專利名稱：抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，尤其是一種抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，惡性腫瘤已成為威脅人類健康的最嚴(yán)重疾病之一。據(jù)衛(wèi)生部2001資料顯示我國城市地區(qū)的惡性腫瘤死亡率為135.59/10萬，居各種疾病的死亡率之首。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，工業(yè)化、城市化的加速，城市和農(nóng)村的肺癌、肝癌、胃癌、腸癌等腫瘤的發(fā)病率均呈上升趨勢，所以針對各種腫瘤的預(yù)防、發(fā)病機制、診斷、治療和預(yù)后的相關(guān)研究成為迫切亟待解決的問題。而惡性腫瘤細(xì)胞的過度無限增殖、分化障礙及凋亡受阻是其發(fā)病的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不少腫瘤的發(fā)生機制就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病等。因此，以腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因或其蛋白產(chǎn)物為靶點的關(guān)于各種腫瘤的發(fā)病機制、診斷、治療和預(yù)后的基礎(chǔ)及臨床研究成為目前臨床與基礎(chǔ)研究的熱點課題。
隨著細(xì)胞凋亡相關(guān)研究的逐漸深入，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測在各種類型的腫瘤診斷、治療及預(yù)后觀察中已得到了廣泛應(yīng)用。如p53、Bcl-2等。ASPP家族蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的p53細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)的蛋白家族，該家族蛋白包括ASPP1、ASPP2和iASPP，這幾種蛋白均具有SH3結(jié)構(gòu)域、大量的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域和豐富的谷氨基結(jié)構(gòu)域。ASPP1和ASPP2通過與p53結(jié)合形成ASPP-p53復(fù)合物作用于促凋亡基因啟動子，ASPP表達(dá)水平的變化可引起p53結(jié)合DNA的能力發(fā)生改變，從而影響p53誘導(dǎo)凋亡的能力。iASPP是新近發(fā)現(xiàn)的高度保守的ASPP家族成員，其蛋白產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，具有結(jié)合NF-κB p65亞基和p53功能，進(jìn)而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和p53對凋亡的調(diào)節(jié)功能。它不僅可以通過結(jié)合NF-κB p65亞基抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，而且可以與ASPP1和ASPP2競爭性結(jié)合p53，影響ASPP-p53復(fù)合物與DNA結(jié)合的能力，從而抑制p53的促凋亡功能。通過RNA干擾使iASPP基因沉默后，可以顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞系的凋亡。而iASPP表達(dá)水平升高可以增強細(xì)胞對由紫外線照射和順鉑引起的細(xì)胞凋亡的抗性。目前研究發(fā)現(xiàn)iASPP不僅在乳腺癌中高表達(dá)，而且急性白血病患者骨髓單個核細(xì)胞和一些白血病細(xì)胞系細(xì)胞中其mRNA水平表達(dá)也高于正常人骨髓單個核細(xì)胞。
但是，有關(guān)iASPP的進(jìn)一步深入研究，如在各種實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中，實體瘤癌變組織和血液系統(tǒng)腫瘤的骨髓細(xì)胞及外周血細(xì)胞中iASPP在蛋白水平是否有所改變等，皆因沒有相應(yīng)的抗體而無法進(jìn)行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是制備一種能與人iASPP蛋白的抗原決定簇特異性結(jié)合的小鼠單克隆抗體，檢測正常細(xì)胞和各種類型的腫瘤患者的細(xì)胞中iASPP蛋白在不同細(xì)胞內(nèi)定位及蛋白表達(dá)水平。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是應(yīng)用RT-PCR方法克隆iASPP全長cDNA，利用合適的酶切位點構(gòu)建人iASPP真核表達(dá)重組質(zhì)粒，其核苷酸和氨基酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，然后將此重組質(zhì)粒注射入小鼠脾臟內(nèi)免疫，免疫后獲得的小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后產(chǎn)生針對iASPP蛋白的特異性單克隆抗體。
上述單克隆抗體可以通過多種方法制備，來自用重組人iASPP真核表達(dá)質(zhì)粒通過脾臟內(nèi)注射免疫或者重組人iASPP蛋白通過腹腔免疫后的小鼠脾臟細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。
上述單克隆抗體篩選抗原是由克隆入SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的cDNA序列后的原核表達(dá)載體所表達(dá)的蛋白。由于iASPP蛋白的C末端與同家族蛋白ASPP1和ASPP2的同源性高達(dá)50％，所以不僅表達(dá)了iASPP全長蛋白PIAF而且表達(dá)了其N末端的一段短肽序列PIAS。在篩選雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生單克隆抗體時，同時使用兩種抗原篩選排除了所篩選抗體中針對同源序列的非特異性抗體，確保了所篩選到的陽性克隆產(chǎn)生的單克隆抗體為針對iASPP蛋白單克隆抗體的特異性。
上述抗人iASPP蛋白的單克隆抗體的免疫球蛋白亞型為IgG或者IgM型。
上述單克隆抗體可以識別細(xì)胞內(nèi)分子量分別為44KD和89KD的兩種iASPP異構(gòu)體蛋白。
上述單克隆抗體可以通過各種標(biāo)記或不通過標(biāo)記用于檢測正常細(xì)胞和各種類型腫瘤患者細(xì)胞中iASPP細(xì)胞內(nèi)定位及蛋白表達(dá)水平。
上述單克隆抗體可以應(yīng)用于組建檢測正常細(xì)胞和各種類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)iASPP蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位的免疫組織化學(xué)試劑盒。
本發(fā)明有利于進(jìn)一步研究和闡述各種腫瘤的發(fā)病機制和進(jìn)一步促進(jìn)各種腫瘤的早期和鑒別診斷新方法的發(fā)現(xiàn)。


圖1是RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖，其中，1DNA marker(DL2000)；2iASPP RT-PCR產(chǎn)物。
圖2是PIAS和PIAF重組表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
圖3是CIAF質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。
圖4是SDS-PAGE分析PIAS和PIAF融合蛋白的表達(dá)電泳圖，其中，1.低分子質(zhì)量蛋白Marker；2.未用IPTG誘導(dǎo)的PIAS-Rosetta(DE3)菌體總蛋白；3.IPTG誘導(dǎo)的PIAS-Rosetta(DE3)菌體總蛋白；4.未用IPTG誘導(dǎo)的PIAF-Rosetta(DE3)菌體總蛋白；5.用IPTG誘導(dǎo)的PIAF-Rosetta(DE3)菌體總蛋白。
圖5是SDS-PAGE分析純化后PIAS和PIAF融合蛋白電泳圖，其中，1.50mmol/L咪唑洗脫的PIAS蛋白；2.100mmol/L咪唑洗脫的PIAS蛋白；3.250mmol/L咪唑洗脫的PIAS蛋白；4.500mmol/L咪唑洗脫的PIAS蛋白；5.低分子量Marker；6.50mmol/L咪唑洗脫的PIAF蛋白；7.100mmol/L咪唑洗脫的PIAF蛋白；8.250mmol/L咪唑洗脫的PIAF蛋白；9.500mmol/L咪唑洗脫的PIAF蛋白。
圖6A是純化前PIAS和PIAF融合蛋白的Western Blot鑒定，其中，1低分子質(zhì)量蛋白Marker；2用IPTG誘導(dǎo)的PIAF-Rosetta(DE3)菌表達(dá)的總蛋白；3用IPTG誘導(dǎo)的PIAS-Rosetta(DE3)菌表達(dá)的總蛋白。
圖6B是純化后PIAS和PIAF融合蛋白的Western Blot鑒定，其中，1低分子質(zhì)量蛋白Marker；2純化后的PIAF融合蛋白；3純化后的PIAF融合蛋白。
圖7A是單克隆抗體的免疫組織化學(xué)鑒定——陰性對照(400×)。
圖7B是單克隆抗體的免疫組織化學(xué)鑒定——U-937細(xì)胞(400×)。
圖7C是單克隆抗體的免疫組織化學(xué)鑒定——U-937細(xì)胞(1000×)。
圖8A是單克隆抗體的Western Blot鑒定，其中，Mark低分子質(zhì)量蛋白Marker；PF純化后的PIAF融合蛋白。
圖8B是單克隆抗體的Western Blot鑒定，其中，1低分子質(zhì)量蛋白Marker；2293T細(xì)胞的細(xì)胞漿提取物；3.293T細(xì)胞的細(xì)胞核提取物。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不僅限于下述實施實例。
實施例1人iASPP基因的克隆及真核和原核表達(dá)載體的構(gòu)建1.1人iASPP基因的克隆離心收集對數(shù)生長期的U-937細(xì)胞約(1-5)×106，TRIzol提取總RNA，用分光光度計測定A260/A280，計算RNA含量，并經(jīng)12g/L瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整。20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含2μg總RNA，4μl RT緩沖液，50pmol/L oligo(dT)16，1μmol/L dNTPs，0.1μmol/L DTT，15U RNA酶抑制劑(Takara)，200U MLV(Invitrogen)，于65℃水浴5min，冰浴5min，37℃水浴60min，70℃ 15min終止反應(yīng)，所得cDNA-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)iASPP CDS序列(NM_006663)利用gene runner軟件設(shè)計引物，分別于正義鏈5′端加EcoR I反義鏈5′端加Xho I酶切位點，iASPP正義鏈引物5’-GGAATTCCATGTGCTGGTTGTATGCC-3’；反義鏈引物5’-CTCGAGGTCAGCCTCAGAAACCTC-3’，預(yù)計片段長度1269bp。iASPP的PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，94℃45s，54-57℃45s，72℃90s，32個循環(huán)，72℃10min，結(jié)果見圖1。回收純化后的PCR產(chǎn)物克隆入pMD 18-T載體中，命名為TIAF。
1.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建克隆入T載體的iASPP經(jīng)測序鑒定正確，以其為模板，用上游引物5’-GCGCGAATTCATGTGCTGGTTGTATGC-3’和下游引物5’-GCGCCTCGAGGACTTTACTCCTTTGAGG-3’以及上游引物5’-GCGCGAATTCTGCTGGTTGTATGCCCTG-3’和下游引物5’-GCGCCCTCGAGTGGAATGGGAGCTGGTGG-3’分別以pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴增，兩種PCR產(chǎn)物均分別于上下游引入EcoR I和Xho I酶切位點。第一對引物所擴增的片段長度為1241bp，其中iASPP基因讀碼框長度為1221bp。第二對引物擴增的片段長度為521bp，其中iASPP基因讀碼框長度為501bp。第一對引物的PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，52-55℃ 30s，72°C 3min，25個循環(huán)后72℃延伸20min；第二對引物的PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，50-54℃ 30s，72℃ 1.5min，25個循環(huán)后72℃延伸20min。均于循環(huán)完畢72℃延伸5min后，加入1U Taq DNA聚合酶繼續(xù)延伸15min。將用第一對引物和第二對引物所擴增的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后，連接入Simple T載體中，分別命名為TPIAF和TPIAS。轉(zhuǎn)化E.coli DH5菌株，在LB平皿中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取TPIAF和TPIAS陽性克隆，提取質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切，分別回收1233bp(其中包含具有SEQ ID NO.3的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列SEQ ID NO.4)和513bp(其中包含具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列SEQ ID NO.6)的目的片段。與經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切原核表達(dá)載體pET28a連接后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5菌株，通過酶切鑒定得到含目的片段的重組克隆，并命名為PIAF和PIAS，見圖2。
1.3真核表達(dá)載體的構(gòu)建克隆入T載體的iASPP經(jīng)測序鑒定正確，以其為模板，用上游引物5’-GAATTCACCATGGGCTGGTTGTATGCC-3’和下游引物5’-CTCGAGGTCAGCCTCAGAA-3’以pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物分別于上下游引入EcoR I和Xho I酶切位點并于上游引物中加入kozak序列。PCR產(chǎn)物所擴增的片段長度為1268bp，其中iASPP基因讀碼框長度為1224bp(其核苷酸和所編碼的氨基酸序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，52-56℃ 30s，72℃ 3min，25個循環(huán)后72℃延伸20min。于循環(huán)完畢72℃延伸5min后，加入1U Taq DNA聚合酶繼續(xù)延伸15min。將所擴增的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收后，連接入Simple T載體中，命名為TCIAF。轉(zhuǎn)化E.coli DH5菌株，在LB平皿中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取TCIAF陽性克隆，提取質(zhì)粒用EcoR I和Xho I雙酶切，回收1268bp的目的片段。與經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5菌株，通過酶切鑒定得到含目的片段的重組克隆，并命名為CIAF，見圖3。
實施例2篩選抗原的表達(dá)及純化2.1將實施例1.2中獲得的PIAF和PIAS質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)原核表達(dá)菌株，在卡那霉素和氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基瓊脂平板上篩選陽性克隆。挑取單個克隆接種于含有卡那霉素(50mg/L)和氯霉素(34mg/L)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8。以1∶100比例接種于含有相同濃度抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8后，加入IPTG至終濃度為1mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。4小時后，4℃離心收集菌體。重懸于適量的1×SDS上樣緩沖液中，置沸水浴3～5min，取50μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。目的片段PIAS和PIAF蛋白的分子量分別為23KD、49KD，見圖4。
2.2PIAS和PIAF融合蛋白的純化將適量活化的PIAS-Rosetta(DE3)和PIAF-Rosetta(DE3)菌液接種到LB培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。在37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6-0.8后，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，4小時后離心收集菌體。重懸并超聲裂解菌體，離心獲得包涵體，并用含6mol/L鹽酸胍的Tris-HCl緩沖液于4℃融解過夜。次日用Ni2+鰲合層析柱純化目的蛋白，分別用50、100、250和500mmol/L咪唑鹽溶液(6mol/L尿素，50mmol/LTris-HCl)洗脫，見圖5。
2.3PIAS和PIAF融合蛋白的Western Blot鑒定純化前后的PIAS和PIAF融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。剪下轉(zhuǎn)移膜Marker條帶部分，用氨基黑染色。目的蛋白條帶以封閉液(含5％脫脂奶的PBS)4℃封閉過夜，棄去封閉液加入鼠抗His-tag抗體(1∶1000)，室溫孵育2h后，棄去一抗，用PBS(含0.05％ Tween-20)洗膜三次，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG室溫孵育1h。用PBS(含0.05％ Tween-20)洗硝酸纖維素膜三次，加入DAB顯色，見圖6A、6B。
實施例3單克隆抗體的制備3.1動物免疫應(yīng)用大提質(zhì)粒試劑盒提取實施例1.3中獲得的CIAF質(zhì)粒，將該質(zhì)粒用PBS稀釋其濃度至100μg/100μl注射入小鼠脾臟內(nèi)，每只小鼠注射100μl。
3.2飼養(yǎng)細(xì)胞的制備本發(fā)明中采用的飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞于融合前一天制備，制備過程如下選用與所免疫小鼠相同品系Balb/c小鼠，6～8周齡→將小鼠頸椎脫臼處死，浸泡于75％酒精中，消毒3～5分鐘→將小鼠固定于解剖板上，用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜→用無菌注射器向腹腔中注射6～8ml培養(yǎng)液→用注射器反復(fù)沖洗腹腔，吸出沖洗液→放入10ml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，離心5～6分鐘→用含20％胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1-2)×105/ml→
加入96孔板中，100l/孔→將96孔培養(yǎng)板置37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)3.3骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備本發(fā)明中選用的骨髓瘤細(xì)胞系是NS1細(xì)胞系。
于融合前1-2周復(fù)蘇細(xì)胞系，用含20％FCS的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。每2天傳代一次，保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好，活細(xì)胞計數(shù)高于95％。
3.4細(xì)胞的融合3.4.1脾細(xì)胞懸液的制備在無菌條件下取出應(yīng)用實施實例3.1中CIAF質(zhì)粒免疫3天后的兩只小鼠脾臟，用不完全培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計數(shù)，共1.3×108。
3.4.2取對數(shù)生長的NS1骨髓瘤細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，根據(jù)所獲取的脾臟單個核細(xì)胞數(shù)取NS1骨髓瘤細(xì)胞2.6×107，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。
3.4.3同時將免疫好小鼠脾細(xì)胞懸液用不完全培養(yǎng)液離心洗滌2次。
3.4.4將上述的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶5的比例混合于50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，離心1000rpm，8分鐘。
3.4.5棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
3.4.6輕輕彈擊離心管底，使沉淀的細(xì)胞略加松動。
3.4.7骨髓瘤細(xì)胞和脾臟細(xì)胞的融合①30秒內(nèi)加入于37℃溫育好的含5％DMSO 45％PEG(Merek，分子量4000)1ml，邊加入邊輕輕搖動離心管(離心管置于37℃水浴中)。
②作用90秒鐘。
③加入于37℃溫育好的不完全培養(yǎng)液，每隔2分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml，終止PEG作用。
3.4.8離心，800rpm，6分鐘。
3.4.9棄上清，先用6ml 20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸。
3.4.10共接種8塊96孔培養(yǎng)板，補加完全培養(yǎng)液74ml，一塊96孔板含約1.5×107脾細(xì)胞。
3.4.11將融合后細(xì)胞懸液加入于前一天制備好的含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，100μl/孔，置于37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)。
3.4.12于24小時后，加入HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞克隆長至鋪滿孔底約1/10面積時開始篩選(約2周左右)，在此期間每3天半量更換HAT選擇培養(yǎng)液，至少于選擇前更換2-3次。
3.5單克隆抗體的篩選將實施實例2中純化好的PIAS和PIAF蛋白包被96孔酶標(biāo)板，0.5μg/孔，4℃過夜。次日，將酶標(biāo)板用含5％胎牛血清的PBS于37℃孵育1小時封閉后，取雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清用間接ELISA方法篩選陽性克隆。
3.6陽性克隆雜交瘤細(xì)胞株的亞克隆和凍存3.6.1陽性克隆雜交瘤細(xì)胞株的亞克隆陽性克隆雜交瘤細(xì)胞株的亞克隆培養(yǎng)采用極限稀釋法，利用這種方法按照每孔1或0.5個細(xì)胞接種于預(yù)先鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96培養(yǎng)板中，置于37℃ 5％CO2孵箱培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞克隆長至鋪滿孔底約1/10面積時開始篩選(約2周左右)，篩選方法如實施例3中步驟5所述。
3.6.2陽性克隆雜交瘤細(xì)胞株的凍存將亞克隆后的陽性克隆細(xì)胞株擴大培養(yǎng)后，按照常規(guī)方法凍存，每支凍存管中含1×106細(xì)胞。
實施例4單克隆抗體亞型的鑒定選用商業(yè)公司的Monoclonal antibody isotyping Kit抗體亞型檢測試劑盒對所獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液上清進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所獲得的單克隆抗體分別是IgG2a/κ鏈型和IgM/κ鏈型實施例5單克隆抗體的免疫組織化學(xué)鑒定實驗方法5.1標(biāo)本制備標(biāo)本包括實體瘤組織病理切片、外周血和/或骨髓細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系涂片。
外周血和/或骨髓細(xì)胞涂片的制備過程5.1.1外周血和/或骨髓單個核細(xì)胞分離、細(xì)胞涂片外周血和/或骨髓(外周血和骨髓細(xì)胞取自正常人或各種血液系統(tǒng)腫瘤患者)2-3ml，肝素(25u/ml)抗凝，用PBS做1∶2-3稀釋后，用吸管取3-4ml稀釋血樣沿管壁緩慢加入到含有2-3ml淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077)的離心管上層，使兩種液體間保持清晰的界面。離心(1500rpm)15-20分鐘，取出離心管，輕輕吸出富含單個核細(xì)胞的細(xì)胞層，加入另一離心管中。加入PBS離心洗2-3次。加入少量PBS，反復(fù)吹打沉淀細(xì)胞使其分散為單個細(xì)胞。涂片方法取分離好的單個核細(xì)胞50μl于離心涂片機上離心涂片。室溫放置4-12小時后進(jìn)行下面實驗步驟，或保存，保存方法見5.1.2。
5.1.2外周血和/或骨髓細(xì)胞涂片室溫干燥4-12小時，直接進(jìn)行下面步驟或用潔凈的白紙成對包好(兩張涂片的血膜面向外)，放在裝有干燥劑(如變色硅膠顆粒)的塑料小袋中，封好袋口做好標(biāo)記，置-20℃保存。
5.2將細(xì)胞涂片置于冰上滴加通透液至涂片上覆蓋所有細(xì)胞透膜5-10分鐘，用PBS洗3次，每次5min；5.3滴加稀釋好的腹水型或純化的單克隆抗體至涂片上覆蓋所有細(xì)胞，置于濕盒中4℃過夜或室溫孵育2小時，用PBS洗3次，每次5min；以滴加PBS的涂片為陰性對照；5.4滴加含10％馬血清的PBS至涂片上覆蓋所有細(xì)胞，置于濕盒中室溫孵育30min，PBS洗3次，每次5min；5.5將細(xì)胞涂片置于甲醇溶液中(10ml甲醇中加入0.2ml H2O2)，室溫孵育10min，去除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3次，每次5min；5.6滴加稀釋好生物素標(biāo)記的馬抗鼠免疫球蛋白至覆蓋涂片上的所有細(xì)胞，置于濕盒中室溫孵育1小時，用PBS洗3次，每次5min；5.7滴加親和素辣根過氧化物酶復(fù)合物至涂片上覆蓋所有細(xì)胞，置于濕盒中室溫孵育30min，用PBS洗3次，每次5min，擦去多余液體；5.8DAB避光顯色10min，充分洗涂片；5.9蘇木素復(fù)染1min，用PBS洗3次，每次5min，擦去多余液體；5.10將涂片依次置于80％、90％、100％、100％乙醇中進(jìn)行脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片，室溫自然干燥；5.11將涂片置于顯微鏡下觀察，陽性反應(yīng)為棕黃色。見圖7A、7B、7C。
溶液配制(1)PBS液(ABC免疫酶標(biāo))A液Na2PO4·12H2O 23.88克，溶解于1000ml蒸餾水中B液KH2PO49.08克，溶解于1000ml蒸餾水中取A液86ml加B液14ml，調(diào)pH至7.6然后加入0.85克NaCl。
(2)FAB固定液Na2PO4·12H2O 20mg；KH2PO4100mg；40％甲醛25ml；丙酮45ml；蒸餾水30ml；混合好后調(diào)節(jié)pH至6.6-6.8(3)通透液含0.2％TritonX-100的PBS緩沖液。
(4)顯色液0.05％(w/v)DAB溶解于PBS中，含有0.1％(v/v)H2O2實施例6單克隆抗體的Western Blot鑒定實驗純化后PIAF融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。剪下轉(zhuǎn)移膜Marker條帶部分，用氨基黑染色。目的蛋白條帶以封閉液(含5％脫脂奶的PBS)4℃封閉過夜，棄去封閉液加入所制備的單克隆抗體，室溫孵育2h后，棄去一抗，用PBS(含0.05％Tween-20)洗膜三次，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白室溫孵育1h。用PBS(含0.05％Tween-20)洗硝酸纖維素膜三次，加入DAB顯色。
取1×106個對數(shù)生長期的U937細(xì)胞置于離心機中離心，用PBS反復(fù)重懸離心洗3次后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。剪下轉(zhuǎn)移膜Marker條帶部分，用氨基黑染色。目的蛋白條帶以封閉液(含5％脫脂奶的PBS)4℃封閉過夜，棄去封閉液加入所制備的單克隆抗體，室溫孵育2h后，棄去一抗，用PBS(含0.05％Tween-20)洗膜三次，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白室溫孵育1h。用PBS(含0.05％Tween-20)洗硝酸纖維素膜三次，加入DAB顯色。見圖8。
實施例7ABC免疫組織化學(xué)檢測試劑盒的組建7.1試劑盒中提供的試劑包括7.1.1 iASPP單克隆抗體1支(100μl)使用時用緩沖液做100倍稀釋7.1.2生物素標(biāo)記的羊(或馬)抗鼠免疫球蛋白(或IgG或IgM)1支(100μl)使用時用緩沖液做100倍稀釋；7.1.3生物素-卵白素-HRP復(fù)合物1支(100μl)使用時用緩沖液做100倍稀釋；7.1.4封閉用羊(或馬)血清1支(1ml)7.1.5自備試劑和材料(1)0.1M phoshpate buffer，0.15M NaCl，pH7.4(PBS)；(2)洗滌液0.1M PBS pH7.4，含0.05％Tween-20；(3)稀釋液0.1M PBS pH7.4，0.5％BSA；(4)DAB；(5)酶標(biāo)儀等。
7.2試劑盒儲存(1)短期使用，儲存于2-8℃；(2)長期放置，請將一抗儲存于-20(℃或者-80℃冰箱中，請勿反復(fù)凍融。
7.3標(biāo)本均為取自正常人或各種血液系統(tǒng)腫瘤患者的外周血和/或骨髓的單個核細(xì)胞，其制備方法參照實施例5中的步驟1。
7.4注意事項(1)標(biāo)本應(yīng)新鮮取制或干燥后于-20℃干燥保存；(2)試劑盒應(yīng)儲存于4℃，不可凍融，防止污染。
(3)各種抗體操作過程中的孵育步驟必須在濕盒內(nèi)進(jìn)行，各種抗體加樣量10-30μl，切忌干涸和分布不勻；(4)取用試劑盒試劑時，請分別用新的加樣器吸頭吸取，避免交叉使用；(5)疊氮鈉(NaN3)對辣根過氧化物酶(HRP)具有滅活作用，在本試劑盒系統(tǒng)中應(yīng)避免使用；(6)底物液應(yīng)避光保存；(7)所有試劑在使用前應(yīng)回復(fù)至室溫。
7.5該試劑盒使用時操作步驟參照實施實例5序列表
<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所<120>抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體及應(yīng)用<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1224<212>DNA<213>人類(Homo sapiens)<220>
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1.一種抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體，其特征在于，用于制備單克隆抗體的免疫原是插入人iASPP cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫原的核苷酸和氨基酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用于篩選單克隆抗體的蛋白為插入iASPP cDNA片段的原核表達(dá)載體所表達(dá)的融合或者非融合蛋白，所述cDNA片段的核苷酸分別為SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5，其所編碼的氨基酸序列分別為SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體來源于用插入人iASPP cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行脾臟內(nèi)免疫后獲得的小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的免疫球蛋白亞型為IgG或者IgM中之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體，其特征在于，篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞是酶聯(lián)免疫吸附實驗方法(ELISA)得到。
5.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，在識別細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)或者體外重組表達(dá)分子量分別為44KD和/或89KD的兩種iASPP異構(gòu)體蛋白中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，用于檢測正常和腫瘤組織標(biāo)本，其檢測的靶抗原物質(zhì)為定位于所述細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的人類癌蛋白iASPP。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所應(yīng)用的單克隆抗體是應(yīng)用熒光素、酶、鐵蛋白或膠體金或者放射性同位素標(biāo)記或者未標(biāo)記任何標(biāo)記物的抗體。
8.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在組建檢測正常細(xì)胞和各種類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)iASPP蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位的免疫組織化學(xué)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人癌蛋白iASPP的單克隆抗體及應(yīng)用，制備能與癌蛋白iASPP的兩種異構(gòu)體在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外特異性結(jié)合的小鼠的單克隆抗體。提供了針對篩選iASPP單克隆抗體時所用抗原的載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)和純化的方法，以及iASPP單克隆抗體篩選方法及其用于診斷和治療人類各種類型腫瘤的用途。本發(fā)明采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方法成功的制備了人癌蛋白iASPP的單克隆抗體，為進(jìn)一步闡述各種腫瘤的發(fā)病機制、臨床診斷及靶向治療方面奠定了的基礎(chǔ)。
文檔編號G01N33/577GK1854156SQ20051001335
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日
發(fā)明者王建祥, 王敏, 刁世勇, 饒青, 張新偉, 廖曉龍 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所