本發(fā)明涉及納米結(jié)構(gòu)材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

納米多層核殼結(jié)構(gòu)作為一種經(jīng)典的納米結(jié)構(gòu)，由于其特殊的性質(zhì)而受到廣泛的關(guān)注，使其在醫(yī)藥、能源以及催化等多個(gè)領(lǐng)域都有普遍的研究和應(yīng)用?，F(xiàn)階段核殼多層結(jié)構(gòu)的制備策略主要包括膠束誘導(dǎo)與蝕刻等，工藝較為復(fù)雜，難以生成夾層數(shù)目較多的核殼結(jié)構(gòu)，并且對(duì)夾層性質(zhì)的調(diào)控能力不足，限制了核殼多層結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

非晶碳酸鈣作為廣泛存在于自然界的天然礦物碳酸鈣的一種形式，其具有易降解、無毒性、可塑性好以及廉價(jià)易得等眾多優(yōu)點(diǎn)，被視為富有潛力的醫(yī)藥基質(zhì)。但由于其熱力學(xué)不穩(wěn)定性，在水溶液中不能維持結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的穩(wěn)定性，使其在載藥方面的實(shí)際應(yīng)用受到了限制。同樣，二氧化硅作為天然礦物組成成分，由于其優(yōu)良的生物相容性和生物安全性被廣泛應(yīng)用于納米載藥領(lǐng)域，但其在機(jī)體內(nèi)有限的降解能力成為了應(yīng)用的阻礙。

欲實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的足量載負(fù)，并防止其在體液循環(huán)中過早泄露，除了進(jìn)行基團(tuán)修飾，利用藥物的物化特性阻止其擴(kuò)散以外，最常用的方法就是增大外殼的厚度。由于二氧化硅在機(jī)體環(huán)境中的降解性有限，這種策略往往會(huì)造成硅殼降解的不完全，對(duì)機(jī)體造成潛在的負(fù)擔(dān)。實(shí)際上，目前還沒有一個(gè)簡(jiǎn)單手段可以兼得防止泄露和完全降解兩種性質(zhì)。同時(shí)，隨著多功能化成為業(yè)界發(fā)展的趨勢(shì)，核殼結(jié)構(gòu)所具有的多個(gè)納米夾層空間為多種功能的實(shí)現(xiàn)提供了可能性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法，本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮藲そY(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法能夠?qū)崿F(xiàn)功能性材料的多功能化。

有鑒于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A)，碳酸鈣層的制備

將含有鈣離子與水的乙醇溶液與核心材料混合，得到混合液；將所述混合液與碳酸氫銨的分解產(chǎn)物反應(yīng)，得到包覆有碳酸鈣層的納米顆粒；所述核心材料選自最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒；

B)，二氧化硅層的制備

將所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒與乙醇、正硅酸四乙酯、氨水、水、乙二胺四乙酸混合后反應(yīng)，得到包覆有二氧化硅層的納米顆粒。

優(yōu)選的，所述包覆有二氧化硅層的納米顆粒的制備之后還包括：重復(fù)進(jìn)行碳酸鈣層的制備和/或二氧化硅層的制備。

優(yōu)選的，在碳酸鈣層的制備過程中，所述混合液中鈣離子的濃度為0.1～10g/L；所述混合液中水與乙醇的體積比為1：(100～1000)；所述混合液中核心材料的含量為0.1～100mg，所述混合液的體積為1～100mL；所述反應(yīng)的溫度為20～40℃，所述反應(yīng)的時(shí)間為12～48h。

優(yōu)選的，在二氧化硅層的制備過程中，所述混合得到的混合液中，所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒的含量為0.1～1400mg；乙醇的體積為10～50mL；正硅酸四乙酯的體積為1～100μL；氨水的體積為0.1～1mL；乙二胺四乙酸的質(zhì)量為0.01～1mg。

優(yōu)選的，在二氧化硅層的制備過程中，所述反應(yīng)的時(shí)間為12～36h。

優(yōu)選的，在碳酸鈣層的制備過程中，所述最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒為以功能性納米顆粒作為核心，最外層包覆二氧化硅層的復(fù)合材料；所述功能性納米顆粒包括氧化鐵顆粒、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、金顆粒、載負(fù)有金屬離子或者量子點(diǎn)的納米顆?；蜉d藥顆粒。

優(yōu)選的，所述功能性納米顆粒為載藥顆粒，所述載藥顆粒的藥物選自羥基喜樹堿、開環(huán)羥基喜樹堿或鹽酸阿霉素。

優(yōu)選的，所述最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒的載藥顆粒為開環(huán)羥基喜樹堿。

優(yōu)選的，所述核心材料為最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒，在碳酸鈣層的制備過程中在混合之前還包括：

采用濃度為3.7wt％的稀鹽酸將最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒分散；所述每5mL稀鹽酸中分散0.1～10mg的多層顆粒。

優(yōu)選的，在碳酸鈣制備過程中，所述得到包覆有碳酸鈣層的納米顆粒的制備過程具體為：

將所述混合液裝入容器M中，采用封口膜將容器M密封，并預(yù)留小孔；

將所述碳酸氫銨裝入容器N中，采用封口膜將容器N密封，并預(yù)留小孔；

將容器M與容器N置于真空干燥器中，靜置，反應(yīng)后離心。

本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法，其利用非晶碳酸鈣與二氧化硅的靜電作用，實(shí)現(xiàn)了非晶碳酸鈣層在二氧化硅層上的粘附與積累，以及二氧化硅層在非晶碳酸鈣層上的交聯(lián)和生長，制備得到了精巧的多層核殼結(jié)構(gòu)。以核心材料為載藥核心為例，本申請(qǐng)制備的納米多層核殼載藥顆粒粒徑均一、重復(fù)性好、制作性強(qiáng)、工藝簡(jiǎn)單、夾層的數(shù)量和厚度可控，可根據(jù)核心藥物的性質(zhì)，對(duì)其釋放實(shí)現(xiàn)較為精確的調(diào)控作用；其中的，非晶碳酸鈣層除了本身無毒又容易降解外，最重要的是作為間隔材料，將二氧化硅分層，如此原本需要包很厚的二氧化硅層才能阻止藥物泄露的情況，現(xiàn)在變成包數(shù)層較薄的二氧化硅層，極大地增加了與液相的接觸面積，從而實(shí)現(xiàn)充分降解，則無論碳酸鈣流失前或形成空腔后，藥物都需要穿過長長的間隙，有效地延緩了藥物的釋放；并且，通過控制間隙的寬度和碳酸鈣的流失，也可以控制藥物的釋放。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中制備的載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿納米顆粒ACC-HCPT_b2的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖2是實(shí)施例1中制備的載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿納米顆粒ACC-HCPT_b2的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖3是實(shí)施例2中制備的載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿納米顆粒ACC-HCPT_b6的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖4是實(shí)施例2中制備的載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿納米顆粒ACC-HCPT_b6的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖5是實(shí)施例3中制備的二氧化硅包被并載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT2@silica15的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖6是實(shí)施例3中制備的二氧化硅包被并載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT2@silica15的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖7是實(shí)施例4中制備的二氧化硅包被并載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT6@silica45的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖8是實(shí)施例4中制備的二氧化硅包被并載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT6@silica45的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖9是實(shí)施例5中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖10是實(shí)施例5中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖11是實(shí)施例6中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖12是實(shí)施例6中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖13是實(shí)施例6中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20水處理后的透射電子顯微鏡低倍照片；

圖14是實(shí)施例6中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20水處理后的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖15是實(shí)施例7中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica10的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖16是實(shí)施例8中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica15的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖17是實(shí)施例9中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica20的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖18是實(shí)施例10中制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC2@silica20的透射電子顯微鏡高倍照片；

圖19是實(shí)施例11所描述的加入載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20，并孵育36小時(shí)后的細(xì)胞存活率曲線圖；

圖20是實(shí)施例11所描述的加入載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20，并孵育48小時(shí)后的細(xì)胞存活率曲線圖；

圖21是實(shí)施例12中描述的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖22是實(shí)施例12中描述的藥物累積釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A)，碳酸鈣層的制備

將含有鈣離子與水的乙醇溶液與核心材料混合，得到混合液；將所述混合液與碳酸氫銨的分解產(chǎn)物反應(yīng)，得到包覆有碳酸鈣層的納米顆粒；所述核心材料選自最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒；

B)，二氧化硅層的制備

將所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒與乙醇、正硅酸四乙酯、氨水、水、乙二胺四乙酸混合后反應(yīng)，得到包覆有二氧化硅層的納米顆粒。

本申請(qǐng)的納米多層核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建利用非晶碳酸鈣層在形成過程中容易粘附于二氧化硅層表面的傾向，表面帶負(fù)電的包被有二氧化硅層的納米顆?？梢宰鳛檎掣胶诵模^為均勻的分散在反應(yīng)體系中，帶正電的鈣離子則在納米顆粒表面與碳酸根反應(yīng)，并逐漸積累，形成均勻的納米級(jí)別的碳酸鈣夾層。

在構(gòu)建核殼結(jié)構(gòu)的過程中，為了使該核殼結(jié)構(gòu)具有功能性，所述核殼結(jié)構(gòu)需要有一個(gè)核心材料。本申請(qǐng)所述核心材料為最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒。所述最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒為以功能性納米顆粒作為核心，最外層包覆二氧化硅層的復(fù)合材料；所述功能性納米顆粒包括載藥顆粒、氧化鐵顆粒、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、金顆粒、載負(fù)有金屬離子或者量子點(diǎn)的納米顆?；蜉d藥顆粒；所述功能性納米顆粒為載藥顆粒，所述載藥顆粒的負(fù)載藥物選自羥基喜樹堿、開環(huán)羥基喜樹堿或鹽酸阿霉素。所述納米顆粒的制備方法優(yōu)選按照申請(qǐng)?zhí)枮?015100305428的中國專利碳酸鈣-阿霉素-二氧化硅納米顆粒及其制備方法公開的制備方法進(jìn)行制備。

本申請(qǐng)首先將含有鈣離子與水的乙醇溶液與核心材料混合，得到了混合液。在所述混合液中，所述鈣離子的濃度為0.1～10g/L，在某些實(shí)施例中，所述鈣離子的濃度為0.1～8g/L；所述鈣離子的濃度影響著碳酸鈣夾層的厚度和顆粒均勻性，在上述范圍內(nèi)，作為原料的鈣離子濃度越低，形成的碳酸鈣夾層的厚度越薄，過量的鈣離子會(huì)自發(fā)成核，形成純碳酸鈣顆粒雜質(zhì)，則混合液中的鈣離子濃度是調(diào)節(jié)核殼厚度的重要手段。所述混合液中，所述水與乙醇的體積比為1：(100～1000)，在某些實(shí)施例中，所述水與乙醇的體積比為1：(120～800)；混合液中的水含量直接影響納米顆粒的分散性和形貌；過量的水會(huì)導(dǎo)致碳酸鈣結(jié)晶，無法形成均勻分散的碳酸鈣包覆層，過少的水會(huì)導(dǎo)致碳酸鈣表面反應(yīng)活性過高，容易形成團(tuán)簇，無法形成均勻分散的納米顆粒。所述混合液中，所述核心材料的含量為0.1～100mg，所述混合液的體積為1～100mL；在某些實(shí)施例中，所述核心材料的含量為1～80mg，所述混合液的體積為15～100mL；所述核心材料的濃度直接影響了碳酸鈣夾層的厚度和產(chǎn)物均勻性，過少的核心材料會(huì)導(dǎo)致鈣離子相對(duì)過量，形成純碳酸鈣納米顆粒雜質(zhì)，過多的核心材料會(huì)導(dǎo)致鈣離子濃度相對(duì)過低，形成的夾層變薄；過濃的核心材料會(huì)加大顆粒間碰撞的可能性，不利于均勻分散的納米顆粒的形成。

在制備混合液之后，將其與碳酸氫銨的分解產(chǎn)物反應(yīng)，即得到包覆有碳酸鈣層的納米顆粒；為了實(shí)現(xiàn)充分反應(yīng)，所述反應(yīng)的過程具體為：

將所述混合液裝入容器M中，采用封口膜將容器M密封，并預(yù)留小孔；

將所述碳酸氫銨裝入容器N中，采用封口膜將容器N密封，并預(yù)留小孔；

將容器M與容器N置于真空干燥器中，靜置，反應(yīng)后離心。

在上述過程中，所述容器M的體積為1～150mL，所述容器N的體積為1～50mL；所述真空干燥器中的溫度為20～40℃，所述反應(yīng)的時(shí)間為12～48h。此過程為氣相擴(kuò)散法制備非晶碳酸鈣層的過程，制備的碳酸鈣層結(jié)構(gòu)疏松。氣相擴(kuò)散法需要一定濃度的氣氛，碳酸氫銨的分解產(chǎn)物二氧化碳與氨氣濃度過低會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)停滯，過濃則會(huì)加快反應(yīng)速率，降低產(chǎn)物均勻度。

在上述過程中，若所述最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒負(fù)載的藥物為開環(huán)羥基喜樹堿，則需要優(yōu)先對(duì)所述納米顆粒進(jìn)行酸化處理，具體為：

采用濃度為3.7wt％的稀鹽酸將最外層包覆有二氧化硅的納米顆粒分散；所述每5mL稀鹽酸中分散0.1～10mg的多層顆粒。

按照本發(fā)明，在制備得到非晶碳酸鈣包覆層之后，則在其表面制備二氧化硅包覆層；具體過程為：將所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒與乙醇、正硅酸四乙酯、氨水、水、乙二胺四乙酸混合后反應(yīng)，得到包覆有二氧化硅層的納米顆粒。

在上述制備二氧化硅包覆層的過程中，所述混合得到的混合液中，所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒的含量為0.1～1400mg，在具體實(shí)施例中，所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒的含量為10～1000mg；乙醇的體積為10～50mL，在具體實(shí)施例中，所述乙醇的體積為18～42mL；正硅酸四乙酯的體積為1～100μL，所述正硅酸四乙酯的體積為10～70μL；氨水的體積為0.1～1mL，在具體實(shí)施例中，所述氨水的體積為0.3～0.7mL；乙二胺四乙酸的質(zhì)量為0.01～1mg，在所述實(shí)施例中，所述乙二胺四乙酸的質(zhì)量為100～700μg。

在上述過程中，所述包覆有碳酸鈣層的納米顆粒的濃度決定了二氧化硅夾層的厚度與分散性；納米顆粒的濃度與其他反應(yīng)物的用量需要保持一定的比率；高濃度的納米顆粒會(huì)加大顆粒間碰撞的可能性，不利于均勻分散的產(chǎn)物的形成，并且使其他反應(yīng)物相對(duì)不足，導(dǎo)致二氧化硅包被層變??；納米顆粒濃度過低，會(huì)導(dǎo)致其他反應(yīng)物相對(duì)過量，導(dǎo)致二氧化硅包被層變厚。所述正硅酸四乙酯決定了二氧化硅夾層的厚度與致密度；其作為包硅硅源，其用量可以精細(xì)地調(diào)節(jié)二氧化硅夾層的厚度和致密程度；用量較少時(shí)，形成的二氧化硅層薄而疏松，具有較強(qiáng)的通透性和較好的水解性；用量較多時(shí)，形成的二氧化硅層厚而致密，可以阻止水分的滲入和內(nèi)部物質(zhì)的泄露。水的用量將影響二氧化硅層的厚度、致密度和均勻性；水分的含量控制著正硅酸四乙酯的水解速度，過少時(shí)反應(yīng)停滯，較少時(shí)二氧化硅層薄而疏松，較多時(shí)二氧化硅層厚而致密，過多時(shí)反應(yīng)過快，無法形成均勻的包被層。氨水的用量可影響二氧化硅層的厚度、致密度和均勻性；氨水含量控制著反應(yīng)環(huán)境的pH和正硅酸四乙酯的水解速度，過少時(shí)反應(yīng)停滯，較少時(shí)二氧化硅層薄而疏松；較多時(shí)二氧化硅層厚而致密，過多時(shí)反應(yīng)過快，無法形成均勻的包被層。乙二胺四乙酸(EDTA)影響了納米顆粒的分散性和產(chǎn)物的均勻度，EDTA可以鰲合碳酸鈣納米顆粒表面的鈣離子，促進(jìn)納米顆粒更加均勻地分散在反應(yīng)體系中，從而獲得分散性較好，包被均勻的產(chǎn)物。

所述反應(yīng)的時(shí)間為12～36h；所述反應(yīng)時(shí)間影響著二氧化硅夾層的厚度和致密度；提前結(jié)束反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致包被層無法達(dá)到目標(biāo)厚度和致密度。

按照本發(fā)明，在制備完成二氧化硅包覆層之后，在有非晶碳酸鈣包覆層形成的基礎(chǔ)上，又在其表面形成了二氧化硅包覆層，由此得到了核心@包覆核心的非晶碳酸鈣層@包覆非晶碳酸鈣層的二氧化硅層；若上述結(jié)構(gòu)的核殼結(jié)構(gòu)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，此時(shí)則停止反應(yīng)；但是在某種情況下，對(duì)核殼結(jié)構(gòu)具有更高的要求，此時(shí)還可繼續(xù)進(jìn)行如下步驟：

將所述包覆有二氧化硅的納米顆粒與含有鈣離子與水的乙醇溶液混合，再與碳酸氫銨的分解產(chǎn)物反應(yīng)，得到包覆有碳酸鈣的納米顆粒；

將包覆有碳酸鈣的納米顆粒與乙醇、正硅酸四乙酯、氨水、水、乙二胺四乙酸混合后反應(yīng)，得到包覆有二氧化硅的納米顆粒。

上述過程是依次重復(fù)進(jìn)行非晶碳酸鈣層與二氧化硅層的制備過程，按照本發(fā)明，根據(jù)實(shí)際需要，可在非晶碳酸鈣層表面沉積二氧化硅層，再在二氧化硅層表面沉積非晶碳酸鈣層，而得到非晶碳酸鈣層@二氧化硅層@非晶碳酸鈣層@二氧化硅層@非晶碳酸鈣層@二氧化硅層······此類的核殼結(jié)構(gòu)；而制備每個(gè)包覆層的具體步驟與參數(shù)在上述已進(jìn)行了詳細(xì)說明，此處不再進(jìn)行特別的限制。

本申請(qǐng)所描述的多層核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建利用了非晶碳酸鈣在形成過程中容易黏附于二氧化硅表面的傾向，表面帶負(fù)電的包被有二氧化硅的納米顆?？梢宰鳛檎掣胶诵模^為均勻的分散在反應(yīng)體系中，帶正電的鈣離子則在納米顆粒表面與碳酸根反應(yīng)，并逐漸積累，形成均勻的納米級(jí)別的碳酸鈣夾層。

本發(fā)明利用在納米顆粒表面反復(fù)包被碳酸鈣層和二氧化硅夾層，實(shí)現(xiàn)了納米多層核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。不同于蝕刻法或者膠束法，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于可以利用簡(jiǎn)單的方案和溫和無毒的反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)對(duì)每一層夾層的厚度、緊密程度，而實(shí)現(xiàn)其釋藥以及其他功能的設(shè)計(jì)和構(gòu)建。所獲得的非晶碳酸鈣-二氧化硅多層核殼顆粒的結(jié)構(gòu)精巧，成分簡(jiǎn)單，分散性好，生物相容性強(qiáng)，環(huán)境友好，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明制備的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT@silica@ACC@silica具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能。通過與優(yōu)選的乳腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，隨著納米顆粒濃度的提高，腫瘤的相對(duì)成活率隨之下降，并顯著低于相應(yīng)的純藥物對(duì)照組，表明這種載藥納米顆粒具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的核殼結(jié)構(gòu)的構(gòu)建方法進(jìn)行詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受以下實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿的納米顆粒ACC-HCPT_b2的制備

將75.5mg無水氯化鈣和0.25mL水分散在100mL乙醇中，然后將得到的反應(yīng)液裝入100mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置12h；將獲得的反應(yīng)液保留在廣口瓶中，并直接加入0.25mL成分為8mg/mL羥基喜樹堿和32mg/mL氫氧化鈉的水溶液；攪拌均勻后，重新用封口膜密封瓶口，并預(yù)留小孔，然后將裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，并重新分散在無水乙醇中保存，即獲得載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿的納米非晶碳酸鈣核心ACC-HCPT_b2。該產(chǎn)物的形貌如圖1、圖2所示，粒徑均一，約為80nm，呈單分散狀態(tài)。

實(shí)施例2載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿的納米顆粒ACC-HCPT_b6的制備

將75.5mg無水氯化鈣和0.25mL水分散在100mL乙醇中，然后將得到的反應(yīng)液裝入100mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置12h；將獲得的反應(yīng)液保留在廣口瓶中，并直接加入0.25mL成分為24mg/mL羥基喜樹堿和32mg/mL氫氧化鈉的水溶液；攪拌均勻后，重新用封口膜密封瓶口，并預(yù)留小孔，然后將裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，并重新分散在無水乙醇中保存，即獲得載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿的納米非晶碳酸鈣核心ACC-HCPT_b6。該產(chǎn)物的形貌如圖3、圖4所示，粒徑均一，約為60nm，呈單分散狀態(tài)。

實(shí)施例3二氧化硅包被并載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT2@silica15的制備

將2mg實(shí)施例1中制備的載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿的納米顆粒ACC-HCPT_b2分散在20mL乙醇溶液中，順次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、15μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即為包被有二氧化硅殼層的非晶碳酸鈣-開環(huán)羥基喜樹堿納米顆粒ACC-HCPT_b2@silica15。

將上述ACC-HCPT_b2@silica15分散在5mL，濃度為3.7％的稀鹽酸中，靜置2h后離心，并用去離子水洗滌沉淀，獲得二氧化硅包被的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT2@silica15。該產(chǎn)物的形貌如圖5、圖6所示，粒徑均一，約為110nm，呈單分散狀態(tài)。

實(shí)施例4二氧化硅包被并載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT6@silica45的制備

將2mg實(shí)施例2中制備的載負(fù)有開環(huán)羥基喜樹堿的納米顆粒ACC-HCPT_b6分散在20mL乙醇溶液中，順次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、45μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即為包被有二氧化硅殼層的非晶碳酸鈣-開環(huán)羥基喜樹堿納米顆粒ACC-HCPT_b6@silica45。

將上述ACC-HCPT_b6@silica45分散在5mL，濃度為3.7％的稀鹽酸中，靜置2h后離心，并用去離子水洗滌沉淀，獲得二氧化硅包被的載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的納米顆粒HCPT6@silica45。該產(chǎn)物的形貌如圖7、圖8所示，粒徑均一，約為90nm，呈單分散狀態(tài)。

實(shí)施例5載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20的制備

將20mg二水氯化鈣和150μL的水分散在18mL乙醇中，取3mg載負(fù)有羥基喜樹堿的納米顆粒即實(shí)施例4中獲得的產(chǎn)物HCPT6@silica45分散在上述溶液中，獲得反應(yīng)液；將反應(yīng)液裝入20mL容積廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，再分散在無水乙醇中保存，即獲得最外層為非晶碳酸鈣的多層核殼載藥顆粒HCPT6@silica45@ACC20。該產(chǎn)物的形貌如圖9、圖10所示，粒徑均一，約為150nm，呈單分散狀態(tài)。

實(shí)施例6載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20的制備

取15mg實(shí)施例5中獲得的產(chǎn)物，分散在20mL的乙醇中，并依次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、20μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即獲得最外層包被有二氧化硅，并且載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20。該產(chǎn)物的形貌如圖11、圖12、圖13、圖14所示，其中圖11、圖12為分散在乙醇中的樣品的透射電鏡照片，樣品粒徑均一，約為160nm，呈單分散狀態(tài)。圖13、圖14為分散在水中的樣品的透射電子照片，兩層二氧化硅間的碳酸鈣流失，形成空腔。

實(shí)施例7載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica10的制備

將20mg二水氯化鈣和90μL的水分散在18mL乙醇中，取1mg載負(fù)有羥基喜樹堿的納米顆粒即實(shí)施例3中獲得的產(chǎn)物HCPT2@silica15分散在上述溶液中，獲得反應(yīng)液；將反應(yīng)液裝入20mL容積廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，再分散在無水乙醇中保存，即獲得最外層為非晶碳酸鈣的多層核殼載藥顆粒HCPT2@silica15@ACC20。

將上述產(chǎn)物分散在20mL的乙醇中，并依次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、10μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即獲得最外層包被有二氧化硅，并且載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica10。該產(chǎn)物的形貌如圖15所示，水處理后具有疏松的碳酸鈣夾層，對(duì)藥物緩釋作用較弱。

實(shí)施例8載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica15的制備

將20mg二水氯化鈣和90μL的水分散在18mL乙醇中，取1mg載負(fù)有羥基喜樹堿的納米顆粒即實(shí)施例3中獲得的產(chǎn)物HCPT2@silica15分散在上述溶液中，獲得反應(yīng)液；將反應(yīng)液裝入20mL容積廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，再分散在無水乙醇中保存，即獲得最外層為非晶碳酸鈣的多層核殼載藥顆粒HCPT2@silica15@ACC20。

將上述產(chǎn)物分散在20mL的乙醇中，并依次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、15μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即獲得最外層包被有二氧化硅，并且載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica15。該產(chǎn)物的形貌如圖16所示，水處理后具有較疏松的碳酸鈣夾層，對(duì)藥物緩釋作用較強(qiáng)。

實(shí)施例9載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica20的制備

將20mg二水氯化鈣和90μL的水分散在18mL乙醇中，取1mg載負(fù)有羥基喜樹堿的納米顆粒即實(shí)施例3中獲得的產(chǎn)物HCPT2@silica15分散在上述溶液中，獲得反應(yīng)液；將反應(yīng)液裝入20mL容積廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，再分散在無水乙醇中保存，即獲得最外層為非晶碳酸鈣的多層核殼載藥顆粒HCPT2@silica15@ACC20。

將上述產(chǎn)物分散在20mL的乙醇中，并依次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、20μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即獲得最外層包被有二氧化硅，并且載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC20@silica20。該產(chǎn)物的形貌如圖17所示，水處理后具有致密的碳酸鈣夾層，對(duì)藥物緩釋作用顯著。

實(shí)施例10載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC2@silica20的制備

將2mg二水氯化鈣和90μL的水分散在18mL乙醇中，取1mg載負(fù)有羥基喜樹堿的納米顆粒即實(shí)施例3中獲得的產(chǎn)物HCPT2@silica15分散在上述溶液中，獲得反應(yīng)液；將反應(yīng)液裝入20mL容積廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將碳酸氫銨裝入20mL容積的廣口瓶中，用密封膜封口，并預(yù)留小孔；將上述裝有反應(yīng)液的廣口瓶和裝有碳酸氫銨的廣口瓶一同放入真空干燥器中，在30℃的環(huán)境下靜置24h；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，獲得沉淀，再分散在無水乙醇中保存，即獲得最外層為非晶碳酸鈣的多層核殼載藥顆粒HCPT2@silica15@ACC2。

將上述產(chǎn)物分散在20mL的乙醇中，并依次加入0.4mL氨水、300μgEDTA、20μL正硅酸四乙酯和0.4mL水，攪拌24h；反應(yīng)結(jié)束后，將上述混合物離心，獲取沉淀，即獲得最外層包被有二氧化硅，并且載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT2@silica15@ACC2@silica20。該產(chǎn)物的形貌如圖18所示，水處理后碳酸鈣夾層流失，在兩層二氧化硅層間形成寬度約為15nm的空腔，具有較弱的緩釋作用。

實(shí)施例11

在96孔板中均勻植入4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞，并使細(xì)胞密度達(dá)到75％～80％；培養(yǎng)24h后，移除培養(yǎng)基，每孔加入100μL載負(fù)有疏水性藥物羥基喜樹堿的多層核殼納米顆粒HCPT6@silica45@ACC20@silica20，濃度梯度為：800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL和50μg/mL，并設(shè)置一組不含載藥顆粒，只加相同體積培養(yǎng)基的空白對(duì)照。

為了探討釋藥行為對(duì)細(xì)胞生長的影響，設(shè)置純藥物組，并使其用量與載藥顆粒載負(fù)的藥物總量相同，則加藥體積為100μL，藥物分散液為培養(yǎng)基，濃度梯度為775μg/mL、387.5μg/mL、193.75μg/mL、96.88μg/mL、48.44μg/mL、0μg/mL。

將藥物或納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)36h或者48h后，吸除上清，加入溶解于培養(yǎng)基且濃度為0.5mg/mL的MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán))溶液，每孔加入的體積為100μL。將MTT與細(xì)胞避光共培養(yǎng)2h后，吸去上清，加入120μL的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10min，放入酶標(biāo)儀中，測(cè)量490nm處的吸光值。計(jì)算相對(duì)存活率如圖19和圖20所示，圖19與圖20中■表示加入載藥顆粒后的細(xì)胞相對(duì)存活率，●表示加入純藥物后的細(xì)胞相對(duì)存活率；由圖19和圖20可知，載有相同量藥物的納米顆粒表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用；當(dāng)納米顆粒的濃度高于400μg/mL時(shí)，存活率下降趨勢(shì)減緩，原因可能在于納米顆粒濃度依賴性的降解和控釋作用。

實(shí)施例12多層核殼結(jié)構(gòu)對(duì)疏水性藥物羥基喜樹堿釋放的影響

(1)繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

將一定質(zhì)量的羥基喜樹堿分散在二甲基亞砜(DMSO)中，配制濃度為5.12ug/ml的溶液，并依次進(jìn)行5倍梯度稀釋，然后分別加入相同體積的三羥甲基氨基甲烷-順丁烯二酸緩沖液(Tris-MA Buffer)，制備5個(gè)濃度梯度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度，熒光檢測(cè)的條件為：激發(fā)光波長375nm，發(fā)射光波長547nm。以標(biāo)準(zhǔn)樣濃度(ug/ml)為橫坐標(biāo)，發(fā)射光相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，如圖21所示繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖21范圍內(nèi)，羥基喜樹堿濃度與相對(duì)熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系。

(2)繪制藥物累積釋放曲線

取47ug實(shí)施例4中獲得的產(chǎn)物HCPT6@silica45，或者286.7ug實(shí)施例6中獲得的產(chǎn)物HCPT6@silica45@ACC20@silica20，分別分散在1mL的PH為7.4的三羥甲基氨基甲烷-順丁烯二酸緩沖液(Tris-MA Buffer)中，混合均勻后置于37℃恒溫箱中振搖；間隔時(shí)間取樣，離心，獲得上清并加入相同體積的二甲基亞砜(DMSO)；混合均勻后檢測(cè)樣品的熒光發(fā)射光強(qiáng)；所有時(shí)間點(diǎn)均設(shè)有3個(gè)平行樣；熒光檢測(cè)的條件為：激發(fā)光波長375nm，發(fā)射光波長547nm；由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出藥物的累積釋放百分比；以釋藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，釋藥百分比為縱坐標(biāo)，如圖22所示繪制藥物累積釋放曲線；其中■代表HCPT6@silica45的釋藥曲線，●代表HCPT6@silica45@ACC20@silica20的釋藥曲線；由圖22可知，未包被核殼結(jié)構(gòu)的HCPT6@silica45組的釋藥時(shí)間段為2.5-4h，藥物釋放早而快速；包被有核殼結(jié)構(gòu)的HCPT6@silica45@ACC20@silica20組的釋藥時(shí)間段為4-10h；藥物開始釋放的時(shí)間延后，藥物釋放的時(shí)間跨度顯著延長，實(shí)現(xiàn)了藥物的緩釋。

以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

對(duì)所公開的實(shí)施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。