專利名稱：用于治療由肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲引起的疾病的三嗪酮化合物的制作方法
背景技術(shù)：
自1970年以來，某些被懷疑引起動(dòng)物神經(jīng)性和/或致流產(chǎn)性疾病的原蟲特別受到關(guān)注。一些這類原蟲的成功分離和體外培養(yǎng)已被證實(shí)是困難的。例如，直到20世紀(jì)80年代晚期仍未實(shí)現(xiàn)由腦或腦脊髓液中的成功分離。在確定了感染大腦的寄生蟲會(huì)造成神經(jīng)性疾病和感染胎兒的寄生蟲會(huì)造成致流產(chǎn)疾病之后，需要有能穿過血-腦屏障和胎盤屏障而又不產(chǎn)生不利副作用的有效的抗原蟲藥物。很少幾種藥物能穿過動(dòng)物的血腦屏障或胎盤屏障。但是，本領(lǐng)域已知的能穿過血-腦屏障和/或胎盤屏障從而有效地治療大腦寄生蟲感染的藥物中很多有不利的副作用，故其使用不能不冒很大風(fēng)險(xiǎn)。因此，至今尚無經(jīng)批準(zhǔn)的能對這類神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病進(jìn)行有效治療的有效藥物。以下是關(guān)于寄生蟲疾病的簡要說明。
馬原蟲性腦脊髓炎(EPM)是馬的一種神經(jīng)性疾病，特易發(fā)生于處于緊張狀態(tài)的幼馬(例如純種賽馬和純種表演馬)，因此是對于養(yǎng)馬工業(yè)經(jīng)濟(jì)收入有重要影響的一種疾病。EPM最早是在20世紀(jì)70年代被認(rèn)識(shí)為一種疾病，但是一直到1991年才由患有EPM的馬中培養(yǎng)出病原體并被稱為神經(jīng)肉孢子蟲。1997年，由患EPM的馬的腦中分離出一種新孢子蟲屬，現(xiàn)在稱為馬新孢子蟲(Neospora hugesi)。因此提出EPM可由這種新認(rèn)識(shí)的生物體獨(dú)自引起，由神經(jīng)肉孢子蟲獨(dú)自引起，或由這二者一并引起。EPM最常造成動(dòng)作失調(diào)(共濟(jì)失調(diào))、虛弱和痙攣。這種疾病可以與幾乎任何神經(jīng)性病癥相似。它可用為特急的或慢性的病癥發(fā)生。慢性形式常常在發(fā)作時(shí)不知不覺間加劇，在病程到達(dá)晚期之前難以診斷并會(huì)導(dǎo)致死亡。在最輕微的情形，僅有的臨床癥狀可能是不很肯定的下肢跛行或輕微的呼吸雜音。在最嚴(yán)重的情形，馬不能吞咽或站立。現(xiàn)在已知，在最嚴(yán)重的情形，寄生蟲(如神經(jīng)肉孢子蟲)感染大腦并造成嚴(yán)重?fù)p傷。EPM的臨床癥狀是由寄生蟲產(chǎn)生的直接神經(jīng)元(腦和脊髓)損傷以及由炎癥細(xì)胞的浸潤、水腫及與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的裂殖子和分裂體有關(guān)的神經(jīng)元死亡造成的腦損傷引起的。目前，對于EPM的控制尚無認(rèn)可的有效或預(yù)防方法。曾使用過人用藥物甲氧芐啶-磺胺組合物。但這種治療是昂貴的，而且需要大量的反復(fù)用藥。
另一種雙孢子球蟲類寄生蟲-岡氏弓形蟲(鼠弓形蟲)已知有一段時(shí)間了，它最早是由貓的腸和肌肉組織中分離得到。這種寄生蟲的終寄主是貓，它可以長期窩藏該生物體并向其它動(dòng)物，包括牛、羊、豬和人，傳播卵囊。羊、牛和人的感染與流產(chǎn)及主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先滅獲得性疾病有關(guān)。近來還發(fā)現(xiàn)，它與懷孕期間受感染之前為血清陰性的受感染種貓生育的小貓的流產(chǎn)和畸形有關(guān)。非貓科寄主如牛、羊、豬和人不產(chǎn)生但會(huì)發(fā)育卵囊并可能受到速殖子和緩殖子對肌肉和腦的侵害，產(chǎn)生臨床疾病癥狀-神經(jīng)性癥狀和伴有胎兒缺陷的流產(chǎn)。曾報(bào)道，60％的貓對岡氏3形蟲呈血清陽性。同樣，對于弓形蟲病沒有認(rèn)可的治療或預(yù)防方法。
還有另一種雙孢子球蟲-犬新孢子蟲，在動(dòng)物中既造成神經(jīng)性疾病也造成致流產(chǎn)疾病。它最初在1988年由狗分離出來，以前曾將其與岡氏弓形蟲混淆。由這種寄生蟲引起的疾病在經(jīng)胎盤感染的幼犬中發(fā)生最嚴(yán)重，其特征是幼犬逐漸嚴(yán)重的癱瘓，特別是后肢；也可能發(fā)生多肌類和肝炎。最近已認(rèn)識(shí)到這種疾病是新生牛犢流產(chǎn)和神經(jīng)性肢體缺陷的主因。在流產(chǎn)的胎兒的腦、脊髓和心臟中可以看到非化膿性腦炎和心肌炎造成的微觀損傷。近來已確定犬新孢子蟲的終寄主是狗。目前對于狗或牛的犬新孢子蟲或馬的馬新孢子蟲尚無認(rèn)可的治療或預(yù)防方法。
本領(lǐng)域的已知文獻(xiàn)，包括上述文獻(xiàn)，沒有建議或提出使用諸如托曲珠利或托曲珠利一砜(近來稱為“Ponazuril”)等三嗪酮化合物治療受球蟲，或者更具體地說，治療受引起致流產(chǎn)病或神經(jīng)性疾病的肉孢子蟲感染的動(dòng)物而不會(huì)造成無法忍受的副作用。因此，需要有一種改進(jìn)的和安全的方法，用于治療受到表現(xiàn)為神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病的寄生蟲病折磨的動(dòng)物。
發(fā)明概要根據(jù)上述，本發(fā)明包括一種改進(jìn)的治療患病動(dòng)物的方法，所述動(dòng)物患有可以用三嗪酮化合物治療的寄生蟲神經(jīng)性疾病或致流產(chǎn)病，該方法包括對動(dòng)物施用的藥學(xué)有效量的化合物，所述的改進(jìn)包括三嗪酮化合物是Ponazuril。
本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上有效量”是指所施用的三嗪酮的數(shù)量高至足以抑制造成神經(jīng)性疾病和/或流產(chǎn)的寄生的原蟲(通常是球蟲)的體內(nèi)或體外生長。藥學(xué)上有效量控制了被感染組織中寄生蟲，因此使動(dòng)物的健康改善。
另外，本發(fā)明包括一種對感染寄生蟲的動(dòng)物進(jìn)行病后預(yù)防(metaphylactically)性治療的方法，該寄生蟲能引起可用Ponazuril治療的神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病。病后預(yù)防性治療包括采用病后預(yù)防有效的方案對動(dòng)物施用Ponazuril?！安『箢A(yù)防有效方案”是指長期以預(yù)定的間歇給藥方式施用三嗪酮化合物，直至該動(dòng)物通過，例如產(chǎn)生保護(hù)性免疫響應(yīng)或清除寄生蟲而克服了入侵的寄生蟲。通常此方案將有效地控制寄生蟲和防止臨床病癥。病后預(yù)防有效劑量也可以長期服用5年或動(dòng)物的終生，尤其是在寄生蟲難以控制的情形。
本發(fā)明還包括一種單次高劑量治療動(dòng)物的方法。此方法包括向患有對用三嗪酮治療敏感的寄生蟲性神經(jīng)性病或致流產(chǎn)疾病的動(dòng)物施用藥學(xué)上有效量的單次高劑量Ponazuril。術(shù)語“單次高劑量”是指只施用一次的劑量。此劑量比治療性或病后預(yù)防性治療中使用的劑量高得多，對于控制寄生蟲引起的疾病有效，并且本身不產(chǎn)生不利作用，例如毒性。Ponazuril的單次高劑量高于10mg/kg。下面將更詳細(xì)地說明本發(fā)明的這一方面及其它方面。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及一種治療感染或患有寄生蟲疾病的動(dòng)物的方法，該疾病表現(xiàn)為可用三嗪酮化合物治療的神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病，所述方法包括向動(dòng)物施用藥學(xué)有效數(shù)量的Ponazuril。這些動(dòng)物的示例性而非限制性的實(shí)例有馬、牛、貓、狗、豬、羊、鳥、昆蟲和人。感染或引起疾病的寄生蟲是肉孢子蟲類的球蟲，它們可顯示為神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病。其示例性但非限制性的實(shí)例可選自肉孢子蟲屬、新孢子蟲屬和弓形蟲屬。肉孢子蟲屬通常是選自神經(jīng)肉孢子蟲、馬新孢子蟲、尤新孢子蟲和岡氏弓形蟲。原蟲性感染或疾病包括但不限于EPM、新孢子蟲病和弓形蟲病。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，治療由本文所述原蟲引起的寄生蟲感染或疾病使得神經(jīng)性和致流產(chǎn)性疾病的癥狀減輕。一般，這些癥狀包括跛行、動(dòng)作失調(diào)、癱瘓、流產(chǎn)、新生兒虛弱及其它相關(guān)病癥。對于治療性處理，已經(jīng)患有以上疾病癥狀的動(dòng)物用三嗪酮化合物進(jìn)行治療。通常治療期為約28-90天，優(yōu)選約28-60天。應(yīng)該清楚，對于治療性處理，治療方案可以是每天一次、每天二次或多次、每隔一天一次、甚至每周一次，這取決于諸如疾病的嚴(yán)重性和引起疾病的寄生蟲的種類。但是，在某些情形，治療方案可以無限延長，有時(shí)延至動(dòng)物的終生。在動(dòng)物受更具抗性的寄生蟲種系感染時(shí)，將會(huì)需要后一治療。但是，治療可以根據(jù)需要被延長更長時(shí)間，直到疾病的癥狀消除。優(yōu)選的治療是每天1次進(jìn)行約28天。
對病后預(yù)防性治療，受感染的動(dòng)物接受治療以使它們免于發(fā)生疾病的臨床表現(xiàn)。這種治療最終使動(dòng)物通過例如建立有效的免疫響應(yīng)獲得控制寄生蟲的能力，以防止進(jìn)一步感染，而不需要再服用Ponazuril。根據(jù)本發(fā)明，這種病后預(yù)防活性是指按照預(yù)定的間歇治療方案(病后預(yù)防有效的治療方案)使用三嗪酮化合物控制在前次治療后可能已感染了動(dòng)物的原蟲。因此，施行病后預(yù)防有效的治療方案以便通過例如殺死或減少原蟲的數(shù)目，降低它們引起疾病的能力。大體上，病后預(yù)防有效治療方案可以在動(dòng)物的終生每月施行約一次，或者直到在動(dòng)物內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)在的清除機(jī)制，例如有效的免疫響應(yīng)，以使它不受進(jìn)一步感染。后一情形可以在5年或更短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生。正如如理解的那樣，病后預(yù)防治療是以這樣的認(rèn)識(shí)為基礎(chǔ)的當(dāng)動(dòng)物受本文所述的原蟲感染時(shí)，在相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)(例如感染后2-6個(gè)月)它們不顯示臨床癥狀，例如神經(jīng)性癥狀或流產(chǎn)。相反，腸內(nèi)的原蟲感染在感染后不久就顯示出來。根據(jù)本發(fā)明，病后預(yù)防治療防止了寄生蟲寄居和引起臨床疾病。該治療方案是按照一種間歇的計(jì)劃，大約每月一次、每2個(gè)月1次或者每2周1次，劑量相當(dāng)于約1.0-100mg/kg，優(yōu)選為約1.0-25mg/kg，更優(yōu)選為約2.5-10mg/kg。特別是在有耐藥性的情形(例如動(dòng)物受耐藥種系感染時(shí))，會(huì)需要高劑量范圍。需要的劑量水平和治療期限屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的權(quán)限。對于患EPM的馬或患新孢子蟲病的牛，一種優(yōu)選的治療方案是每28天服用約1.0-25mg/kg、更優(yōu)選約2.5-10mg/kg三嗪三酮。
對于單次高劑量治療，Ponazuril以藥學(xué)上有效量給藥，該量大于10mg/kg，最高達(dá)約100mg/kg。本發(fā)明的一個(gè)鮮明的特點(diǎn)是本發(fā)明化合物可能是無毒的，因此可以以高劑量給藥。高劑量給藥的優(yōu)點(diǎn)是不需要反復(fù)給藥，而某些三嗪酮化合物如果以很高的劑量給藥會(huì)產(chǎn)生不利的副作用。
不受任何特定理論的約束，據(jù)信本發(fā)明所述的治療方法的出乎意料的成功是由于Ponazuril能穿過血一腦屏障或胎盤屏障。據(jù)認(rèn)為，本發(fā)明化合物容易穿過血-腦屏障，并且也能穿過胎盤屏障，原位殺死腦和腦脊髓液/脊隨中的原蟲。現(xiàn)有還發(fā)現(xiàn)，這類化合物即使在本發(fā)明所述的單次高劑量治療方案所需的高劑量下也是無毒和不引起突變的。
在此以前，還沒有經(jīng)濟(jì)合算的、易服用的藥物可用于有效治療和預(yù)防這些疾病而不在動(dòng)物中產(chǎn)生不可接受的副作用，例如毒性和突變性。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，Ponazuril可以以任何方便向動(dòng)物給藥的方式配制。適合口服給藥的制劑是優(yōu)選的制劑，它們可以是懸浮液、片劑、膠囊、凝膠、糊劑、大丸劑或粉末、顆粒或小丸形式的制劑。優(yōu)選的口服給藥制劑是糊劑或飼料添加物。其它可采用的給藥方式包括非腸道、局部、肌內(nèi)和粘膜內(nèi)給藥，或以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它途徑給藥。還優(yōu)選以澆潑的方式局部給藥。
通常，在制劑中使用藥學(xué)上可接受的載體和輔助劑。其實(shí)例可以是選自以下物質(zhì)的增稠劑Carbopol、無機(jī)增稠劑如硅酸鹽、膨潤土或膠體二氧化硅，以及有機(jī)增稠劑如脂肪醇或脂肪酸酯；潤濕劑，選自聚乙二醇和十二烷基硫酸鈉與Carbopol；更具體地說，對于本發(fā)明優(yōu)選的糊劑，Carbopo1974P是最優(yōu)選的增稠劑。還可以使用選自對羥基苯甲酸酯、醇和醛的防腐劑。它們可以是液體、固體或氣體物質(zhì)，此外它們呈惰性或者是醫(yī)學(xué)上可接受，并且與活性組分相容。
令人驚奇的是，本發(fā)明的糊劑在用于治療寄生蟲時(shí)有效。更具體地說，本發(fā)明的糊劑令人驚奇地使三嗪酮，特別是托曲珠利和Ponazuril釋放穿過血-腦屏障或胎盤屏障并攻擊已侵入大腦或感染懷孕動(dòng)物的胎兒的寄生蟲。為方便起見這里提供了本發(fā)明優(yōu)選的糊劑的一個(gè)具體實(shí)施方案及其制備方法的說明。本發(fā)明的一種優(yōu)選的糊劑包括三嗪三酮(例如Ponazuril)、丙二醇、增稠劑如Carbopol、防腐劑如對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯以及水的微粒化懸浮液。其制備可如下進(jìn)行將水(通常是純化水)和丙二醇混合后加熱至約70℃并在該溫度下加入防腐劑，將形成的混合物冷卻至室溫，然后加入Carbopol(優(yōu)選Carbopol 974P)，最后加入三嗪三酮，混合完畢后用氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)至約6.0。最優(yōu)選的糊劑含15％w/wPonazuril，20％w/w丙二醇、0.5％w/w Carbopol 974P、0.14％對羥基苯甲酸甲酯、0.02％w/w對羥基苯甲酸丙酯、0.1％w/w氫氧化鈉，其余為純化水?？梢约尤胩鹞秳ㄆ咸烟恰⒄崽?、乳糖、果糖、山梨糖醇、木糖醇、人造甜味劑和糖密以增進(jìn)可口性。另外，同樣可加入酵母或肝風(fēng)味劑。
用以下示例性而非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例表1單劑量托曲珠利在馬中的藥物動(dòng)力學(xué)
實(shí)施例2一種代表性的三嗪三酮Ponazuril(1-甲基-3-[4-對[三氟甲基)磺?；窖趸鵠間甲苯基]S-三嗪-2，4，6(1H，3H，5H)三酮)配制成糊劑用以對馬給藥。使用列在表2中的組分制備以下制劑。表2馬用Ponazuril糊劑的組分
制劑用方法(A)和(B)制備如下。第一種方法(A)包括1)將一部分水與聚丙二醇混合；2)加入防腐劑(對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯)；3)緩慢加入Carbopol 974P，直到得到均勻的懸浮液；4)加入微?；问降腜onazuril；5)加入氫氧化鈉使懸浮液的PH約為6.0；和6)加入剩余的水至體積足量。最終的懸浮液是糊狀形式，它可以向馬口服釋藥。
第二種方法(B)包括1)將一部分水與聚丙二醇混合；2)加熱至70℃；3)加入防腐劑(對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯)，同時(shí)保持溶液為70℃；4)將溶液冷卻至室溫；5)緩慢加入Carbopol974P，直到得到均勻的懸浮液；6)加入微粒化形式的Ponazuril；7)加入氫氧化鈉使懸浮液的PH約為6.0；和8)加入剩余的水至體積足量。最終的懸浮液是糊狀形式，它可以向馬口服釋藥。
形成的糊劑對馬施用，發(fā)現(xiàn)該糊劑可口并很受歡迎。
自然發(fā)生的EPM臨床病例通過特征描述和實(shí)驗(yàn)室診斷作全面鑒定。用來將EPM陽性馬納入這一實(shí)驗(yàn)的診斷如下由指示EPM的標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)病學(xué)檢查(包括放射照相法)確定的慢性神經(jīng)性失調(diào)缺陷；對神經(jīng)肉孢子蟲LgG的蛋白質(zhì)印跡陽性；紅血球計(jì)數(shù)低于500個(gè)/mL；CSF指數(shù)-總蛋白質(zhì)＜90，lgG指數(shù)＞0.3，AQ商數(shù)＜2.2。
其它要求是馬除了EPM外無它種疾病。因此，它們必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn)對于EHV-1，CSF陰性(＜1∶4)；對于維生素E，血清值正常(2.0μg/mL)；無癲癇發(fā)作；無行為障礙。
診斷過的馬隨機(jī)地分成幾組。第1組的馬每日以5mg/kg的劑量接受糊劑，第2組馬以10 mg/kg的劑量每日接受糊劑。治療劑量以體重為基礎(chǔ)。對馬進(jìn)行評(píng)價(jià)90天(中止治療后約60天)，以確定治療確實(shí)有效。用以下系統(tǒng)記錄對治療的響應(yīng)；1)0＝完全成功-臨床正常，CSF陰性；2)1＝在正常的步法下勉強(qiáng)發(fā)覺缺陷；3)2＝通過后退、轉(zhuǎn)向、擺動(dòng)、顎腰施壓和頸伸展，缺陷容易覺查和擴(kuò)大；4)3＝在散步，轉(zhuǎn)頭、腰部施壓或伸頸時(shí)，缺陷很突出；5)4＝跌絆、傾側(cè)和不由自主地跌倒；6)5＝躺著，不能站起。在此記分系統(tǒng)中，一個(gè)單位的改進(jìn)被認(rèn)為是明顯改善。
此研究的結(jié)果示于表3。在10mg/kg組內(nèi)治療了28天的所有的(100％)馬到用Ponazuril開始治療(第0天)后的90天都顯示出臨床評(píng)分的明顯改善。用5mg/kg劑量治療的9匹馬中的8匹(88.9％)顯示出有效的改善。當(dāng)把每組的各個(gè)治療日的評(píng)分相加，則得到總的評(píng)分。第1組馬和第2組馬的總分的改善大致相等。因此斷定，5mg/kg或10mg/kg的Ponazuril對于馬的EPM的主動(dòng)治療是有效的。
表3 EPM感染的馬對用托曲珠利-砜治療的響應(yīng)
實(shí)施例4為確定Ponazuril提供的保護(hù)的范圍，進(jìn)行了體外試驗(yàn)。評(píng)價(jià)了以下寄生蟲種系對該化合物的敏感性神經(jīng)肉孢子蟲SN3；鐮形肉孢子蟲SF1；岡氏弓形蟲RH；和犬新孢子蟲NC-1。Ponazuril在兩個(gè)濃度(1μg/ml和10μg/ml)下進(jìn)行試驗(yàn)。
在所有體外試驗(yàn)中都使用牛鼻甲骨(BT)細(xì)胞。細(xì)胞在25cm2燒瓶中于RMPI1640培養(yǎng)基中生長至融合，該培養(yǎng)基中補(bǔ)加了10％v/v胎牛血清(FBS)、100單位青霉素(G/ml)、100mg鏈霉素/ml和5×10-2mM的2-巰基乙醇。在細(xì)胞融合后，將細(xì)胞保持在FBS減量(2％v/v)的相同培養(yǎng)基中。將細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃于含有5％二氧化碳和95％空氣的潮濕氣氛中培養(yǎng)。
為了使寄生蟲生長，將單層BT細(xì)胞用寄生蟲感染并用倒置顯微鏡檢查損傷(細(xì)胞病變效應(yīng)，“CPE”)的發(fā)展或很多胞外裂殖子的存在。一旦觀察到損傷或存在很多胞外寄生蟲，則用5ml滴管的頭部刮取該單層，并將1-3滴這種含裂殖子的流體轉(zhuǎn)移到含新鮮BT細(xì)胞的2個(gè)燒瓶中。神經(jīng)肉孢子蟲和鐮形肉孢子蟲的裂殖子以這種方式每5-10天傳代一次，而岡氏弓形蟲和犬新孢子蟲的速殖子每3-4天傳代一次。
用來測定Ponazuril的效力的試驗(yàn)是微量滴定單層破壞試驗(yàn)(Mzcrotiter Monolayer Disrption Assay，MMDA)。用此試驗(yàn)確定寄生蟲或化合物對BT細(xì)胞是否有毒性。將平底96孔微量滴定板接種上BT細(xì)胞，形成的單層細(xì)胞用來確定托曲珠利和Ponazuril對裂殖子形成的影響，其方法同用CPE法測定一樣(蝕斑形成)。將單層細(xì)胞接種上寄生蟲(神經(jīng)肉孢子蟲或鐮形肉孢子蟲(50,000/孔)；岡式弓形蟲(10,000/孔)；犬新孢子蟲(20,000/孔))。所有各孔都在感染2小時(shí)后加入試驗(yàn)化合物。未處理和未感染的單層孔作為寄生蟲對照樣，而未感染的藥物處理的BT細(xì)胞則作為毒性對照樣。每種處理?xiàng)l件用六個(gè)重復(fù)樣檢驗(yàn)。逐日目測監(jiān)視各孔，當(dāng)未處理的裂殖子感染細(xì)胞有90-100％裂解(90-100％CPE)時(shí)，停止試驗(yàn)。將板的所有各孔均用磷酸緩沖鹽水(PBS)沖洗，在100％甲醇中固定5分鐘，隨后在結(jié)晶紫溶液中染色。裂殖子引發(fā)的破壞區(qū)域或因?yàn)槎拘栽斐傻腂T細(xì)胞死亡的區(qū)域不吸收結(jié)晶紫。使用ELISA板閱讀器定量確定結(jié)晶紫的結(jié)合量，用這些數(shù)據(jù)確定抑制破壞度達(dá)50％時(shí)的Ponazuril濃度(抑制濃度50或IC50)。顯示抑制作用的數(shù)據(jù)列在表4。該數(shù)據(jù)表明，低至1μg/ml的Ponazuril可以對由犬新孢子蟲、岡式弓形蟲和鐮形肉孢子蟲造成的細(xì)胞破壞提供100％的抑制，而對于由神經(jīng)肉孢子蟲造成的細(xì)胞破壞產(chǎn)生100％抑制則需要10μg/ml的Ponazuril。這說明，諸如托曲珠利和Ponazuirl等三嗪酮化合物對于治療由球蟲引起的、已知與神經(jīng)性和致流產(chǎn)性疾病綜合癥有關(guān)的疾病有效，這包括由神經(jīng)肉孢子蟲、犬新孢子蟲、馬新孢子蟲和岡氏弓形蟲引起的疾病。另外，Ponazuril對于BT細(xì)胞無毒性。
表4Ponazuil的體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)施例5進(jìn)行此實(shí)施例以便確定諸如托曲珠利等三嗪酮是否能通過血-腦屏障。將正常的馬分成三組，每組三匹馬。第一組馬按2.5mg/kg的劑量口服5％懸浮液形式的托曲珠利。第二組馬按5.0mg/kg的劑量口服5％懸浮液形式的托曲珠利。第3級(jí)馬按7.5mg/kg的劑量口服5％懸浮液形式的托曲珠利。每日用藥，共10天。在第48、96和240小時(shí)抽取血樣，測定血清中的托曲珠利、托曲珠利-亞砜和Ponazuril的濃度。治療開始10天后(第10天)，由各個(gè)馬取出腦脊髓液樣品，再次測定這些樣品中托曲珠利、托曲珠利-亞砜和Ponazuril的濃度。血清和腦脊髓液中的托曲珠利、托曲珠利-亞砜和Ponazuril的濃度列在表5a和5b中。在用托曲珠利治療以后，馬血和腦脊髓液中的Ponazuril濃度相當(dāng)高，其中腦脊髓液內(nèi)的Ponazuril濃度與托曲珠利本身的濃度大體相當(dāng)。這證明托曲珠利和Ponazuril都有效地穿過血腦屏障，而且Panazuril比托曲珠利更有效地穿過此屏障。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，這些數(shù)據(jù)暗示三嗪酮化合物也能有效地穿過胎盤屏障。表5a在反復(fù)施用托曲珠利后，馬中的藥物濃度
表5b在反復(fù)施用托曲珠利后，馬中的藥物濃度
雖然上面出于示例說明的目的對本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但是應(yīng)該清楚，這些細(xì)節(jié)只是為了示例說明，除非可能受到權(quán)利要求的限制，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出變動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種改進(jìn)的治療性處理患病動(dòng)物的方法，該動(dòng)物患有可以用三嗪酮化合物治療的原蟲神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病，所述方法包括對動(dòng)物施用藥學(xué)上有效量的該化合物，所述的改進(jìn)包括三嗪酮化合物是Ponazuril。
2.權(quán)利要求1的方法，其中寄生蟲疾病是由球蟲引起的。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的球蟲是肉孢子蟲的一個(gè)成員。
4.權(quán)利要求3的方法，其中肉孢子蟲的成員是選自肉孢子蟲、新孢子蟲和弓形蟲。
5.權(quán)利要求4的方法，其中肉孢子蟲是選自肉孢子蟲屬，新孢子蟲是選自新孢子蟲屬，弓形蟲是選自弓形蟲屬。
6.權(quán)利要求5的方法，其中肉孢子蟲屬是神經(jīng)肉孢子蟲，新孢子蟲屬是犬新孢子蟲或馬新孢子蟲，弓形蟲屬是岡氏弓形蟲。
7.權(quán)利要求4的方法，其中肉孢子蟲是造成馬原蟲腦脊髓炎的神經(jīng)肉孢子蟲。
8.權(quán)利要求4的方法，其中新孢子蟲是造成?；蛉骆咦酉x病的犬新孢子蟲。
9.權(quán)利要求4的方法，其中弓形蟲是岡氏弓形蟲。
10.一種改進(jìn)的病后預(yù)防性處理患病動(dòng)物的方法，該動(dòng)物患有可以用三嗪酮化合物治療的原蟲神經(jīng)或致流產(chǎn)性疾病，所述方法包括對動(dòng)物施用病后預(yù)防有效的三嗪酮化合物治療方案，所述的改進(jìn)包括該化合物是Ponazuril。
11.權(quán)利要求1或10的方法，其中Ponazuril分兩次或多次間歇給藥。
12.權(quán)利要求11的方法，其中的間歇給藥劑量是1.0-100mg/kg。
13.權(quán)利要求10的方法，其中施用Ponazuril直至動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性免疫。
14.權(quán)利要求1或10的方法，其中Ponazuril的施用量為2.5-10mg/kg。
15.權(quán)利要求1的方法，其中Ponazuril以大于10mg/kg的單次高劑量給藥。
16.權(quán)利要求1的方法，其中Ponazuril以每天2.5-10mg/kg的治療方案給藥28天。
17.一種治療組合物，其中包括(a)藥學(xué)上有效量的Ponazuril，用以治療對其敏感的患病動(dòng)物(b)一種載體，和(c)任選存的一種輔劑。
18.權(quán)利要求17的組合物，其形式為糊劑。
19.一種治療馬原蟲腦脊髓炎(EPM)的方法，該方法包括對懷疑患病的馬施用治療有效量的Ponazuril。
全文摘要
公開了對于易感染或者已患有能用三嗪酮化合物治療的諸如肉孢子蟲病或弓形蟲病等神經(jīng)性或致流產(chǎn)性疾病的動(dòng)物進(jìn)行治療性或病后預(yù)防性治療的方法,該方法是向動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的Ponazuril,包括單次高劑量治療。
文檔編號(hào)C07D251/00GK1342081SQ99814834
公開日2002年3月27日 申請日期1999年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者T·J·肯尼迪 申請人:美國拜爾公司