一種用于鑒定新孢子蟲的lamp引物組及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種鑒定寄生蟲的LAMP引物組W及應(yīng)用所述引 物組鑒定寄生蟲的方法，具體設(shè)及一種鑒定新抱子蟲的LAMP引物組W及應(yīng)用所述引物組 鑒定新抱子蟲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 新抱子蟲屬于頂復(fù)口（F*h}dumApicomplexa)、抱子蟲綱（Sporozoasida)、球蟲 亞綱（Coccidia)、真球蟲目巧ucoccidiida)、肉抱子蟲科（Sarco巧stidae)、新抱子蟲屬 (化ospora)，其形態(tài)與弓形蟲相似，是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。1984年，Bjerkas于挪威的病犬 中首次發(fā)現(xiàn)此寄生蟲，但是并沒有對(duì)此寄生蟲進(jìn)行鑒別，誤認(rèn)為是弓形蟲。直到1988年，美 國學(xué)者Dubey發(fā)現(xiàn)感染此病與弓形蟲類似，但是其超微結(jié)構(gòu)與弓形蟲明顯不同，因?yàn)樵诨?有肌炎的病犬中發(fā)現(xiàn)，因此正式命名為犬新抱子蟲（N.caninum)。1999年，Tranas發(fā)現(xiàn)可W 在人的血清中檢測(cè)到新抱子蟲的抗體，但是目前還沒有在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新抱子蟲體的報(bào)道。 新抱子蟲是引起世界性范圍內(nèi)的奶牛及黃牛流產(chǎn)的主要原因之一，為養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng) 濟(jì)損失。目前最有效的防治的方法是通過對(duì)檢測(cè)后確定感染病及疑似患病牛進(jìn)行淘汰、焚 燒、掩埋等處理，建立無新抱子蟲感染的牛群。因此建立快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)新抱子蟲的方法 尤為重要。
[0003] 檢測(cè)新抱子蟲的方法主要有病原學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)等方法， 目前研究比較多的為分子生物學(xué)檢測(cè)，其中包括常規(guī)PCR、巧光PCR、基因忍片W及在它們 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的巢式PCR、二溫式PCR、實(shí)時(shí)巧光PCR等。運(yùn)些檢測(cè)方法共有的缺點(diǎn)如下： 反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)；隨著時(shí)間、環(huán)境的改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)污染、不穩(wěn)定等現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定新抱子蟲的LAMP引物組及其應(yīng)用。
[00化]本發(fā)明提供了一種引物組，由序列表的序列1所示的單鏈DNA分子（F3-1)、序列表 的序列2所示的單鏈DNA分子度3-1)、序列表的序列3所示的單鏈DNA分子（FIP-I)和序 列表的序列4所示的單鏈DNA分子度IP-1)組成。所述引物組的功能為如下（a)或化）： (a)鑒定或輔助鑒定新抱子蟲；化）檢測(cè)待測(cè)生物樣本中是否含有新抱子蟲。
[0006] 本發(fā)明還保護(hù)所述引物組在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的功能為如下（a) 或化）：(a)鑒定或輔助鑒定新抱子蟲；(b)檢測(cè)待測(cè)生物樣本中是否含有新抱子蟲。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組的試劑盒；所述試劑盒的功能為如下（a)或化）： (a)鑒定或輔助鑒定新抱子蟲；化）檢測(cè)待測(cè)生物樣本中是否含有新抱子蟲。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將所述引物組中的各條引物進(jìn)行獨(dú)立 包裝的步驟。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定或輔助鑒定新抱子蟲的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)提取待測(cè)微生物的基因組DNA;
[0011] (2)W步驟（I)提取的基因組DM為模板，采用所述引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增； 如果采用所述引物組可W實(shí)現(xiàn)W所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待測(cè)微生物為或候 選為新抱子蟲；如果采用所述引物組不能實(shí)現(xiàn)W所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增，待 測(cè)微生物為或候選為非新抱子蟲。
[0012] 所述待測(cè)微生物具體可為新抱子蟲、弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽己貝斯蟲或牛 瑟氏泰勒蟲。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)生物樣本中是否含有新抱子蟲的方法，包括如下步 驟：
[0014] (1)提取待測(cè)生物樣本的總DNA;
[0015] (2)W步驟（1)提取的總DNA為模板，采用所述引物組進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；如果 采用所述引物組可W實(shí)現(xiàn)W所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，所述待測(cè)生物樣本含有或疑 似含有新抱子蟲；如果采用所述引物組不能實(shí)現(xiàn)W所述總DNA為模板的特異性擴(kuò)增，所述 待測(cè)生物樣本不含有或疑似不含有新抱子蟲。
[0016] W上任一所述待測(cè)生物樣本具體可為離體的動(dòng)物樣本。
[0017] W上任一所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的25y1初始反應(yīng)體系中，F(xiàn)3的含量可為5pmol，B3 的含量可為5pmol，F(xiàn)IP的含量可為40pmol，BIP的含量可為40pmol。 陽0化]所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系具體可為（25y1):溶劑為40mMTris?肥1緩 沖液（抑8. 8);含模板DNAJOmMKCl、l6mM(NH4)2S〇4、〇. 2% (體積比）Tween2〇、l.6M甜菜 堿、16mMM拆04、2.SmMdNTP(指的是四種dNTP中每種的濃度）、16UBstDNApolymerase、 40pmolFIP、40pmolBIP、5pmolF3 和 5pmolB3。
[0019] W上任一所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件為：60-65°C，45-60min。
[0020] W上任一所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件具體為：63°C，60min。
[OOW"采用所述引物組可W實(shí)現(xiàn)W所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增"的判斷標(biāo)準(zhǔn)具 體如下：采用實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)，出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線。 陽02引"采用所述引物組不能實(shí)現(xiàn)W所述基因組DNA為模板的特異性擴(kuò)增"的判斷標(biāo)準(zhǔn)具 體如下：采用實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)，沒有出現(xiàn)陽性擴(kuò)增曲線。
[0023] 采用本發(fā)明提供的引物組并通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)新抱子蟲，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] ①高特異性：4條引物對(duì)新抱子蟲祀序列的6個(gè)特異區(qū)域的識(shí)別保證了LAMP擴(kuò)增 的高度特異性，能從相差僅一個(gè)核巧酸的基因標(biāo)本中找出相應(yīng)的祀序列進(jìn)行擴(kuò)增； 陽02引②高靈敏度：靈敏度比普通PCR高100倍；
[00%] ③結(jié)果鑒定簡(jiǎn)便：可通過濁度儀直接判斷結(jié)果，也可添加染料并通過用肉眼觀察 顯色情況；
[0027] ④操作簡(jiǎn)單：只要將檢測(cè)樣品（祀核酸）和檢測(cè)試劑一起放入60-65°C實(shí)時(shí)濁度 儀中45-60min后就可W判斷結(jié)果。
[0028] 本發(fā)明為新抱子蟲檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，可用于畜牧業(yè)生產(chǎn)單位篩查和檢測(cè) 新抱子蟲，具有廣闊的市場(chǎng)前景和較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益，適于大范圍推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)施例2的步驟一的結(jié)果。
[0030] 圖2為實(shí)施例2的步驟二的結(jié)果。
[0031] 圖3為實(shí)施例3的步驟一的結(jié)果。
[0032] 圖4為實(shí)施例3的步驟二的結(jié)果（本發(fā)明提供的方法）。
[003引圖5為實(shí)施例3的步驟二的結(jié)果（現(xiàn)有的PCR方法）。
[0034] 圖6為實(shí)施例4的結(jié)果（第一次重復(fù)試驗(yàn)）。
[0035] 圖7為實(shí)施例4的結(jié)果（第二次重復(fù)試驗(yàn)）。
[0036] 圖8為實(shí)施例4的結(jié)果（第二次重復(fù)試驗(yàn)）。
【具體實(shí)施方式】
[0037]W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置=次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。 陽03引新抱子蟲：ATCr50977?。弓形蟲：ATCT50839?。牛雙芽己貝斯蟲：ATCC" 75575?。
[0039] 提及"牛環(huán)形泰勒蟲"的文獻(xiàn)：盛明宏，于建敏，王志亮，張西臣.羊泰勒蟲PCR 檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用[J].中國動(dòng)物檢疫，2007, 24 (7). W40] 提及"牛瑟氏泰勒蟲"的文獻(xiàn)：許應(yīng)天，高旭，武振久，張守發(fā)，張西 臣.Wp33重組蛋白為抗原建立牛瑟氏泰勒蟲病間接化ISA診斷方[J].中國獸醫(yī)雜 志，2008, 43 (4) 13-14.
[0041] 實(shí)施例中，均采用榮研生物科技（中國）有限公司的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)濁度儀 LA-320C對(duì)反應(yīng)體系的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
[0042] 實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)和制備
[0043] 基于大量序列比對(duì)，引物設(shè)計(jì)、引物篩選與效果驗(yàn)證，獲得了一組用于新抱子蟲檢 測(cè)的效果最好的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組化5 1-2,其中各條引物的核巧酸序列見表1。
[0044] 表1引物組化5 1-2中各條引物的核巧酸序列
[0046] 將引物組化5 1-1作為引物組化5 1-2的對(duì)照，引物組化5 1-1中各條引物的核 巧酸序列見表2。
[0047] 表2引物組化5 1-1中各條引物的核巧酸序列
[0048] W例實(shí)施例2、LAMP檢測(cè)方法的建立
[0050] 一、引物組化5 1-1與引物組化5 1-2的效果比較
[0051] 1、提取新抱子蟲的基因組DNA。 陽化引 2、W步驟1得到的基因組DNA為模板DNA，采用引物組化5 1-1或引物組化5 1-2 進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過程中采用實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)反應(yīng)體系的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí) 監(jiān)測(cè)。
[0053] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系（25y1):溶劑為40mM化is?肥1緩沖液（P冊(cè).8); 含模板DNA2yl(約含 290ngDNA)、20mMKCl、16mM(NH4)2S〇4、〇. 2% (體積比）Tween20、 1.6M甜菜堿、16mMM拆04、2. 8mMdNTP(指的是四種dNTP中每種的濃度）、16UBstDNA polymerase、40pmolFIP、40pmolBIP、5pmolF3 和SpmolB3。
[0054] 將等體積蒸饋水代替模板DM,作為陰性對(duì)照。
[005引環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件：63°C，60min。
[0056] 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的濁度結(jié)果見圖1(橫坐標(biāo)的單位為分鐘，