專利名稱：新孢蟲的血清學檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用受試血清與能和新孢蟲(Neospora caninum)反應(yīng)的蛋白質(zhì)作用的方法進行新孢蟲感染的血清學檢測。
背景技術(shù)：
在許多種動物中新孢蟲和剛地弓形體(Toxoplasma gondii)是密切相關(guān)的致病的原生動物寄生蟲。新孢蟲已經(jīng)被認為是牛和其他動物流產(chǎn)，神經(jīng)學相關(guān)的肢體缺陷和新生兒死亡率的原因。剛地弓形體是綿羊流產(chǎn)的常見原因。有效的控制新孢蟲病和弓形體病需要快速診斷。因此開發(fā)有效的針對新孢蟲的診斷試驗是重要的。
有幾種本領(lǐng)域已知的試驗?zāi)軌蚺袛鄤游锸欠褚呀?jīng)暴露過新孢蟲。但是，迄今沒有開發(fā)出可以區(qū)分新孢蟲天然血清陽性動物和新孢蟲接種動物和/或新孢蟲血清反應(yīng)陰性(未接種)動物的診斷試驗和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明首次提供一種區(qū)分新孢蟲天然血清陽性動物和新孢蟲疫苗接種過的動物的方法。本發(fā)明也提供用血清學測定判斷動物是否已感染新孢蟲的方法。
本發(fā)明一方面提供檢測血清樣品中新孢蟲抗體的方法，其通過將血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測血清中結(jié)合抗體的存在。
附圖簡述

圖1顯示對截短的BAG1-GST的Western印跡反應(yīng)泳道1抗全長BAG1-GST的兔抗血清(陽性對照)泳道2天然的( )血清反應(yīng)陰性母牛的血清(陰性對照)泳道3新孢蟲滅活疫苗免疫49天的母牛的混合抗血清泳道4新孢蟲減毒疫苗免疫49天的母牛的混合抗血清泳道5自然感染的血清反應(yīng)陽性的母牛的混合抗血清泳道6分子量標準(kDa)圖2顯示對截短的和全長的BAG1-GST的Western印跡反應(yīng)泳道1-4截短的BAG1-GST抗原泳道5分子量標準(kDa)泳道6-9全長BAG1-GST抗原泳道1，6天然的血清反應(yīng)陰性母牛的血清(陰性對照)泳道2，7新孢蟲滅活疫苗免疫119天的母牛的混合抗血清泳道3，8新孢蟲減毒疫苗免疫119天的母牛的混合抗血清泳道4，9自然感染的血清反應(yīng)陽性母牛的抗血清泳道5分子量標準(kDa)發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種測定系統(tǒng)，其能夠區(qū)分接種的和自然暴露于新孢蟲的血清反應(yīng)陽性動物。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)剛地弓形體和新孢蟲的蛋白只存在于天然血清反應(yīng)陽性的動物中。以本發(fā)明方法提供的測定結(jié)果為基礎(chǔ)，現(xiàn)在可以將新孢蟲血清反應(yīng)陰性的動物及以前用新孢蟲為基礎(chǔ)的疫苗接種過的動物(參見例如，美國序列第09/260,414號“減毒活新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考和美國序列第09/138,985號“新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考)與血清反應(yīng)陽性(即天然暴露的)動物可靠地區(qū)分和隔離。
暴露過新孢蟲的動物的血清會與剛地弓形體和新孢蟲蛋白以及它們的片段反應(yīng)。“反應(yīng)”意思是形成可檢測到的抗原-抗體復(fù)合物?？乖贵w復(fù)合物的形成是預(yù)示著動物天然感染了新孢蟲。以前接種過新孢蟲的動物的血清和天然新孢蟲血清反應(yīng)陰性的動物的血清不會與剛地弓形體和新孢蟲蛋白以及它們的片段反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供區(qū)分接種過(血清反應(yīng)陰性)和天然暴露于新孢蟲-血清反應(yīng)陽性的動物的方法。
而且，依照本發(fā)明，如果希望，可以基于本發(fā)明的測定結(jié)果對新孢蟲血清陽性動物進行接種。本發(fā)明所考慮的動物包括牛(cattle)，小牛(calves)，公牛(bulls)，母牛(cows)和閹牛(steer)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于母牛，最優(yōu)選，應(yīng)用于小牛。
按照本發(fā)明，源于剛地弓形體或新孢蟲的任何純化的，天然的或重組的慢殖子抗原或其片段，可被用作本發(fā)明的血清學測定的檢測抗原?！捌巍币馑际侨L的剛地弓形體或新孢蟲蛋白的部分肽段，其提供存在于動物血清中的抗體識別的表位。按照本發(fā)明，全長剛地弓形體或新孢蟲蛋白的截斷形式也理解為片段。
在一個實施方案中，全長慢殖子抗原谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(BAG-1)是檢測抗原，(SEQ ID NO.2)。在另一實施方案中，缺少BAG-1的N-末端28個氨基酸的截短的BAG-1-GST融合蛋白是檢測抗原，(SEQ IDNO.3)。在本領(lǐng)域中BAG-1也稱作BAG-5。本發(fā)明打算將自然感染新孢蟲的動物的抗血清或者接種過新孢蟲的動物的抗血清或者未經(jīng)過感染(uninfected)的抗血清用作試驗樣品。
按照本發(fā)明，當慢殖子抗原或其片段被固定在固相支持物上時，其反應(yīng)性便提供了檢測新孢蟲抗體的方法。特別是，本發(fā)明方法的進行可以通過將動物血清樣品與慢殖子-階段的蛋白或其片段接觸，然后反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，并用傳統(tǒng)的檢測和定量方法檢測反應(yīng)產(chǎn)生的復(fù)合物?！翱贵w”意思是能與抗原上特異表位結(jié)合的免疫球蛋白分子?？贵w可以是多克隆的混合物或者是單克隆的?？贵w可以是天然來源或者重組來源的完整的免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)部分。
已知有許多檢測抗原抗體復(fù)合物的量和/或其存在與否的方法，所有這些方法也是本發(fā)明所考慮的。例如，Western印跡測定的進行可以通過將抗原附著于固體支持物如硝酸纖維素紙上，將該紙與血清檢測樣品保溫，并檢測硝酸纖維素濾紙上在全長(約55kDa)或截短的(約51kDa)剛地弓形體BAG1-GST蛋白預(yù)期分子量處特異條帶存在與否。在兩個預(yù)期分子量處的任何一處存在條帶，都說明該動物是新孢蟲血清陽性。相反地，兩個預(yù)期分子量處的任何一處條帶都缺失說明該動物是接種過的。
本發(fā)明也考慮用Western印跡測定，其中將抗原附著在硝酸纖維素紙上并且將抗原用有染料附著的抗體染色。也可以使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，其中抗原或抗體是用酶標記的。本發(fā)明也打算用放射免疫測定法，其中抗原或抗體是用放射性元素標記的。
本發(fā)明打算提供檢測動物血清中新孢蟲抗體的存在/量或缺失的方法。因此，含有測定試劑(assay)和陽性和/或陰性反應(yīng)對照，和其他必需成分的診斷測定試劑盒可以按照本發(fā)明所講授來組合。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在不背離廣義描述的本發(fā)明的精神或范圍情況下，可以對具體實施方案所示的本發(fā)明進行許多變動和/或修改。因此，這些實施方案在各個方面只作說明而不是限制。
實施例1新孢蟲血清反應(yīng)陰性動物和新孢蟲接種動物的抗血清可以使用任何血清反應(yīng)陰性或PCR陰性動物的血清樣品，該動物隨后接受新孢蟲速殖子(tachyzoite)為基礎(chǔ)的改良活疫苗，滅活的或亞單位為基礎(chǔ)的疫苗。在本實施例中，經(jīng)有資格的獸醫(yī)診斷實驗室(Washington StateDiagnostic Lab，Pullman，WA)用診斷性ELISA試驗判定4個月齡小牛是血清反應(yīng)陰性。將小牛在0天和21天用基于速殖子的i)改良的、活的、減毒新孢蟲疫苗(USPTO專利申請第09/260,414號“減毒活新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考)，或者ii)滅活的、全細胞勻漿物新孢蟲疫苗(USPTO專利申請第09/138,985號“新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考)接種。兩種疫苗都是基于速殖子抗原的，以該抗原作為疫苗的保護成分。新孢蟲改良的、活的、減毒疫苗每劑含有5×107Ncts-8個速殖子并且皮下給予3個血清反應(yīng)陰性動物。新孢蟲滅活的勻漿物疫苗每劑含有100ug總速殖子蛋白，配制在皂角甙為基礎(chǔ)的佐劑中(750ug Quil A/150ug膽固醇)并經(jīng)皮下給予3個血清反應(yīng)陰性動物。接種后49和119天，將每種疫苗組的3個小牛的血清收集，匯集并分裝凍存于-20℃直至進行血清學測定試驗(參見實施例4)。
實施例2新孢蟲自然感染的，血清反應(yīng)陽性動物的抗血清可以使用任何自然感染的，血清反應(yīng)陽性或PCR陽性動物的血清樣品。在本實施例中，經(jīng)有資格的獸醫(yī)診斷實驗室(Washington State Diagnostic Lab，Pullman，WA)用診斷性ELISA試驗判定所購牛群中每個動物的血清學狀態(tài)。將該試驗報告為血清反應(yīng)陽性的21個動物進行鑒定。將每個血清反應(yīng)陽性動物的血清樣品收集，匯集，并分裝凍存于-20℃直至進行血清學測定試驗(參見實施例4)。
實施例3新孢蟲血清學試驗使用的慢殖子抗原可以使用任何純化的，天然的或重組的新孢蟲或剛地弓形體慢殖子蛋白(剛地弓形體慢殖子蛋白BAG1；Genebank編號U23944)。在本實施例中，使用剛地弓形體慢殖子抗原，BAG1(本領(lǐng)域也稱作BAG5)的兩種不同的重組制備的形式。第一種形式是用親和層析從大腸桿菌表達和純化的全長BAG1-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(S.F.Parmley，et.al.1995.Mol.Biochem.Parasit.73253-257，在此引入以作參考)。第二種形式是用親和層析從大腸桿菌表達和純化的、缺少頭28個氨基酸的截短的BAG1-GST融合蛋白(Parmley et al.，1995)。將純化的、重組的全長BAG1-GST和截短的BAG1-GST蛋白凍存在-20℃直至進行血清學測定試驗(實施例4)。
實施例4血清學試驗可以使用任何本領(lǐng)域已知的以抗體為基礎(chǔ)的檢測試驗(ELISA，競爭ELISA，RIA，Western印跡等等)。在本實施例中，使用Western印跡測定。將總量5mg的剛地弓形體全長BAG1-GST或截短的BAG1-GST蛋白溶解，與5×變性上樣緩沖液(Pierce，IL.)混合并上樣至預(yù)制的4-20％Tris-甘氨酸連續(xù)梯度凝膠(Novex，San Diego，CA)的1mm×2孔上。將凝膠按照生產(chǎn)商的說明書于125V電泳1.5小時。于25V持續(xù)1小時將凝膠印跡于20μM硝酸纖維素膜上(Bio-Read，Hercules，CA)。將膜干燥并切成同樣長度/寬度的條。將這些條在封閉緩沖液(含5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS))中室溫保溫過夜，用PBS洗滌，然后與血清檢測樣品(上面實施例1或2來源的)保溫。
將實施例1和2來源的分裝的血清檢測樣品在室溫溶解并用PBS配制成1∶200的新鮮制備的稀釋液。將天然的血清反應(yīng)陰性的母牛血清用作陰性對照(1∶200稀釋)?？谷LBAG1-GST的兔抗血清用作陽性對照(M.McAllister惠贈；M.McAllister，et.al.，1996.J.Parasitol.82(2)354-355)并在使用前用PBS作1∶12,500稀釋。
將每個試驗條(實施例3制備的)加入每個稀釋的血清樣品并于室溫保溫1小時。將所述條在含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中短暫洗滌2次并加入親和純化的、磷酸酶標記的山羊抗牛IgG 1∶400的PBS稀釋液(KPL，Gaithersburg，MD.)。于室溫保溫1小時后，將所述條在PBST中短暫洗滌2次，然后在磷酸酶底物BCIP/NBT(KPL，Gaithersburg，MD.)中保溫。適當顯色后(大約10分鐘)將所述條短暫放于雙蒸水中終止酶反應(yīng)。然后將所述條在空氣中干燥。結(jié)果如圖1所示。
實施例5血清學試驗的解釋血清學檢測陽性指示試驗血清樣品和新孢蟲或剛地弓形體慢殖子抗原之間特異反應(yīng)的存在。在本實施例中，通過判定在全長(大約55kDa)或截短的(51kDa)剛地弓形體BAG1-GST蛋白預(yù)期分子量處特異條帶的存在或缺失，來檢測實施例4中使用的條的特異反應(yīng)。
如圖1所示，泳道5，在與新孢蟲自然感染的牛匯集血清保溫的條中，存在大約52-55kDa的條帶，說明在新孢蟲自然感染的血清反應(yīng)陽性試驗樣品和截短的BAG1-GST慢殖子抗原之間有特異反應(yīng)。相反，圖1的泳道3和4，未檢測到抗55kDa BAG1-GST蛋白的反應(yīng)，說明新孢蟲接種的試驗樣品缺乏特異反應(yīng)。
如圖2所示，泳道4和9，在與新孢蟲自然感染的牛匯集血清保溫的條中，存在大約52-55kDa條帶，說明在新孢蟲自然感染的血清反應(yīng)陽性試驗樣品和截短的(泳道4)或全長的(泳道9)BAG1-GST慢殖子抗原之間有特異反應(yīng)。相反，圖2的泳道2和7，用新孢蟲滅活疫苗免疫119天的母牛匯集抗血清未檢測到抗任何一種形式BAG1-GST蛋白的反應(yīng)。相似地，圖2的泳道3和8，用新孢蟲減毒疫苗免疫119天的母牛匯集抗血清未檢測到抗任何形式BAG1-GST蛋白的反應(yīng)。
本發(fā)明中描述的對剛地弓形體重組慢殖子抗原反應(yīng)的差異證明利用慢殖子抗原的血清學試驗可以區(qū)分或診斷新孢蟲自然感染的和新孢蟲接種的動物。源自新孢蟲(例如SEQ ID No.1或2)或新孢蟲(例如SEQID No.3或4)的任何純化的，天然的或重組的慢殖子抗原或其片段，可被用作此診斷試驗的檢測抗原。任何源自新孢蟲自然感染的或新孢蟲接種的動物的抗血清可被用作此診斷試驗的試驗樣品。
序列表<110>輝瑞產(chǎn)品公司(PFIZER PRODUCTS INC.)<120>新孢蟲的血清學檢測<130>PC23020A<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1219<212>DNA<213>剛地弓形體(Toxoplasma gondii)<220>
<221>CDS<222>(219)..(905)<220>
<221>CDS<222>(303)..(905)<400>1tgcttttgcc aaaggagacc tgtgtgcaga ggacttcgct gctaaaaagc agaagagtgc 60acggcgtgtg tagctcagtg gcatttcggg actcggtctt gcgtcgttcg cgactggacg 120tcgtcgtctg tgagagcgtc aaactaggga gaaggggcgg gccagagcgt tcggaaaatt 180atctgcaaag cccaggtccc gtatgatatt caaaaaag atg gcg ccg tca gca tcg 236Met Ala Pro Ser Ala Ser1 5cat ccg ccg gga gct tgt cca ccg gga tgt acc aag cat cct gct act 284His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys Thr Lys His Pro Ala Thr10 15 20gcg aca gcc att tcc ccg agt gga gtg tgt ccc atg cgt gcg ttc cat 332
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Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys195 200<210>4<211>672<212>DNA<213>新孢蟲(Neospora caninum)<400>4cccctttctt ctctccgttt caagatgagc aagctcagca cagacggcct gaagaaggcc 60atcggagaga tcttggaggg ctcgcgggaa aagaagagaa agttcgtgga gaccgtcgag 120cttcagatcg gtttgaagga ttacgacacc caaagagaca agcgtttcag cggaagcgtg 180aggcttccta acgtcccccg cccccgcatg cgcgtgtgcg tgatgggaga tgctgtgcat 240tgcgagcaag caaaggagct gggactggaa ttcatggacg tggaggctat gaagaagttg 300aacaagaaca agaagcttgt gaagaaactc gcacggaagt acgacgcttt cctggcctcg 360caagtgttga ttccgcagat cccccgtctc ctgggtccgg gtcttaacaa ggcgggcaaa 420ttcccgacgc ttatcactca caacgataag ctcgaggata agattcagga natcaagagc 480tcaatcaaat tccaactcag aaaggtgcct gtgcatggtg tcgccgtcng gcacgtcgac 540atgacggagg agcaactgcg cgtgaacctg acactggcca tcaacttcct tgtctctctg 600ctgaagaaga actggaacag cgtgagaacg ctgcacatca agagcaccat gggcaagcct 660cagcagattt ac 67權(quán)利要求
1.區(qū)分天然新孢蟲血清反應(yīng)陽性動物與用新孢蟲接種的動物的一種方法，其包括從動物獲得血清樣品和將該血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測血清結(jié)合抗體的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述剛地弓形體蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述剛地弓形體蛋白包含SEQ ID NO3的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述剛地弓形體蛋白是BAG-1。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述剛地弓形體蛋白是BAG-5。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將所述蛋白附著于支持物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中檢測用以證明結(jié)合抗體存在的蛋白的步驟用Western印跡進行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中檢測用以證明結(jié)合抗體存在的蛋白的步驟用放射免疫測定法進行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中檢測用以證明結(jié)合抗體存在的蛋白的步驟用酶聯(lián)免疫吸附測定進行。
10.權(quán)利要求1的方法，進一步包括測定結(jié)合于所述蛋白的抗體的量。
11.對懷疑感染了新孢蟲的動物的診斷方法，其包括從動物獲得血清樣品和將該血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測血清結(jié)合抗體的存在。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述剛地弓形體蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或者SEQ ID NO3的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述剛地弓形體蛋白是BAG-1或者BAG-5。
14.檢測血清樣品中新孢蟲抗體的方法，其包括將該血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測血清中結(jié)合抗體的存在。
15.區(qū)分天然新孢蟲血清反應(yīng)陽性動物與用新孢蟲疫苗接種動物的一種方法，其包括從所述動物獲得血清樣品和將該血清與剛地弓形體蛋白片段接觸并檢測血清結(jié)合抗體的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及接種新孢蟲的動物的血清學檢測，其通過將受試血清與能和新孢蟲反應(yīng)的蛋白質(zhì)作用來進行。該蛋白可以是全長的天然或重組新孢蟲或剛地弓形體慢殖子融合蛋白或者是截短的融合蛋白或者是它們的片段。可以將該蛋白用于任何大量測定，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)，Western印跡和其他合適形式的免疫測定。
文檔編號G01N33/569GK1639574SQ02821627
公開日2005年7月13日 申請日期2002年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月31日
發(fā)明者戴維·A·布雷克, 黛安娜·M·里特 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司