Promega)的pGEM-T載體中。應(yīng)用埃希氏大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。為獲得rcRNA，純化的合成基因需應(yīng)用Spel(Promega)線性切開。為獲得純化的rcRNA，轉(zhuǎn)錄需經(jīng)RQIDN酶(Promega)處理，并且進(jìn)一步應(yīng)用Oligotex-dT乳膠顆粒(Oligotex-dT mRNA試劑盒，Qiagen，Chatsworth，CA)加以純化。
表6特異性PCR細(xì)胞因子的引物列表β-肌動(dòng)蛋白 5′引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′ 序列號(hào)24(349bp) 3′引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′ 序列號(hào)25INF-γ 5′引物5′-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3′ 序列號(hào)26(460bp) 3′引物5′-CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG-3′序列號(hào)27IL-2(502bp) 5′引物5′-ATGTACAGCATGCAGCTCGCATC-3′序列號(hào)283′引物5′-GGCTGGTTGAGATGATGCTTTGTCA-3′ 序列號(hào)29IL-4(399bp) 5′引物5′-ATGGGTCTCAACCCCCAGGAAGTC-3′ 序列號(hào)303′引物5′-GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTC-3′ 序列號(hào)31IL-5(243bp) 5′引物5′-ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC-3′ 序列號(hào)323′引物5′-CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG-3′ 序列號(hào)33IL-6(155bp) 5′引物5′-CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG-3′ 序列號(hào)343′引物5′-5′-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3′ 序列號(hào)35IL-10(237bp) 5′引物5′-ACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGC-3′ 序列號(hào)363′引物5′-CTATGCAGTTGAAGATGTCAAA-3′ 序列號(hào)37TNFα5′引物5′-TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3′ 序列號(hào)38(354bp) 3′引物5′-GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGCC-3′ 序列號(hào)39采用競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR，作為一種競(jìng)爭(zhēng)性的模板，總RNA和細(xì)胞因子-特異性的rcRNA一起進(jìn)行反應(yīng)。小份的總RNA(8-630納克的IFN-γ，11-900納克的IL-4和0.19-15微微克β-肌動(dòng)蛋白)，采用一系列的稀釋的mRNA內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)試。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR(見表7)。通過(guò)添加到PCR反應(yīng)混合物中5微居里的[32P]dCTP(Amersham，Arlington Heights，IL)，進(jìn)行定量測(cè)定。Duchmann等，DNA and CellBiol.12217.1993。最后，如同上面所描述的方法，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的電泳。在IFN-γ、IL-4和β-肌動(dòng)蛋白的特異性鍵中的[32P]dCTP的含量，可通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)器加以確定。
表7RT情況PCR情況42℃15分鐘 95℃2分鐘 1循環(huán)99℃5分鐘 95℃1分鐘60℃1分鐘35循環(huán)5℃5分鐘60℃7分鐘 1循環(huán)4℃浸泡例25.去垢劑濃度對(duì)從植物中提取HBsAg的影響從植物病毒載體為基礎(chǔ)的馬鈴薯病毒X(PVX)株DX，被用來(lái)表達(dá)植物中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。把寡核苷酸引物置入具有限制性內(nèi)切酶ClaI和XhoI的位點(diǎn)中，使用這種引物，對(duì)在例證7中所描述的、在pHB115下的質(zhì)粒psHB312，進(jìn)行多聚酶連反應(yīng)、擴(kuò)增，優(yōu)先在植物中表達(dá)的合成的HBsAg基因。用這些酶消化這些擴(kuò)增產(chǎn)物，將含有HBsAg基因的消化產(chǎn)物，連接到用同樣的酶消化的9kb的質(zhì)粒pDX10a片段上。質(zhì)粒pDX10a是PUC19的一種衍生物，具有ClaI/XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，可包括PVX基因組衣殼蛋白的編碼序列。這就產(chǎn)生了一種質(zhì)粒，pDX10a-HBV6，含有PVX株DX全長(zhǎng)感染的cDNA克隆，它在T7啟動(dòng)子的控制下，在那里，HBsAg的mRNA的基因取代了PVX的衣殼蛋白基因。設(shè)計(jì)這種構(gòu)造，以便通過(guò)編碼HBsAg的mRNA的產(chǎn)物，來(lái)啟動(dòng)HBsAg的表達(dá)。編碼HBsAg的mRNA，來(lái)自亞基因組啟動(dòng)子，它自然地指導(dǎo)PVX衣殼蛋白的亞基因組mRNA的產(chǎn)生。
應(yīng)用限制性內(nèi)切酶SpeI線性切開pDX10a-HBV6的DNA，參照說(shuō)明書，應(yīng)用Ambion T7 mMessage mMachine試劑盒，用T7多聚酶，在體外轉(zhuǎn)錄線性切開的DNA。將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物人工接種在表達(dá)PVX衣殼蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草屬的植物中，在轉(zhuǎn)基因補(bǔ)充丟失的病毒基因，衣殼蛋白時(shí)，改良的病毒形式對(duì)植物產(chǎn)生整體的感染。對(duì)受感染植物的提取物進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western雜交分析，結(jié)果表明有兩種蛋白的表達(dá)，這兩種蛋白對(duì)HBsAg特異性抗血清，是有免疫反應(yīng)的；這兩種蛋白很可能代表了病毒表達(dá)的HBsAg蛋白的糖基化和非糖基化形式。
采用Mason等(1992)根據(jù)其特征所描述的改良的操作方法，在Planta中，嘗試表達(dá)HBsAg蛋白的純化。應(yīng)用一個(gè)研棒和研缽，在4倍體積的提取物緩沖液中攪勻全被感染的葉片組織。以1000xg離心組織的勻漿5分鐘，以27000xg離心上清液15分鐘，以100000xg過(guò)夜離心經(jīng)27000xg離心的上清液，1小時(shí)。等分粗制的勻漿組織和每次離心的上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western雜交，分析HBsAg特異性抗血清。肉眼觀察Western雜交的結(jié)果表明，在第一步低速離心期間，沒(méi)有描寫的HBsAg沉淀，但是在第二步離心期間，則有了明顯的表達(dá)蛋白的丟失，并且絕大多數(shù)殘基的可溶性HBsAg，在第三步高速離心期間沉淀。還觀察到，在中速離心期間，有大量的HBsAg丟失，這表明所用的緩沖液，不能有效地提取蛋白質(zhì)，很可能是由于眾所周知的膜相關(guān)特征。因此，為測(cè)試是否能夠增加蛋白質(zhì)的提取物，可考慮應(yīng)用含有不同水平的去垢劑的緩沖液，進(jìn)行提取。
應(yīng)用研棒和研缽，在0.1M的磷酸鈉(PH值7.0)和0.1M的抗壞血酸的兩倍體積的緩沖液中，攪勻全被感染的葉片組織。用相同體積的緩沖液，在研棒和研缽中，采用等分量的5毫升粗制勻漿組織，再攪勻2分鐘，用0.2％、1％、2％、5％或10％的Triton X-100，作為無(wú)離子去垢劑的替代物，來(lái)補(bǔ)充至緩沖液體積相同。組織勻漿被冰浴1小時(shí)，隨后以27000xg離心15分鐘。采取等量的粗制勻漿組織和五步提取過(guò)程中的每一次上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western雜交，分析HBsAg特異性抗血清。肉眼觀察Western雜交結(jié)果表明，在無(wú)去垢劑的情況下，離心的上清液中，發(fā)現(xiàn)HBsAg的效力很低，但是用1％或更高的Triton X-100終濃度的提取物，可導(dǎo)致效力的恢復(fù)。這樣以來(lái)，增加去垢劑的水平直至1％，可導(dǎo)致更有效地提取所需要的蛋白質(zhì)。
然而，HBsAg作為一種免疫原，其功效依賴它的聚集狀態(tài)，顆粒型比游離蛋白更具有免疫原性。因此，通過(guò)區(qū)帶離心，進(jìn)一步分析用0.1％、0.5％和1.0％終濃度的TritonX-100提取的HBsAg，即在10mM的磷酸鈉(PH值7.0)和0.15M的氯化鈉中制成不連續(xù)的32毫升的蔗糖梯度(即5％、13.3％、21.6％和30％的蔗糖，每種8毫升)，并使其在4℃慢慢混合過(guò)夜。取2毫升經(jīng)27000xg離心的上清液加載于梯度蔗糖上，并在5℃下在一個(gè)Sorval AH629離心機(jī)中以29000rpm離心6小時(shí)。從三種不同的梯度中收集2毫升，并且等分樣品采用SDS-PAGE和Western雜交進(jìn)行分析。用1％Triton X-100提取的原料上樣密度梯度中的Western雜交部分，觀察的結(jié)果表明，自頂端梯度的四個(gè)部分存在實(shí)際上全部的HBsAg相關(guān)蛋白，這提示用這種水平的去垢劑已經(jīng)可以完全溶解HBsAg脂蛋白復(fù)合物。相反，用0.1％Triton X-100提取的原料上樣密度梯度中的Western雜交部分，結(jié)果表明在中間段梯度的部分中有一個(gè)寬峰值，這提示提取的HBsAg是以一種想要的顆粒形式存在。觀察第三種蔗糖梯度中的Western雜交部分，表明絕大多數(shù)HBsAg可以用這種水平的去垢劑提取物所完全溶解，如同1％Triton X-100的情況一樣。
因此，盡管通過(guò)增加去垢劑的水平至Mason等用過(guò)的0.1％以上，可以提高HBsAg提取物的水平，但是，應(yīng)用0.5％或更高濃度的TritonX-100可導(dǎo)致HBsAg顆粒形式的破壞，而用作疫苗的最有效部分可能就是HBsAg的這些顆粒形式。這樣，如果不是故意重新組成顆?；蛐枰耆扇苄缘牡鞍?，那么用于抗原純化的去垢劑水平就應(yīng)在0.5％以下。總之，Triton X-100的水平高于或等于0.1％但決不超過(guò)0.5％，顯然對(duì)提取planta中表達(dá)的顆粒形式的HBsAg是最理想的。例26當(dāng)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在植物中表達(dá)時(shí)，可以得到對(duì)它的一個(gè)免疫應(yīng)答，并且當(dāng)動(dòng)物對(duì)HBsAg有免疫接納性時(shí)，給它喂食這種植物原料。通過(guò)用含HBsAg的植物原料與一種合適的佐劑喂食一種動(dòng)物，有可能使該動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)HBsAg的免疫接納性。由于以前的免疫接種，該動(dòng)物也可能是免疫接納性的，例如，在初次免疫接種的動(dòng)物中，給動(dòng)物喂食含有HBsAg的植物原料，可以在動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)對(duì)HBsAg的免疫應(yīng)答。
與例證27-30一致，挑選來(lái)使用的表達(dá)HBsAg的馬鈴薯細(xì)胞系是由馬鈴薯L.c.v.Frito-Lay 1607HB-7轉(zhuǎn)化來(lái)的。FL-1607 HB-7和HB114-16是指定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。為得到這些細(xì)胞系，將從中國(guó)adr隔離的HBV的PMT-SA克隆中獲得的HBsAg，插入轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體(pHB-7和pHB114)內(nèi)，再將這些載體移入根癌土壤桿菌(LBA4404)中，然后用來(lái)轉(zhuǎn)化馬鈴薯L.c.v.“Frito-Lay 1607”。用來(lái)構(gòu)建這些例證中使用的馬鈴薯細(xì)胞系pHB-7和pHB114-16的質(zhì)粒載體，都含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTHII，也就是通常所說(shuō)的APH(3′)II)。這種基因也可以整合入馬鈴薯基因組，并且在馬鈴薯細(xì)胞中表達(dá)。已經(jīng)表明埃希氏大腸桿菌衍生的NPTII在生物化學(xué)上等同于植物表達(dá)的NPTII。埃希氏大腸桿菌衍生的NPTII在模擬哺乳動(dòng)物消化的條件下能快速降解，并且已經(jīng)表明當(dāng)給小鼠喂食高達(dá)每公斤體重5克的純化蛋白時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生有害作用。根癌土壤桿菌處理轉(zhuǎn)化的FL-1607，并無(wú)性繁殖，挑選能夠表達(dá)高水平HBsAg的FL-1607 HB-7和HB114-16細(xì)胞系。通過(guò)ELISA技術(shù)測(cè)試FL-1607轉(zhuǎn)化細(xì)胞系提取物中的HBsAg濃度。HB-7平均為每克重量的塊莖有1100納克的HBsAg，和HB114-16平均為每克重量的塊莖有8500納克±2100納克的HBsAg。
提取的HBsAg自然地形成病毒樣顆粒(VLP)，與酵母衍生的HBsAg VLPs以同樣的密度沉降。電泳遷移率和western雜交分析顯示表達(dá)抗原的塊莖與酵母衍生的抗原難以區(qū)別。
細(xì)胞系被無(wú)性繁殖以增加植物的數(shù)量，并且把它裝在罐里的土壤中，產(chǎn)生例證中使用的塊莖。通過(guò)體外無(wú)性繁殖來(lái)維持轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。
通過(guò)無(wú)性繁殖來(lái)維持未轉(zhuǎn)化的親本馬鈴薯細(xì)胞系，F(xiàn)L-1607，并且將它裝在罐里，以產(chǎn)生用作安慰對(duì)照組的塊莖。這些塊莖中的組織并不表達(dá)對(duì)檢測(cè)HBsAg的試劑起反應(yīng)的任何蛋白質(zhì)。例27給BALB/c小鼠喂食去皮的HB-7馬鈴薯片做為實(shí)驗(yàn)組或者喂食沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯做為對(duì)照組。在0天、7天和14天給每組小鼠喂食三次5克的馬鈴薯，用霍亂毒素(CT)B亞單位作為口服佐劑。將10微克的佐劑放在馬鈴薯片(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)中與抗原一起喂食動(dòng)物。喂食HB-7的動(dòng)物，每次喂食因此而得到了平均5.5微克的HBsAg，或者說(shuō)，三次喂食一共有平均16.5微克的HBsAg。
喂食HB-7的小鼠出現(xiàn)特異性針對(duì)HBsAg的血清IgM和IgG抗體應(yīng)答，而喂食對(duì)照的非轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的對(duì)照組動(dòng)物，則沒(méi)有產(chǎn)生任何的抗體。在第三次喂食后，觀察到免疫應(yīng)答的峰值在70mIU/ml左右。在單純的腹膜內(nèi)注射了一次0.5微克的酵母源性的、在硫酸鋁中重組的HBsAg(rHBsAg)以后(為一正常的亞免疫原性劑量)，出現(xiàn)了一次強(qiáng)烈的二次應(yīng)答，其峰值在1700mIU/ml左右。這次應(yīng)答中主要的抗體為IgG。在喂食非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和CT的對(duì)照鼠中，沒(méi)有見到初次和二次免疫應(yīng)答。沒(méi)有口服佐劑的，也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的針對(duì)HBsAg的免疫應(yīng)答。例證28
在Frito-Lay 1607 HB114-16細(xì)胞系，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，在用于這些實(shí)驗(yàn)的部分中，平均的塊莖表達(dá)是每克鮮重塊莖有8.37微克HBsAg。
用HB114-16或以對(duì)照的沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯，喂養(yǎng)BALB/c小鼠組(每組5個(gè))。在兩組中，都給馬鈴薯添加10微克CT。一周和兩周后再重復(fù)喂養(yǎng)一次。在整個(gè)的三周期間，給予每一只小鼠的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中HBsAg的總平均劑量為125.55微克。然后，在第一次喂食的70天后，或者在出現(xiàn)的初次免疫應(yīng)答已回復(fù)到基線水平后的3-6周時(shí)，給予一次rHBsAg(酵母源性)的亞-免疫原性劑量(0.5微克)，并加以鋁佐劑，通過(guò)皮下(s.c.)注射免疫小鼠。
在這些劑量水平上，在第二次喂食后，馬上即可見到一次初次免疫應(yīng)答。該免疫原性持續(xù)上升，并且在6周左右的峰值為100mIU/ml。而在人體，在第三次注射目前所允許注射的乙型肝炎疫苗的劑量后，抗體的滴度僅僅達(dá)到10mIU/ml，便認(rèn)為是已成功地免疫了。在13周時(shí)，免疫應(yīng)答回復(fù)至基線水平，并在16周再給動(dòng)物注射高劑量的HBsAg。這會(huì)導(dǎo)致曲線的一次驟升，其抗體的滴度可達(dá)大于3000mIU/ml，而在實(shí)驗(yàn)(共40周)的剩余時(shí)間內(nèi)，滴度仍保持在1000mIU/ml以上。這是由于初次免疫中產(chǎn)生的，具有抗原特異性的免疫記憶細(xì)胞所致，這些記憶細(xì)胞的快速、強(qiáng)烈的對(duì)抗原回憶應(yīng)答，導(dǎo)致了二次應(yīng)答的迅速上升。
本實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組動(dòng)物，給予了沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯和CT，它們沒(méi)有出現(xiàn)明顯的針對(duì)HBsAg的免疫應(yīng)答，并且用上述方法第二次注射亞免疫原性劑量后，也沒(méi)有見到二次應(yīng)答，因而確定了HBsAg結(jié)果的特異性。給予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯但未加CT的對(duì)照組動(dòng)物，僅僅出現(xiàn)了一次低水平的初次應(yīng)答，如10mIU/ml滴度，在僅一周內(nèi)便回復(fù)至基線水平。另外，用上述方法第二次注射亞免疫原性劑量后，也僅出現(xiàn)了一次50 mIU/ml滴度的二次應(yīng)答，并且在兩周內(nèi)回復(fù)到僅僅有10mIU/ml的滴度。例29在小鼠中已經(jīng)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，激發(fā)一種已存在的亞免疫原劑量的rHBsAg。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，BALB/c小鼠組(每組5個(gè))，用亞免疫原劑量的rHBsAg(Merck)進(jìn)行免疫，rHBsAg在明礬中經(jīng)皮下途徑傳輸，5周后，用HB114-16或用對(duì)照的沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯喂養(yǎng)每個(gè)小鼠。在兩組中，都給馬鈴薯添加10微克CT。一周和兩周后再重復(fù)喂養(yǎng)一次。三周的時(shí)間內(nèi)，每只小鼠的總的平均劑量為125.55微克。
在第三次喂養(yǎng)時(shí)已經(jīng)開始出現(xiàn)發(fā)生的繼發(fā)應(yīng)答，而且在下降之前在初級(jí)免疫作用后的11周，升高到大約1000mIU/ml。在對(duì)照組，在喂養(yǎng)沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯時(shí)沒(méi)發(fā)生免疫應(yīng)答。例30在一個(gè)隨機(jī)雙盲的研究中，給以前接種過(guò)一種商業(yè)上的乙肝疫苗、且經(jīng)過(guò)一段延長(zhǎng)時(shí)間后抗-HBsAg滴度在115mIU/ml以下、且沒(méi)有人體免疫缺陷病毒者42人，吃含有HBsAg的馬鈴薯或不含HBsAg的馬鈴薯對(duì)照。當(dāng)打破代碼時(shí)，接受三種劑量的100克沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的馬鈴薯FL-1607的對(duì)照組稱為組1。組2接受兩種劑量的、每一種為100克的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯FL-1607 HB114-16和一種劑量的沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的FL-1607馬鈴薯。組3接受三種劑量的每一種為100克的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯FL-1607 HB114-16。
可利用的前期臨床資料顯示(1)以體重方式，小鼠自由地食用其25％體重的馬鈴薯，該馬鈴薯沒(méi)有毒性的證據(jù)；和(2)5克馬鈴薯中含50微克劑量的HBsAg，可作為具有口服佐劑的一系列初級(jí)的免疫原?？衫玫钠渌R鈴薯疫苗的臨床資料表明(1)吃掉100克的生馬鈴薯一般是可以很好耐受的，和(2)以體重方式，70公斤的人吃掉100克的馬鈴薯，將代表0.14％的體重。這個(gè)量大約比在小鼠的臨床前實(shí)驗(yàn)中根據(jù)體重消耗掉的量低178倍。
這樣，在人類的實(shí)例中，志愿者吃每一劑量的100-110克馬鈴薯。在這項(xiàng)研究中計(jì)劃使用的臨床批量為每克馬鈴薯含8.5±2.1微克的HBsAg。在28天的療程后，接受兩個(gè)100克劑量的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究對(duì)象，所接受的HBsAg的總劑量為1,280-2,120微克，而接受三次劑量者所接受的HBsAg的總劑量為1,920-3,180微克。
在每天的定量(第0，14和28天)上，藥房全體人員用清潔的技術(shù)將供給每組(安慰劑和對(duì)照組)的適當(dāng)數(shù)量的馬鈴薯分別除去并且加工到個(gè)人的100-110克的劑量中。簡(jiǎn)單地，清洗、去皮挑選的馬鈴薯，把它們切成丁，放進(jìn)冰冷的水中沖洗。馬鈴薯去皮就是除去含有植物堿基茄堿的皮。這種植物堿能夠引起腹部不適或惡心，并且可以引起一種苦味。在去皮和切成丁后，根據(jù)每組的分配和研究對(duì)象識(shí)別數(shù)目(SID)，為每個(gè)研究組稱出100-110克劑量的馬鈴薯。搜集皮和任何沒(méi)有用的馬鈴薯部分，將其毀壞。每組研究對(duì)象的那份的馬鈴薯均在水下保存，以防止在馬鈴薯切成丁后到被研究對(duì)象吃完的這期間，因氧化而發(fā)生褐色變。每組在每次吃加工過(guò)的馬鈴薯時(shí)，留取適當(dāng)?shù)鸟R鈴薯進(jìn)行冷凍，以便進(jìn)一步加工來(lái)證實(shí)抗原的含量。
在表8，9，10列出的天數(shù)時(shí)，測(cè)定研究對(duì)象的抗-HBsAg的滴度。結(jié)果清楚地表明，作為攝取轉(zhuǎn)化的馬鈴薯的結(jié)果，HBsAg抗原被服用時(shí)免疫應(yīng)答增加。接受三次劑量都含有HBsAg的馬鈴薯的研究象中，有60％以上的人表明在免疫應(yīng)答上有明顯的增加。表中清楚地表明，在多數(shù)情況下，攝取含有遺傳表達(dá)的HBsAg的植物物質(zhì)能夠?yàn)橹饕腋我呙绲囊环N有效的激發(fā)劑。在全部的觀察期間，接受三次劑量都沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的對(duì)照馬鈴薯的對(duì)照組研究對(duì)象，在抗體滴度上沒(méi)有任何變化。
表8組1(接受3劑量的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖)滴度(Im/ml)志愿者 0天 7天 14天 21天 28天 35天 42天 56天1 72647374787863572 171412122 5 10*3 63515667697488894 66785262547467695 0 0 0 1 0 0 * 76 129 1218181617197 34282432332934338 9 1112118 7 9 9
910499831101201009992*未提出樣本表9組2(接受2劑量的轉(zhuǎn)基因和1劑量的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖)滴度(mIU/ml)志愿者 0天 7天 14天 21天 28天 35天 42天 56天1292929 29 29 29 47 9328 1527 49 41 40 73 793170 161 158144130144* 1324323231 34 33 23 * 425131515 14 11 11 17 176433746 77 69 85 85 787673747 57 80 89 77 738117 1141141361761912009104 126 26226931831335739010 332622 21 21 25 25 2911 107 9296 89 93 83 95 9012 212255 11212021939545813 656866 63 89 10313725814 202418 15 12 12 15 2015 0 0 0 0 0 0 0 016 979311210912829445443217 2634197330353360707863*未取出樣本表10組3(接受3劑量的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖)滴度(mIU/ml)志愿者 0天7天 14天 21天28天35天42天56天1 17 2070 140 269 428 401 4632 94 8710099 88 79 87 883 33 3432 33 27 34 31 324 0 0 0 0 0 0 0 05 9 9 53 74 74 85 65 616 20 4157 84 452 475 897 6527 85 76496121230583572415245268 13 1919 15 28 14 20 219 120236 282390 605 667 15831717109 1114 13 13 18 11 15110 0 0 0 0 0 0 01272 77137270 349 523 109812261385 7684 74 111 215 175 1631440 3539 71 119 122 330 4301556 5159 85 252 407 520 74516115213 51110541964306929663449
權(quán)利要求
1.一種植物表達(dá)載體，包含有兩個(gè)表達(dá)盒，其中第一個(gè)表達(dá)盒包含有一種編碼一抗原的多聚核苷酸，以及其中的第二個(gè)表達(dá)盒包含有一種多聚核苷酸，編碼與第一個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸相同的抗原，其中第二個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸，與第一個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸是不相同的。
2.權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中的第一個(gè)表達(dá)盒包含有一種編碼乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的多聚核苷酸，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一種編碼HBsAg的不相同的多聚核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，當(dāng)上述兩種多聚核苷酸在一個(gè)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其中的基因抑制被降低或消除。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物表達(dá)載體，其中的基因抑制是由RNA-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因抑制。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中第一個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸和第二個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸，均包含有不多于90個(gè)毗鄰的相同的核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中第一個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸和第二個(gè)表達(dá)盒的多聚核苷酸，均包含有不多于60個(gè)毗鄰的相同的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體，其中第一個(gè)表達(dá)盒中包含的多聚核苷酸，編碼了一個(gè)植物優(yōu)選化的HBsAg多肽，和其中第二個(gè)表達(dá)盒中包含的多聚核苷酸，編碼了一種天然病毒源性的HBsAg多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物表達(dá)載體，其中第一個(gè)表達(dá)盒中的多聚核苷酸包含有至少一個(gè)植物優(yōu)選化的密碼子。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的植物表達(dá)載體，其中第一個(gè)表達(dá)盒中的多聚核苷酸包含有SEQ ID NO3，和第二個(gè)表達(dá)盒中的多聚核苷酸包含有SEQ ID NO1。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中的第一個(gè)表達(dá)盒，進(jìn)一步包含有一個(gè)5′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)不相同的5′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中的第一個(gè)表達(dá)盒，進(jìn)一步包含有一個(gè)3′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)不相同的3′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其中的第一個(gè)表達(dá)盒中，進(jìn)一步包含有一個(gè)5′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)和一種3′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)與第一個(gè)表達(dá)盒不相同的5′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)和一個(gè)不相同的3′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的植物表達(dá)載體，其中的第一個(gè)表達(dá)盒中，包含有一種TEV的5′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)和一個(gè)vspB的3′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)TMV的5′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)和一個(gè)pin2的3′轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的植物表達(dá)載體，其中的第一個(gè)表達(dá)盒中，包含有一個(gè)植物優(yōu)選化的HBsAg多肽，并且其中的第二個(gè)表達(dá)盒中，包含有一種天然的病毒源性的HBsAg多肽。
15.一種埃希氏大腸桿菌細(xì)胞，用權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的埃希氏大腸桿菌，其中的病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
17.一種土壤桿菌細(xì)胞，用權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的土壤桿菌，其中的病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
19.一種植物細(xì)胞，用權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物細(xì)胞，其中的病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物細(xì)胞，其中的植物細(xì)胞的從一組包括西紅柿、馬鈴薯、香蕉和胡蘿卜細(xì)胞中選擇出來(lái)的。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的植物細(xì)胞，其中的植物表達(dá)載體，被整合入植物細(xì)胞的細(xì)胞核基因組中。
23.一種植物種子，包含權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體。
24.一種多聚核苷酸，包含有一核酸序列的，該核酸序列編碼一乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，可操縱性地連接了(i)一個(gè)植物功能性的啟動(dòng)子；(ii)一種翻譯增強(qiáng)序列；和(iii)一種終止序列。其中，多聚核苷酸缺乏一種在翻譯增強(qiáng)序列和HBsAg編碼序列之間的非轉(zhuǎn)錄區(qū)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中編碼HBsAg的核酸序列，包含有至少一個(gè)已改變了的密碼子，其中已改變的密碼子是一個(gè)植物優(yōu)選化的密碼子。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中所述的植物-功能性的啟動(dòng)子，是從一組包括菜花花葉病毒(CaMV)35S、西紅柿E8、泛素、甘露糖松(mannopine)合成酶、patatin、和顆粒-限制性淀粉合成酶(GBSS)的啟動(dòng)子中選擇出來(lái)的。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中的啟動(dòng)子包括一個(gè)雙啟動(dòng)子區(qū)。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中所述的翻譯增強(qiáng)序列是從一組包括煙草蝕刻病毒(TEV)和煙草花葉病毒(TMV)的Ω翻譯啟動(dòng)子中選擇出來(lái)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中所述的終止序列，是從一組包括胭脂堿合成酶(nos)、植物的貯藏蛋白(vsp)，或者一種蛋白酶抑制劑-2(pin2)的終止序列中選擇出來(lái)的。
30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸缺乏一個(gè)在HBsAg編碼序列和終止序列之間的非轉(zhuǎn)錄區(qū)。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，進(jìn)一步包含有一種編碼微粒體保留信號(hào)的核酸序列，被可操縱性地連接到HBsAg編碼序列的3′末端。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的多聚核苷酸，其中的微粒體保留信號(hào)是絲氨酸-谷氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(SEQ ID NO4)。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸缺乏一個(gè)在微粒體保留信號(hào)和終止序列之間的非翻譯區(qū)。
34.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，進(jìn)一步包含有一種編碼信號(hào)肽的核酸序列，被可操縱性地連接到HBsAg編碼序列的5′末端。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的多肽，其中信號(hào)肽是從一組包括植物貯藏蛋白(VSP)αS信號(hào)肽和VSPαL信號(hào)肽中選擇出來(lái)的。
36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中HBsAg編碼序列進(jìn)一步包含有一個(gè)前-S區(qū)。
37.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中HBsAg編碼序列，包含有一種核酸序列，可在植物中最佳的表達(dá)，見SEQ ID NO3。
38.根據(jù)權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸，其中的多聚核苷酸是從一組包括HB104、HB105、HB106、HB107、HB111、HB114、HB115、HB116、HB117、HB118、HB119、HB120、HB121、HB122、HB123、HB131、HB140.3HB145和HB165中的多聚核苷酸中選擇出來(lái)的。
39.一種表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含有一種可選擇的標(biāo)記物。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含有一種埃希氏大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體，進(jìn)一步包含有一種土壤桿菌的復(fù)制起點(diǎn)。
43.應(yīng)用權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體，對(duì)一種埃希氏大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的埃希氏大腸桿菌細(xì)胞，其中的病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
45.一種土壤桿菌細(xì)胞，應(yīng)用權(quán)利要求39所述的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的土壤桿菌細(xì)胞，其中的病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的土壤桿菌細(xì)胞，進(jìn)一步包含有一個(gè)輔助性Ti質(zhì)粒。
48.一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，包含有權(quán)利要求24所述的多聚核苷酸。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中的病毒樣顆粒是在細(xì)胞內(nèi)被裝配的。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中的植物細(xì)胞是從一組包括西紅柿、馬鈴薯、香蕉和胡蘿卜細(xì)胞中選擇出來(lái)的。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中的植物表達(dá)載體被整合入植物細(xì)胞的細(xì)胞核基因組中。
52.一種植物種子，包含有權(quán)利要求48所述的植物表達(dá)載體。
53.一種免疫原性成分，包含有權(quán)利要求19或48所述的植物細(xì)胞。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的免疫原性成分，其中呈現(xiàn)在植物組織中的植物細(xì)胞，是從一組包括果實(shí)、葉片、塊莖、植物器官、種子原生質(zhì)體和愈傷組織中選擇出來(lái)的。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的免疫原性成分，包含有植物細(xì)胞的汁液或者提取物。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的免疫原性成分，進(jìn)一步包含有一種佐劑。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的免疫原性成分，其中的佐劑是作為一種帶有一免疫原性成分抗原的融合蛋白被表達(dá)的。
58.一種在哺乳動(dòng)物中激發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括給哺乳動(dòng)物服用權(quán)利要求53中的免疫原性成分，其中的免疫應(yīng)答是被激發(fā)的。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中的免疫原性成分是口服服用的。
60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中的服用包括含有食用轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞。
61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中的多肽的服用方式，是從一組包括肌肉內(nèi)、口服、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、鼻腔內(nèi)的服用方式中選擇出來(lái)的。
62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，進(jìn)一步包含有佐劑的服用步驟。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中的佐劑是從一組包括霍亂毒素(CT)、埃希氏大腸桿菌熱易變性毒素(LT)、抗獨(dú)特型抗體2F10、移生因子、志賀氏菌樣毒素和intimin中選擇出來(lái)的。
64.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中免疫應(yīng)答的激發(fā)，是從一組包括體液的、粘膜的、細(xì)胞的、體液和粘膜的、體液和細(xì)胞的、粘膜和細(xì)胞的、以及體液粘膜細(xì)胞的針對(duì)免疫原性成分的免疫應(yīng)答中選擇出來(lái)的。
65.一種分離重組在植物原料中有表達(dá)的HBsAg多肽的方法，包括把植物原料放入一種清潔劑中，清潔劑的濃度為高于0.1％并小于0.5％，由此，重組的HBsAg被分離出來(lái)。
66.一種轉(zhuǎn)基因植物或者轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，當(dāng)作為一種食物，食用4次或更少次時(shí)，可在哺乳動(dòng)物中激發(fā)一抗HBsAg血清抗體的量高于50毫國(guó)際單位/毫升的免疫應(yīng)答。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的轉(zhuǎn)基因植物或者植物細(xì)胞，其中的免疫應(yīng)答是初次免疫應(yīng)答。
68.根據(jù)權(quán)利要求66所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中的植物細(xì)胞，包括權(quán)利要求18或47所述的植物細(xì)胞。
69.一種轉(zhuǎn)基因植物或者植物細(xì)胞，當(dāng)作為一種食物，食用4次或更少次時(shí)，可在哺乳動(dòng)物中激發(fā)一血清抗HBsAg抗體水平至少增加4倍，或者應(yīng)達(dá)到高于500毫國(guó)際單位/毫升水平免疫應(yīng)答。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的轉(zhuǎn)基因植物或者植物細(xì)胞，其中的植物細(xì)胞包括權(quán)利要求18或47所述的植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含至少兩種表達(dá)盒的植物表達(dá)載體,該載體的功能是可降低多聚核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制。此外,還提供了包括HBsAg在內(nèi)的,有免疫原性多肽表達(dá)的新的植物表達(dá)載體。在可食用的植物組織中,植物表達(dá)載體,能用于產(chǎn)生包括HBsAg在內(nèi)的免疫原性多肽。當(dāng)植物組織被食用后,這種可食用的植物組織,能激發(fā)人和動(dòng)物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1378553SQ99816856
公開日2002年11月6日 申請(qǐng)日期1999年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月23日
發(fā)明者休·S·梅森, 亞斯明·塔那瓦拉, 查爾斯·喬爾·安特森, 伊麗莎白·里克特 申請(qǐng)人:博伊斯湯普生植物研究所, 健康研究公司 被以下專利引用 (2),