專(zhuān)利名稱(chēng)：一種無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法，屬于生物柴油合成 技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及無(wú)溶劑反應(yīng)體系中具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的華根霉(i Z^O/7W
c/H'"e"w's) CCTCCM201021全細(xì)胞脂肪酶轉(zhuǎn)化各種油脂生產(chǎn)生物柴油新技術(shù)。
背景技術(shù)：
生物柴油(Biodiesel)是指由動(dòng)植物油脂與短鏈醇(甲醇或乙醇)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反 應(yīng)所制備的脂肪酸單酯，是一種性質(zhì)與柴油十分相似的可再生的生物燃料。它 不但可以作為化石柴油的替代燃料以緩解近年來(lái)石油資源日益枯竭的問(wèn)題，而 且具有化石柴油無(wú)可比擬的環(huán)境友好性等優(yōu)良特性，目前生物柴油的研究受到 了廣泛的關(guān)注。
目前生物柴油主要是用化學(xué)法生產(chǎn)，主要指將動(dòng)植物油脂和甲醇或乙醇等 低碳醇在酸或堿性催化劑和23(TC 25(TC的高溫下，轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的甲酯或乙 酯。但是化學(xué)法制備生物柴油存在著一些不可避免的缺點(diǎn)
1. 工藝要求使用甲醇量大大超過(guò)反應(yīng)摩爾比，過(guò)量甲醇的蒸發(fā)回流增大過(guò) 程能耗；
2. 反應(yīng)物中混有游離脂肪酸與水，對(duì)酯交換反應(yīng)有妨害作用，嚴(yán)重影響反 應(yīng)的進(jìn)行；
3. 產(chǎn)物必須水洗，洗滌過(guò)程中產(chǎn)生含堿廢液，如有殘留堿，則柴油中會(huì)生 皂，容易堵塞管道。
由于利用生物酶法合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染物排放、用醇 量少、產(chǎn)物無(wú)須洗滌、對(duì)原料要求低等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)的研究方向，因而 日益受到人們的重視。
但是生物法主要存在以下局限性 一是生物催化劑價(jià)格昂貴；二是甲醇對(duì) 生物催化劑有毒害作用；三是甲醇轉(zhuǎn)化率不高，而酶法生產(chǎn)生物柴油進(jìn)入商業(yè) 化的最大障礙就是催化劑的制備成本太高這一難題。
文斷Yuji Shimada et al. Enzymatic alcoholysis for biodiesel fiiel production and application of the reaction to oil processing ， Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002， 17: 133-142)報(bào)道了在利用生物酶法生產(chǎn)生物柴油的工藝過(guò) 程中，采用分批加入短鏈醇的方式以緩解其對(duì)酶的毒害作用。Watanabe Yomi et al(Watanabe Yomi et al. Conversion of degummed soybean oil to biodiesel fUel with immobilized Ca <iz'c a awtorc"ca lipase, Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic， 2002， 17: 151-155)利用固定化南極假絲酵母(Novo 435)作為催化劑 在10h、 24h時(shí)分別流加醇油摩爾比l : l的甲醇并取得了良好的轉(zhuǎn)化效果(48h 轉(zhuǎn)化率93.8%)。但是Novo435等商品化酶的價(jià)格昂貴，并不適合大規(guī)模的工業(yè) 化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方 法，就是為了解決上述技術(shù)中存在的不足之處，提供一種高效、廉價(jià)的生物酶 法轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油的方法。在無(wú)溶劑體系中利用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的價(jià)格 低廉的華根霉(朋&op^c/z/"m^) CCTCCM201021全細(xì)胞脂肪酶催化非可食 用性油脂生產(chǎn)生物柴油。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法，
在無(wú)溶劑體系中以短鏈醇甲醇或乙醇直接與底物油脂通過(guò)生物催化劑華根霉全
細(xì)胞脂肪酶的催化作用，進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成生物柴油；反應(yīng)配比短鏈醇和
油脂摩爾比為3 4 : 1，以及油脂質(zhì)量5%~15%的華根霉全細(xì)胞脂肪酶和油脂質(zhì)量 ln/。 3。/。的pH7.5的磷酸緩沖溶液，在該體系含水量條件下，反應(yīng)中分批次流加 短鏈醇，于密閉體系中30。C 4(TC反應(yīng)48 72h，制得生物柴油和副產(chǎn)物甘油， 生物柴油得率為95%。
所采用的生物催化劑為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的華根霉i^/zopus c/z/恥ra^ CCTCCM201021全細(xì)胞脂肪酶。該脂肪酶已由中國(guó)專(zhuān)利ZL 03113274.X授權(quán)。
所采用原料油脂為麻風(fēng)籽油、餐飲業(yè)廢油、酸價(jià)油、蓖麻油、桐油、大豆 油、花生油、棉籽油、魚(yú)油或豬油。
主要材料與試劑
所用脂肪酶及來(lái)源
華根霉i /^opws c/wVze"^ CCTCC M201021脂肪酶(RCL)中國(guó)典型培養(yǎng)物 保藏中心；
南極假絲酵母Ca"^fe^"ton:ricfl脂肪酶(Novo 435)， NovoNordisk公司； 玫瑰假絲酵母OwAWa n/gosa脂肪酶(CRL)， Sigma公司； 豬胰Porcine pancreas脂肪酶(PPL)， Sigma公司；
洋蔥假單胞菌尸^t/(io附o"as cep""'a月旨肪酶(PS)， Amano Pharmaceutical公
司；
固定化的洋蔥假單胞菌脂肪酶(PS-C)， Amano Pharmaceutical公司； 主要試劑
棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯和十七碳酸甲酯均購(gòu)于 sigma公司。
分析方法的確定
采用Agilent 6820氣相色譜儀和毛細(xì)管柱DB-5 (0.25 mm x 30 m)， FID檢 測(cè)器。分析條件起始柱溫180°C，保留1 min后以0.8°C/min的速率升溫至186 °C，保留lmin，再以2(TC/min的速率升到300'C，保留3 min;載氣為氮?dú)猓?分流比1:20;進(jìn)樣量lpL。
以十七酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，取一定量的棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯和 亞油酸甲酯標(biāo)樣配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，做脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算 轉(zhuǎn)酯化產(chǎn)物中脂肪酸甲酯的含量。
脂肪酸甲酯的得率=測(cè)得的脂肪酸甲酯含量乂100%/油脂完全甲酯化的脂
肪酸甲酯含量。
菌株的培養(yǎng)及全細(xì)胞的制備
(1) 菌株的培養(yǎng)基組成 斜面培養(yǎng)基馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；
搖瓶培養(yǎng)基蛋白胨6%，橄欖油2%，麥芽糖1%， MgSCV7H2O0.05%， K2HPO40.2%， pH5.5;
(2) 全細(xì)胞脂肪酶的制備
斜面于3(TC中培養(yǎng)3d，無(wú)菌水洗下孢子。將孢子懸浮液接種到30 mL搖瓶 培養(yǎng)基中(250mL三角瓶)，接種量約為106~107個(gè)/11丄。在3(TC下于搖床中培養(yǎng) 72h，轉(zhuǎn)速200r/min。收集發(fā)酵后的菌體，用去離子水洗滌數(shù)次，過(guò)濾收集菌絲 體，0.050 M， pH 7.5的磷酸緩沖液洗滌，加入一定量的該緩沖液后于-18T:冰 凍，冷凍干燥(Labconco冷凍干燥機(jī))48 h，得到細(xì)胞干粉即全細(xì)胞脂肪酶。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以廉價(jià)油脂為原料，采用價(jià)格極其低廉的 i /zfzopz^ c/zf"e附^ CCTCC M201021全細(xì)胞脂肪酶作為催化劑，分批流加短鏈醇 以解決醇對(duì)生物催化劑的毒害作用，提高短鏈醇轉(zhuǎn)化率，并大大降低了生物柴 油的生產(chǎn)成本，同時(shí)微生物全細(xì)胞脂肪酶的使用具有簡(jiǎn)化酶使用前的處理過(guò)程 以及產(chǎn)品的回收工藝，降低反應(yīng)溫度和避免污染的排放等優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明利用大量的廉價(jià)油脂(包括麻瘋籽油、餐飲業(yè)廢油、酸價(jià)油、蓖麻 油、桐油、大豆油、花生油、棉籽油、魚(yú)油、豬油)，主要是非可食用性的麻 瘋籽油以及餐飲業(yè)廢油、酸價(jià)油等廢物資源，在無(wú)溶劑系統(tǒng)催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)轉(zhuǎn)化 為環(huán)保型的生物柴油，既能減少環(huán)境污染又能節(jié)約化石能源，而且可以將非可 食用性油脂資源化，變廢為寶，緩解我國(guó)化石柴油日益供應(yīng)緊張的狀況。
在產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到生物柴油國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的前提下，大大降低了生物酶法生產(chǎn)生 物柴油的成本。首先價(jià)格極其低廉的i /^op"s c/z/we"w;s CCTCC M201021全細(xì)胞 脂肪酶的使用簡(jiǎn)化了反應(yīng)的流程，而且有效地解決了催化劑價(jià)格高昂的問(wèn)題； 其次，擴(kuò)大了原料的來(lái)源，不僅僅局限于精制大豆油等價(jià)格較高的可食用性油 脂，而主要是針對(duì)非可食用性的麻瘋籽油以及廢棄的餐飲業(yè)廢油、酸價(jià)油等原
料，廢物利用，有效地降低了生物柴油的生產(chǎn)成本。


圖l不同來(lái)源脂肪酶對(duì)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響。
(1)南極假絲酵母Ca"&V/a ^"torc"c"脂肪酶(Novozym 435); (2)洋蔥假單胞 菌i^Womoww ce戶(hù)c/a脂肪酶(PS); (3)固定化的洋蔥假單胞菌脂肪酶(PS-C); (4)玫瑰假絲酵母07"力^ 脂肪酶(CRL); (5)豬胰Porcine pancreas脂肪酶
(PPL); (6)華根霉i /z/zc;pus c/z/"m^ CCTCC M201021脂肪酶(RCL)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:生物催化劑脂肪酶的選擇
將摩爾比為1 : 1的大豆油(9.65 g)和甲醇在無(wú)溶劑體系下，對(duì)具有相同 酯合成酶活單位的6種脂肪酶在30°C的恒溫?fù)u床上分別振蕩反應(yīng)24 h時(shí)的轉(zhuǎn)化 情況，如圖1所示。(l)Novo 435的轉(zhuǎn)化效果最佳，脂肪酸甲酯得率可以達(dá)到30% 左右，即甲醇的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到90%以上；其次是(6)華根霉全細(xì)胞脂肪酶，其 轉(zhuǎn)酯化效果與Novo 435相比差別不大，甲醇的轉(zhuǎn)化率也可以達(dá)到90%以上。
實(shí)施例2:將總摩爾比為4 : 1的甲醇和麻風(fēng)籽油(麻風(fēng)籽油9.65 g)和基 于油脂質(zhì)量10%的i /^opw c/z/we"^ CCTCC M201021全細(xì)胞脂肪酶以及2°/。的 pH7.5磷酸緩沖液裝入50mL具塞三角瓶中，置于可控溫的空氣搖床中，分別 于10h、 24 h、 48h流加甲醇三次，30。C振蕩72h，生物柴油得率為95%。
實(shí)施例3:將總摩爾比為3 : 1的甲醇和酸價(jià)油(酸價(jià)油9.65 g，酸價(jià)50) 和基于油脂質(zhì)量10。/。的/ /^op船c/z/"m^ CCTCC M201021全細(xì)胞脂肪酶以及 2%的pH 7.5磷酸緩沖液裝入50 mL具塞三角瓶中，置于可控溫的空氣搖床中， 分別于10h、 24h流加甲醇兩次，3(TC振蕩48h，生物柴油得率可達(dá)90%。
實(shí)施例4:將總摩爾比為3 : 1的甲醇和棉籽油(棉籽油9.65 g)和基于油 脂質(zhì)量8。/。的i /z/zojms c/n'"m^ CCTCC M201021全細(xì)胞脂肪酶以及3。/。的pH 7.5 磷酸緩沖液裝入50mL具塞三角瓶中，置于可控溫的空氣搖床中，分別于10h、 24h流加甲醇兩次，30。C振蕩48h，生物柴油得率可達(dá)88%。
實(shí)施例5:將總摩爾比為3 : 1的甲醇和魚(yú)油(魚(yú)油9.65 g)和基于油脂質(zhì) 量15%的i /^opw c/n'"m^ CCTCC M201021全細(xì)胞脂肪酶以及2%的pH 7.5磷 酸緩沖液裝入50mL具塞三角瓶中，置于可控溫的空氣搖床中，分別于10h、 24h流加甲醇兩次，40。C振蕩48h，生物柴油得率可達(dá)89%。
實(shí)施例6:將總摩爾比為4 : 1的乙醇和麻風(fēng)籽油(麻風(fēng)籽油9.65 g)和基 于油脂質(zhì)量10%的及/^o; ^ c/n'"era^ CCTCC M201021全細(xì)胞脂肪酶以及2°/。的 pH7.5磷酸緩沖液裝入50mL具塞三角瓶中，置于可控溫的空氣搖床中，分別 于10h、 24h、 48h流加乙醇三次，4(TC振蕩72h，生物柴油得率可達(dá)98%。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法，其特征是無(wú)溶劑體系中以短鏈醇甲醇或乙醇直接與底物油脂通過(guò)生物催化劑華根霉全細(xì)胞脂肪酶的催化作用，進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)合成生物柴油；反應(yīng)配比短鏈醇和油脂摩爾比為3～4∶1，以及油脂質(zhì)量5％～15％的華根霉全細(xì)胞脂肪酶和油脂質(zhì)量1％～3％的pH 7.5的磷酸緩沖溶液，在該體系含水量條件下，反應(yīng)中分批次流加短鏈醇，于密閉體系中30℃～40℃反應(yīng)48～72h，制得生物柴油和副產(chǎn)物甘油，生物柴油得率為95％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法， 其特征是所采用的生物催化劑為具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的華根霉Rhizops chinensis CCTCCM201021全細(xì)胞脂肪酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法， 其特征是所采用原料油脂為麻風(fēng)籽油、餐飲業(yè)廢油、酸價(jià)油、蓖麻油、桐油、 大豆油、花生油、棉籽油、魚(yú)油或豬油。
全文摘要
一種無(wú)溶劑體系中生物轉(zhuǎn)化油脂制備生物柴油的方法，屬于生物柴油合成技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在無(wú)溶劑體系中采用華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCCM201021全細(xì)胞脂肪酶轉(zhuǎn)化各種油脂生產(chǎn)生物柴油，通過(guò)分批次流加短鏈醇，轉(zhuǎn)化多種油脂，可制備得到生物柴油和副產(chǎn)物甘油，生物柴油得率為95％。本發(fā)明以廉價(jià)油脂為原料，主要是非可食用性的麻瘋籽油以及餐飲業(yè)廢油、酸價(jià)油等廢物資源，擴(kuò)大了原料的來(lái)源；采用價(jià)格極其低廉的華根霉全細(xì)胞脂肪酶作為催化劑，有效地解決了催化劑價(jià)格高昂的問(wèn)題；分批流加短鏈醇以解決醇對(duì)生物催化劑的毒害作用，提高短鏈醇轉(zhuǎn)化率。在產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到生物柴油國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的前提下，大大降低了生物酶法生產(chǎn)生物柴油的成本。
文檔編號(hào)C10G3/00GK101205474SQ20071019126
公開(kāi)日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者巖 徐, 棟 王, 芹 賀 申請(qǐng)人:江南大學(xué)