一種家蠶蠶卵微孢子蟲的lamp檢測引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組及其應(yīng)用。所述引物組包括外側(cè)引物EB1-F3/EB1-B3和內(nèi)側(cè)引物EB1-FIP/EB1-BIP，序列如SEQIDNO:1～4所示。本發(fā)明利用該引物建立了家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測方法和試劑盒，所述試劑盒包括上述引物組、2×反應(yīng)緩沖液、陽性對照品、陰性對照品、顯色液（或熒光染色液）、 Bst DNA聚合酶、密封液和無菌水。該方法檢測的結(jié)果可在自然光下肉眼觀察或瓊脂糖凝膠電泳觀察或?qū)崟r(shí)熒光曲線觀察判定。該方法操作簡單、檢測耗時(shí)短、結(jié)果易于判定，特異性強(qiáng)，能夠檢測濃度為5.0×10-3ng/μL的感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵DNA。
【專利說明】—種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]家蠶微粒子病是病原性的家蠶微孢子蟲(Ab1SeaaN.b)經(jīng)食下傳染或胚卵(胎)傳染，使家蠶感染發(fā)病的一種毀滅性疫病，也是目前影響我國蠶絲業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的經(jīng)濟(jì)損失十分慘重。同時(shí)，野外昆蟲微孢子蟲可交叉感染家蠶，并能在蠶體間以及不同蠶期間傳播，導(dǎo)致大批蠶種報(bào)廢，嚴(yán)重制約蠶種貿(mào)易和蠶業(yè)可持續(xù)發(fā)展，我國已將家蠶微粒子病列為進(jìn)出口動(dòng)物檢疫二類疫病的檢疫名錄。各地區(qū)蠶業(yè)主管部門和相關(guān)生產(chǎn)單位投入大量人力、物力和財(cái)力，采取傳統(tǒng)顯微鏡鏡檢母蛾，淘汰帶毒母蛾產(chǎn)下的蠶種的常規(guī)方法進(jìn)行防治家蠶微粒子病，但效果不佳。
[0003]最初人們判別家蠶是否感染家蠶微粒子病主要根據(jù)顯微鏡下組織研磨液中的微孢子蟲的形態(tài)和大小進(jìn)行的，這種方法也有效地遏制了世界各地蠶區(qū)微粒子病的流行，拯救了世界的養(yǎng)蠶業(yè)。而對于家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測主要是通過將產(chǎn)卵24h后的蠶卵浸酸處理，待蠶卵孵化收蟻后進(jìn)行顯微鏡檢測，這種方法不僅耗費(fèi)了大量時(shí)間，而且顯微鏡鏡檢的缺點(diǎn)是對操作人員的技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)要求較高，且很難將其他孢子類似物與家蠶微孢子蟲孢子區(qū)別開來。隨著PCR技術(shù)的普及，人們開始使用PCR方法來檢測家蠶微孢子蟲并且達(dá)到了較高的靈敏度。目前用于家蠶微粒子病PCR檢測的引物多是針對靶基因SSUrRNA的(Terry R S， Smith JE, Bouchon D, et al.Ultrastructural characterizat1n andmolecular taxonomy of Nosema granulosis sp.n., a transovarially transmitted,feminizing (TTF) microsporidium.J.Eukaryot.Microb1l.1999, (46): 492-499 ；Huang We1-Fone , Tsai Shu-Jen , Lo Chu-Fang , et al.The novel organizat1n andcomplete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis.Fungal Geneticsand B1logy, 2004.41(5): 473-481 )。但是劉吉平等(2004)(劉吉平，曹陽，Smith J.E.等.模擬感染家蠶微粒子病的PCR分子診斷技術(shù)研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37 (12):1925 - 1931)研究發(fā)現(xiàn)，基于16SrDNA保守區(qū)段設(shè)計(jì)的引物檢測蠶卵微孢子蟲，經(jīng)常會(huì)有非目的條帶及假陽性結(jié)果出現(xiàn)，推測蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質(zhì)干擾了對病原微孢子蟲基因組DNA有效擴(kuò)增。2013年本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)家蠶微孢子蟲轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，經(jīng)測序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了家蠶微孢子蟲EBl基因(登錄號:KF421134.1)(專利201410279223.6)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)以EBl基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)的PCR引物檢測蠶卵微孢子蟲并無非特異性條帶及假陽性結(jié)果，也達(dá)到了很好的檢測靈敏度。但是使用該基因設(shè)計(jì)的PCR引物對于家蠶微孢子蟲檢測操作步驟較多，且花費(fèi)時(shí)間較長，不適于野外檢測等缺點(diǎn)，不利于實(shí)際生產(chǎn)上廣泛地推廣和使用。更大的一個(gè)問題是現(xiàn)有公開的檢測引物均是以微孢子蟲的DNA為模板，但是微孢子蟲的分離和收集較復(fù)雜，耗時(shí)，極不利于大量檢測或現(xiàn)場檢測。
[0004]另一方面，微孢子蟲寄生于蠶卵中，且蠶卵含量明顯高于要檢測的微孢子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同時(shí)存在，家蠶蠶卵DNA對檢測造成嚴(yán)重的干擾，因此，如果想要直接以蠶卵DNA為模板進(jìn)行微孢子蟲的檢測，對檢測提出了更高的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有家蠶微孢子蟲檢測技術(shù)的不足，以家蠶微孢子蟲EBl基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)LAMP檢測引物用于檢測蠶卵微孢子蟲，提供一種比PCR檢測方法更加簡單和快速的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供所述LAMP檢測引物的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明再一目的是提供一種利用上述LAMP檢測引物組建立的家蠶微孢子蟲的檢測方法和試劑盒。
[0009]本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一組家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組，所述引物組包括一對外側(cè)引物EB1-F3/EB1-B3和一對內(nèi)側(cè)引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQID NO:1?4所示。
[0010]本發(fā)明還提供所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組在制備家蠶蠶卵微孢子蟲檢測試劑盒方面的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明提供了一種家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP檢測試劑盒，包括上述外側(cè)引物EB1-F3/EB1-B3和內(nèi)側(cè)引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQ IDNO:1?4所示。
[0012]所述試劑盒還包括2X反應(yīng)緩沖液、陽性對照品、陰性對照品、顯色液(或熒光染色液)、fci DNA聚合酶、密封液和無菌水。
[0013]優(yōu)選地，所述2 X反應(yīng)緩沖液的組分如下:20mM Tris_HCl，pH8.8 ；10mM KCl ；2 mMMgSO4 ；20mM (NH4) 2S04 ；0.1% Triton X-100 ；2.8mM dNTPs ; IM 甜菜堿；25mM MgCl20
[0014]優(yōu)選地,所述陽性對照品為EBl-DNA-pMD重組質(zhì)粒；所述陰性對照品為正常家蠶DNA。
[0015]所述EBl-DNA-pMD重組質(zhì)粒的制備:利用引物EBlF和EB1R，以家蠶微孢子蟲DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD-19T載體得到；
所述引物EBlF和EBlR的核苷酸序列如SEQ ID N0:5?6所示。
[0016]優(yōu)選地，所述顯色液為10000XSYBR Green I或熒光指示劑IXSYBR Green I。
[0017]優(yōu)選地，所述密封液為甘油。
[0018]另外，當(dāng)檢測結(jié)果的判定采用染色法或瓊脂糖凝膠電泳法時(shí)，所述試劑盒的反應(yīng)體系為:
2X反應(yīng)緩沖液12.5yL
引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
模板DNA2 μ L
ddH208.5 μ L ;
當(dāng)檢測結(jié)果的判定采用實(shí)時(shí)熒光法時(shí)，所述試劑盒的反應(yīng)體系為: 2X反應(yīng)緩沖液12.5yL
引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
熒光指示劑0.5 μ L
模板DNA2 μ L
ddH208 μ L ;
其中，所述引物EB1F3/B3的濃度為5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的濃度為20?40pmol/μ L。
[0019]建議:使用試劑盒時(shí)，對于N個(gè)樣品，應(yīng)配制(Ν+3)倍體積的反應(yīng)體系(包括陰性對照、陽性對照各一個(gè)，以及分裝耗費(fèi)誤差)，保證各反應(yīng)管分裝均勻。
[0020]所述試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為:63°C恒溫反應(yīng)40?90 min ;然后95°C，放置2min滅活。
[0021]采用本發(fā)明的方法或試劑盒檢測家蠶蠶卵微孢子蟲的方法包含以下步驟:
51.提取待測樣品的|旲板DNA;
52.配置反應(yīng)體系:按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行配置；
53.加樣:反應(yīng)體系分裝后，分別依次向反應(yīng)管加入ddH20(空白對照)、各模板DNAJH性對照品、陰性對照品；然后加入20 μ L密封液(對于染色法判定結(jié)果，要在反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)加入I μ L顯色液，將管蓋蓋緊，注意避免顯色液掉入反應(yīng)液中)；
54.反應(yīng):對于染色法和瓊脂糖凝膠電泳法判定結(jié)果的檢測，將反應(yīng)管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設(shè)備中，63°C恒溫放置60min，然后95°C，放置2min滅活；對于實(shí)時(shí)熒光法判定結(jié)果的檢測，將反應(yīng)管放入DeaoU-308C恒溫?zé)晒鈾z測儀或其他熒光檢測儀中，63°C恒溫放置40?90min觀察結(jié)果；
55.結(jié)果判讀:結(jié)果判讀可以有染色法(顯色法)、瓊脂糖凝膠電泳法和實(shí)時(shí)熒光法；
(O染色法:將反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)的顯色液彈入反應(yīng)管，與反應(yīng)產(chǎn)物混合；在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；反應(yīng)產(chǎn)物變?yōu)槌壬?，則不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(2)瓊脂糖凝膠電泳法:取2μ L反應(yīng)后的產(chǎn)物，與I μ L 6X loading buffer和8 μ LddH20混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳；若出現(xiàn)大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(3)實(shí)時(shí)熒光法:若有“S”型擴(kuò)增曲線且擴(kuò)增值超過設(shè)定的閾值為陽性，若擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增值未超過設(shè)定的閾值則為陰性。
[0022]本發(fā)明制備試劑盒的陽性對照品所采用的家蠶微孢子蟲DNA模板的制備，采用Qiagen公司植物小提試劑盒，方法參照說明書進(jìn)行。具體地包括以下步驟:
51.取微孢子蟲樣品200μ L，12，OOOrpm,離心5min,棄上清；然后加50 -1OOyL ddH20
重懸；
52.吸取重懸的孢子液至預(yù)冷的研缽中，液氮充分研磨(3次以上)；
53.將研磨后孢子放入1.5mL離心管中，加入400 μ L裂解緩沖液API和4 μ LRNase Α,渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ L RNase A勿在使用前混合)； 54.混勻后的溶液，65°C，孵育10min (期間上下顛倒試管2?3次)；
55.加130μ L緩沖液Ρ3，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，離心5 min ；
56.吸取上清于過濾柱中，14，OOOrpm,離心2min；
57.將離心管中上清液移至新的回收管(勿攪動(dòng)出現(xiàn)的殘?jiān)?，加入1.5倍體積的緩沖液AWl，移液器混合；
58.將650μ L混合液移至娃膠吸附柱中，4，200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復(fù)此步驟；
59.將娃膠吸附柱放入新回收管中，加入500μ L緩沖液AW2,4，200 rpm,離心I min;
棄上清；
510.再加入500μ L緩沖液AW2,14, 000 rpm，離心2 min (保證收集管不接觸到底部上清)；
511.移吸附柱至1.5mL或2mL離心管中；
512.加入40μ L洗脫緩沖液AE,室溫放置5 min ;4，200 rpm, I min ；
513.重復(fù)步驟S12，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0023]本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)(專利201410279223.6)，以家蠶微孢子蟲EBl基因(登錄號:KF421134.1)為靶序列設(shè)計(jì)的PCR引物可很好的用于檢測蠶卵微孢子蟲，無非特異性條帶及假陽性結(jié)果，也達(dá)到了很好的檢測靈敏度。但是一方面其所設(shè)計(jì)的PCR引物對于家蠶微孢子蟲檢測操作步驟較多，且花費(fèi)時(shí)間較長。另一方面我們對于微孢子蟲檢測的特異性和靈敏性并不滿足。
[0024]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)是日本學(xué)者Notomi等(2000)發(fā)明的一種新型體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。LAMP法具有特異性強(qiáng)、快速、高效、敏感性高、操作簡便、檢測方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，肉眼即可判斷結(jié)果，從而簡化了檢測過程，檢測時(shí)間也大大縮短。其中，對于LAMP檢測方法，引物是最關(guān)鍵的一個(gè)因素。靶基因序列的選擇、引物的設(shè)計(jì)及選擇的好壞直接影響到檢測結(jié)果的好壞。即使是針對同一種靶基因序列，如何選擇合適的六個(gè)區(qū)域，并設(shè)計(jì)出合適的四條引物序列，對檢測靈敏度具有非常至關(guān)重要的作用和很大的意義。本發(fā)明人前期就是設(shè)計(jì)了一系列的多組LAMP引物，又考慮了各種因素并結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，篩選出3組LAMP引物。進(jìn)一步地，本發(fā)明人最終確定了最優(yōu)的四條特異性引物，即引物組III的四條特異性引物作為LAMP檢測用引物組。
[0025]所述引物組III四條引物序列為:
EB1-F3 (SEQ ID NO:1 所示):5’- GGTCAACAGTAGAAAAGAGT-3’
EB1-B3 (SEQ ID 吣:2所示):5’_ TGCAATTAAAAAGGCTTGAA-3’
EBl-FIP(Flc+F2) (SEQ ID N0:3 所示):
5’-AGCATTTCCTTTCCCTAAATCTTCT-TAGTGAATTGGTTTAATGATCTCGG-3’
EBl-BIP(Blc+B2) (SEQ ID N0:4 所示):
5’-TTCTCAAATCCACCATACTTTCCCT-GATACTCGTATTCATTGGAAGGTT-3’
因此，上述用于微孢子蟲檢測的LAMP檢測引物組是本發(fā)明人在前期獲得家蠶微孢子蟲EBl基因及其在檢測家蠶蠶卵是否感染家蠶微孢子蟲中的應(yīng)用的基礎(chǔ)上，通過大量的探索和研究得到的，不僅克服了普通PCR操作復(fù)雜、依靠昂貴儀器的缺陷，更重要的是，本發(fā)明最大的創(chuàng)新點(diǎn)在與:1)相對于普通PCR法，本發(fā)明耗時(shí)短，檢測結(jié)果更易判定；2)相對于現(xiàn)有的LAMP的方法應(yīng)用于微孢子蟲的檢測所使用的引物，本方法所用引物直接以家蠶蠶卵DNA為模板，不僅很好的克服了家蠶蠶卵DNA對檢測造成的干擾，使檢測結(jié)果更加可靠，且靈敏度非常好?？傊?，該方法操作簡單、檢測耗時(shí)短、結(jié)果易于判定，特異性強(qiáng)，能夠檢測感染了家蠶微粒子病的I粒蠶卵。
[0026]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明公開了一組用于家蠶微孢子蟲檢測的LAMP引物組，是以EBl基因序列為靶基因設(shè)計(jì)EB1F/1R引物，使用該P(yáng)CR引物驗(yàn)證靶基因的特異性，結(jié)果表明該引物具有特異性，再以該引物為參考，EBl基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)多組LAMP引物，根據(jù)LAMP引物的設(shè)計(jì)原則以及各組引物的擴(kuò)增序列位置篩選出3組LAMP引物，然后根據(jù)引物的有效性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選出一組即四條特異性引物作為LAMP檢測用引物，即外側(cè)引物EB1-F3/EB1-B3和內(nèi)側(cè)引物EB1-FIP/EB1-BIP ;同時(shí)在只有四條特異性引物完全識別靶基因的6個(gè)區(qū)域的情況下，才能進(jìn)行擴(kuò)增，從而保證了其對家蠶微孢子蟲EBl基因擴(kuò)增的特異性和檢測的全面性。
[0027]本發(fā)明利用該LAMP引物組進(jìn)一步建立了微孢子蟲的LAMP快速檢測方法及試劑盒，以四條LAMP引物、LAMP試劑和顯色液或熒光染色液等，構(gòu)成檢測反應(yīng)體系，在63 °C的恒溫條件下，快速擴(kuò)增模板DNA，能夠檢測濃度為5.0X 10_3ng/ μ L的感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵DNA，能夠檢測12拷貝/ μ L的重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD，添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵I粒時(shí)，即可檢測到。對微孢子蟲的檢測靈敏度又提高了一個(gè)數(shù)量級，這對微孢子蟲的檢測具有重要的意義。
[0028]更重要的是，微孢子蟲樣品寄生于蠶卵中，且蠶卵含量明顯高于要檢測的微孢子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同時(shí)存在，對檢測提出了更高的要求。因此，本發(fā)明最大的創(chuàng)新點(diǎn)就在與:直接以添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵DNA為模板進(jìn)行微孢子蟲檢測，省去了微孢子蟲分離的復(fù)雜耗時(shí)步驟，本方法所用引物不僅很好地避免克服了家蠶蠶卵DNA對檢測造成的干擾，使檢測結(jié)果更加可靠，且檢測靈敏度非常好。
[0029]本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，采用恒溫?cái)U(kuò)增，不需要像PCR儀一樣擴(kuò)增程序復(fù)雜且價(jià)格昂貴的擴(kuò)增儀器。本發(fā)明對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，整個(gè)反應(yīng)可在40?90min內(nèi)完成，大大縮短了檢測時(shí)間。進(jìn)一步降低了微孢子蟲檢測的人力物力成本。
[0030]本發(fā)明的檢測方法對檢測結(jié)果的判定有多重選擇，且均易于觀察判定:(1)顯色法:在反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液，通過直觀的顯色反應(yīng)，可以在自然光下肉眼觀察判讀檢測結(jié)果；(2)瓊脂糖凝膠電泳法:根據(jù)電泳條帶可以更加直觀的觀察反應(yīng)結(jié)果，且更有說服力，對于假陽性檢測結(jié)果也可以輕易地排除掉，但是電泳操作前的開蓋加樣要與配置反應(yīng)體系在不同房間進(jìn)行，以減少開蓋后對以后的實(shí)驗(yàn)造成不必要的污染；(3)實(shí)時(shí)熒光法，可以通過擴(kuò)增曲線直觀的判斷結(jié)果，且對于濃度高的樣品結(jié)果的判定可以提前結(jié)束，減少了不必要的時(shí)間浪費(fèi)，但是儀器價(jià)格較為昂貴，對于經(jīng)費(fèi)比較充足的實(shí)驗(yàn)室或者公司可以使用。
[0031]綜上所述，本發(fā)明所述的家蠶病原微孢子蟲的LAMP快速檢測方法，操作簡單、耗時(shí)短、不需要復(fù)雜的儀器及復(fù)雜的擴(kuò)增程序、雜質(zhì)對擴(kuò)增的干擾較小且反應(yīng)結(jié)果易于判定，特異性強(qiáng)，為應(yīng)用LAMP技術(shù)進(jìn)行家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測和保證蠶種的質(zhì)量提供重要基礎(chǔ)和技術(shù)儲(chǔ)備，不僅適合于現(xiàn)場或野外檢測，利于實(shí)際生產(chǎn)上廣泛地推廣和使用，還能較好地滿足科研院校、蠶種生產(chǎn)單位及蠶種質(zhì)檢中心的檢毒需要，易于大范圍推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為兩條PCR引物檢測健康蠶卵和添毒蠶卵的電泳圖，M:DL 2000 DNA Marker ；1:添毒家蠶蠶卵DNA ；2:家蠶微孢子蟲DNA ；3:正常家蠶蠶卵DNA ；4:ddH20。
[0033]圖2為普通PCR引物及本發(fā)明初選的三組LAMP引物組在EBl基因上的位置示意圖。
[0034]圖3為本發(fā)明的四條LAMP引物在靶基因序列上的位置示意圖。
[0035]圖4為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照(重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD )的結(jié)果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測結(jié)果)。
[0036]圖5為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照(重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD )的結(jié)果(顯色法檢測結(jié)果)。
[0037]圖6為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度陽性對照(重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD )的結(jié)果(實(shí)時(shí)熒光法檢測結(jié)果)。
[0038]圖7為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵DNA的靈敏性結(jié)果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測結(jié)果)。
[0039]圖8為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵DNA的靈敏性結(jié)果(顯色法檢測結(jié)果)。
[0040]圖9為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP快速檢測法檢測不同濃度感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵DNA的靈敏性結(jié)果(實(shí)時(shí)熒光法檢測結(jié)果)。
[0041]圖10為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同粒數(shù)添毒蠶卵的檢測結(jié)果(瓊脂糖凝膠電泳法檢測結(jié)果)。
[0042]圖11為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同粒數(shù)添毒蠶卵的檢測結(jié)果(顯色法檢測結(jié)果)。
[0043]圖12為本發(fā)明家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP可視化快速檢測試劑盒檢測不同粒數(shù)添毒蠶卵的檢測結(jié)果(實(shí)時(shí)熒光法檢測結(jié)果)。

【具體實(shí)施方式】
[0044]以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試齊U、方法和設(shè)備。
[0045]除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
[0046]實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室通過轉(zhuǎn)錄組測序方法并通過克隆測序方法驗(yàn)證的家蠶微孢子蟲EBl基因(Access1n number:KF421134.1)序列,通過BLAST軟件進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)并無相似性序列，本發(fā)明以該基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了一組PCR引物:引物EBIF和EBIR。
[0047]引物EBlF的序列(SEQ ID NO: 5所示)為:
5， GGTCAACAGTAGAAAAGAGTTAGTG 3，
引物EBlR的序列(SEQ ID NO:6所示)為:
5’ CTTCTTCTAAATCCTCAATTCTCTT 3’ 2、使用上述PCR引物檢測健康蠶卵和感染了家蠶微孢子蟲的蠶卵，結(jié)果顯示，該引物對于家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測具有特異性(如附圖1所示)。
[0048]因此基于該P(yáng)CR引物擴(kuò)增片段位置，以EBl基因?yàn)長AMP引物設(shè)計(jì)的靶基因，使用在線軟件 Primer ExplorerV4 (http: //primerexplorer.jp/elamp4.0.0 /index.htmL),設(shè)計(jì)多組LAMP引物，根據(jù)LAMP引物的設(shè)計(jì)原則以及各組引物的擴(kuò)增序列位置篩選出3組LAMP引物，即引物組1、引物組II和引物組III。
[0049]( I)引物組I四條引物序列為:
1F3:5’ - CTTCCAATGAATACGAGTA-3’
1B3:5’- CATCTTGTCTTCTTCTGTT-3’
IFIP:5’- CTCTACTGGAAAATACAATTCAA-AGAATATGAAGATAATTCAAGCC-3，
IBIP:5’- AGAAGTAGCTCAAAAGTTGT-ACTTTACTTTTCCCATAACTCA-3’
(2)引物組II四條引物序列為:
2F3:5’- GAGTAAATCTATCTCAGAATGT-3’
2B3:5’- CGCCTTAAATTTACAAATCTCAAGA-3’
2FIP:5’- CAAGCTTCTCGATCAAGTG-CCAAAAGAATCTCCTAAAAAACCG-3，
2BIP:5’- ATGCAAGATGAAGAAAAAAAGAG-CTTTTTCATTAATGGTCTCT-3’
(3)引物組III四條引物序列為:
EB1-F3 (SEQ ID NO:1 所示):5’- GGTCAACAGTAGAAAAGAGT-3’
EB1-B3 (SEQ ID 吣:2所示):5’_ TGCAATTAAAAAGGCTTGAA-3'
EBl-FIP(Flc+F2) (SEQ ID N0:3 所示):
5’- AGCATTTCCTTTCCCTAAATCTTCT-TAGTGAATTGGTTTAATGATCTCGG-3’
EBl-BIP(Blc+B2) (SEQ ID N0:4 所示):
5’- TTCTCAAATCCACCATACTTTCCCT-GATACTCGTATTCATTGGAAGGTT-3’
上述普通PCR引物及本發(fā)明初選的三組LAMP引物組在EBl基因上的位置示意圖如附圖2所示。
[0050]3、然后根據(jù)引物的有效性實(shí)驗(yàn)，又考慮了各種因素并結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，進(jìn)一步篩選出引物組III的四條特異性引物作為LAMP檢測用引物，該引物組在靶基因序列上的位置示意圖如附圖3所示。
[0051]實(shí)施例2試劑盒制備
1、家蠶微孢子蟲DNA模板的制備，采用Qiagen公司植物小提試劑盒，方法參照說明書進(jìn)行。具體地包括以下步驟:
51.取微孢子蟲樣品200μ L，12，OOOrpm，離心5min，棄上清；然后加50?100 μ L ddH20重懸；
52.吸取重懸的孢子液至預(yù)冷的研缽中，液氮充分研磨(3次以上)；
53.將研磨后孢子放入1.5mL離心管中，加入400 μ L裂解緩沖液API和4 μ LRNase Α,渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ L RNase A勿在使用前混合)；
54.混勻后的溶液，65°C，孵育10min (期間上下顛倒試管2?3次)；
55.加130μ L緩沖液Ρ3，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm，離心5 min ；
56.吸取上清于過濾柱中，14，OOOrpm，離心2min； 57.將離心管中上清液移至新的回收管(勿攪動(dòng)出現(xiàn)的殘?jiān)?，加入1.5倍體積的緩沖液AWl，移液器混合；
58.將650μ L混合液移至娃膠吸附柱中，4，200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復(fù)此步驟；
59.將娃膠吸附柱放入新回收管中，加入500μ L緩沖液AW2,4，200 rpm,離心I min;
棄上清；
510.再加入500μ L緩沖液AW2,14, 000 rpm，離心2 min (保證收集管不接觸到底部上清)；
511.移吸附柱至1.5mL或2mL離心管中；
512.加入40μ L洗脫緩沖液AE,室溫放置5 min ;4，200 rpm, I min ；
513.重復(fù)步驟S12，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0052]2、制備陽性和陰性對照品
用上游引物EBlF和下游引物EBlR為反應(yīng)引物，以家蠶微孢子蟲DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD-19T載體獲得EBl-DNA-pMD質(zhì)粒并作為檢測的陽性對照品。
[0053]提取的正常家蠶DNA作為陰性對照品。
[0054]3、其他試劑
(1)2X反應(yīng)緩沖液
組分如下:20mM Tris-HCl，ρΗ8.8 ；10mM KCl ；2 mM MgSO4 ；20mM(NH4)2S04 ；0.1% TritonX-100 ；2.8mM dNTPs ;1M 甜菜堿；25mM MgCl20
[0055](2)顯色液 10000XSYBR Green I (或熒光指示劑 IXSYBR Green l\Bst DNA 聚合酶、密封液甘油和無菌水。
[0056]4、試劑盒組裝
按照一定的規(guī)格，將以下組分進(jìn)行分裝:用引物組EB1F3/B3作為外部引物，EBlFIP/BIP 作為內(nèi)部引物(EB1F3/B3 濃度為 5pmol/y L, EB1FIP/BIP 濃度為 20 ?40 pmol/μ L),2X反應(yīng)緩沖液，陽性對照品，陰性對照品，DNA polymerase (8U/μ L)，密封液，顯色液(10000 X SYBR Green I);熒光指示劑(I X SYBR Green I);滅菌ddH20。即為家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP快速檢測試劑盒的所有檢測試劑。
[0057]實(shí)施例3試劑盒檢測方法
1、所述試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為:63°C恒溫反應(yīng)40?90 min ;然后95°C，放置2 min滅活。
[0058]2、當(dāng)檢測結(jié)果的判定采用染色法或瓊脂糖凝膠電泳法時(shí)，所述試劑盒的反應(yīng)體系為:
2X反應(yīng)緩沖液12.5yL
引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
模板DNA2 μ L
ddH208.5 μ L ;
當(dāng)檢測結(jié)果的判定采用實(shí)時(shí)熒光法時(shí)，所述試劑盒的反應(yīng)體系為:
2X反應(yīng)緩沖液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L
Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L
熒光指示劑0.5 μ L
模板DNA2 μ L
ddH208 μ L ;
其中，所述引物EB1F3/B3的濃度為5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的濃度為20?40pmol/μ L。
[0059]建議:使用試劑盒時(shí)，對于N個(gè)樣品，應(yīng)配制(Ν+3)倍體積的反應(yīng)體系(包括陰性對照、陽性對照各一個(gè)，以及分裝耗費(fèi)誤差)，保證各反應(yīng)管分裝均勻。
[0060]3、檢測步驟如下:
51.提取待測樣品的|旲板DNA;
52.配置反應(yīng)體系:按照上述反應(yīng)體系進(jìn)行配置；
53.加樣:反應(yīng)體系分裝后，分別依次向反應(yīng)管加入2μL的ddH20(空白對照)、各模板DNA、陽性對照品；然后加入20 μ L密封液，(對于染色法判定結(jié)果，要在反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)加入IuL顯色液，將管蓋蓋緊(注意避免顯色液掉入反應(yīng)液中)；
54.反應(yīng):對于染色法和瓊脂糖凝膠電泳法判定結(jié)果的檢測，將反應(yīng)管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設(shè)備中，63°C恒溫放置60min，然后95°C，放置2 min滅活；對于實(shí)時(shí)熒光法判定結(jié)果的檢測，將反應(yīng)管放入DeaoU-308C恒溫?zé)晒鈾z測儀或其他熒光檢測儀中，63°C恒溫放置40?90min觀察結(jié)果；
55.結(jié)果判讀:結(jié)果判讀可以有染色法(顯色法)、瓊脂糖凝膠電泳法和實(shí)時(shí)熒光法；
(O染色法:將反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)的顯色液彈入反應(yīng)管，與反應(yīng)產(chǎn)物混合；在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；反應(yīng)產(chǎn)物變?yōu)槌壬瑒t不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(2)瓊脂糖凝膠電泳法:取2μ L反應(yīng)后的產(chǎn)物，與I μ L 6X loading buffer和8μ LddH2O混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳；若出現(xiàn)大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品含有家蠶蠶卵微孢子蟲；若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測樣品不含有家蠶蠶卵微孢子蟲；
(3)實(shí)時(shí)熒光法:若有“S”型擴(kuò)增曲線且擴(kuò)增值超過設(shè)定的閾值為陽性，若擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增值未超過設(shè)定的閾值則為陰性。
[0061]其中，步驟SI所述待測樣品，家蠶蠶卵及添加家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵模板DNA的制備方法(QIAGEN公司植物小提試劑盒):
取健康家蠶蠶卵或添食家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵樣品10?50粒，液氮充分研磨(3次以上)；將研磨后孢子放入1.5 mL離心管中，加入400 UL裂解緩沖液APl和4 μ LRNase Α,渦旋混勻(400 μ L裂解緩沖液APl和4 μ L RNase A勿在使用前混合);混勻后的溶液，65°C，孵育10 min (期間上下顛倒試管2?3次)；加130 μ L緩沖液Ρ3，混合后冰浴5 min ;然后14，000 rpm,離心5 min ;吸取上清于過濾柱中，14，OOOrpm,離心2min ;將離心管中上清液移至新的回收管(勿攪動(dòng)出現(xiàn)的殘?jiān)?，加入1.5倍體積的緩沖液AW1，移液器混合；將65(^ L混合液移至娃膠吸附柱中，4，200 rpm,離心I min ;剩下的液體重復(fù)此步驟；將硅膠吸附柱放入新回收管中，加入500 μ L緩沖液AW2，4，200 rpm，離心I min ;棄上清；再加入500 μ L緩沖液Aff2,14，000 rpm，離心2 min (保證收集管不接觸到底部上清);移吸附柱至1.5mL或2mL離心管中；加入40 μ L洗脫緩沖液AE，室溫放置5 min ；4, 200 rpm,I min;重復(fù)步驟S12，-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0062]實(shí)施例4應(yīng)用試劑盒檢測家蠶病原微孢子蟲 1、不同濃度陽性對照品檢測
利用實(shí)施例3的檢測方法，對不同濃度陽性對照(重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD)進(jìn)行檢測，結(jié)果如附圖4?6所示。圖中，M為DL2000 DNA Marker ; 1-7分別為稀釋16-1Oci拷貝/ μ L的重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD ；8為ddH20空白對照。
[0063]結(jié)果顯示，本發(fā)明的引物及其試劑盒能夠檢測12拷貝/yL的重組質(zhì)粒EBl-DNA-pMD。
[0064]2、檢測靈敏度
(I)利用實(shí)施例3的檢測方法，對不同濃度的感染微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵的DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果如附圖7?9所示。圖中，M為DL2000 DNA Marker ; 1-7分別為:5.0X 10° ng/μ L、5.0XlO-1 ng/μ L、5.0X 1(T2 ng/μ L、5.0 X l(T3ng/μ L、5.0 X 1(T4 ng/μ L、5.0 X l(T5ng/μ L,5.ΟΧΙΟ-6 ng/μ L ；8 為 ddH20 空白對照。
[0065]結(jié)果顯示，本發(fā)明的引物及其試劑盒能夠檢測濃度為5.0X 10_3 ng/μ L的感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵DNA。
[0066](2)利用實(shí)施例3的檢測方法，對不同粒數(shù)添毒蠶卵進(jìn)行檢測，結(jié)果如附圖10?12所示。圖中，M為DL2000 DNA Marker ; 1_4號管分別為添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的蠶卵I粒，5粒，10粒，20粒所提的DNA ；5為添毒家蠶蠶卵DNA ；6為正常家蠶蠶卵DNA ；7為ddH20空白對照。
[0067]結(jié)果顯示，本發(fā)明的引物及其試劑盒檢測特異性和靈敏性都很優(yōu)異，針對添毒后感染家蠶微孢子蟲的家蠶所產(chǎn)的一粒蠶卵所提的DNA都能夠很特異清晰的檢測出來。
[0068]綜上所述，本發(fā)明的引物及其試劑盒對家蠶蠶卵微孢子蟲的檢測靈敏度較優(yōu)異且耗費(fèi)時(shí)間較短，這對原種生產(chǎn)中家蠶微粒子病的快速檢測具有重要的意義。
【權(quán)利要求】
1.一組家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組，其特征在于，所述引物組包括一對外側(cè)引物EB1-F3/EB1-B3和一對內(nèi)側(cè)引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQID NO:1?4所示。
2.權(quán)利要求1所述家蠶蠶卵微孢子蟲的LAMP檢測引物組在制備家蠶蠶卵微孢子蟲檢測試劑盒方面的應(yīng)用。
3.一種家蠶蠶卵微孢子蟲LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括一對外側(cè)引物EB1-F3/EB1-B3和一對內(nèi)側(cè)引物EB1-FIP/EB1-BIP，所述引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括2X反應(yīng)緩沖液、陽性對照品、陰性對照品、顯色液或熒光染色液、Bst DNA聚合酶、密封液和無菌水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述2X反應(yīng)緩沖液的組分如下:20mMTris-HCl,pH8.8 ；10mM KCl ；2 mM MgSO4 ；20mM(NH4)2S04；0.1% Triton X-100 ；2.8mM dNTPs ；IM 甜菜喊；25mM MgCl20
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為EBl-DNA-pMD重組質(zhì)粒；所述陰性對照品為正常家蠶DNA ； 所述EBl-DNA-pMD重組質(zhì)粒的制備:利用引物EBlF和EB1R，以家蠶微孢子蟲DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD-19T載體得到； 所述引物EBlF和EBlR的核苷酸序列分別如SEQ ID N0:5?6所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述顯色液為10000X SYBR Green I或者熒光指示劑I X SYBR Green I。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述密封液為甘油。
9.根據(jù)權(quán)利要求3?8任一所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應(yīng)體系如下: 當(dāng)檢測結(jié)果的判定采用染色法或瓊脂糖凝膠電泳法時(shí)，反應(yīng)體系為: 2X反應(yīng)緩沖液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L 模板DNA2 μ L ddH208.5 μ L ; 當(dāng)檢測結(jié)果的判定采用實(shí)時(shí)熒光法時(shí)，反應(yīng)體系為: 2X反應(yīng)緩沖液12.5yL 引物 EB1F3/B3 和 EB1FIP/BIPI μ L Bst DNA 聚合酶 8U/ μ LI μ L 熒光指示劑0.5 μ L 模板DNA2 μ L ddH208 μ L ; 其中，所述引物EB1F3/B3的濃度為5pmol/yL，引物EB1FIP/BIP的濃度為20?40pmol/μ L。
10.根據(jù)權(quán)利要求3?8任一所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為:63°C恒溫反應(yīng)40?90 min ;然后95°C，放置2 min滅活。
【文檔編號】C12Q1/04GK104372082SQ201410592811
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】劉吉平, 程偉, 宋小景, 晏育偉 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)