專利名稱：枯草芽孢桿菌ds3的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域,尤其涉及一種枯草芽孢桿菌(feci77w5· Subtilis)DS3。
背景技術：
皂素(如薯蕷皂素)生產廢水具有廢水量小、色度大、有機物濃度高、酸度大、溫度高等特點，可生化性差，是一種非常難處理的廢水。根據《皂素工業(yè)水污染物排放標準》(GB20425-2006)中具體規(guī)定，自2009年起COD排放量應低于300mg/L。目前皂素水解原液COD濃度達到20000-40000mg/L，綜合廢水 COD濃度約為4000-12000mg/L。若直接排入水體，會導致水體的有機污染物濃度大幅度增力口，由此引起江河湖泊嚴重污染，不僅直接影響了人們的生存環(huán)境，也造成了國民經濟的巨大損失。皂素廢水中含有大量有機污染物，其中部分毒性醛、酮、酚類物質對污水處理系統(tǒng)里污泥中的微生物具有抑制作用，一般微生物不能正常生長。同時，皂素廢水中硫酸根濃度高，約為8000mg/L左右，在高鹽度廢水的生物處理系統(tǒng)中，由于鹽度的變化往往會破壞微生物的細胞膜和菌體內的酶，致使污泥活性下降。同時，微生物對環(huán)境具有一定的適應能力，在一定鹽度范圍內微生物通過自身的滲透調節(jié)機制平衡細胞內的滲透壓或保護細胞內的原生質，調節(jié)自身新陳代謝以適用鹽度的變化?；钚晕勰嘣诤}環(huán)境中經過一段時間馴化后，將具有一定的耐鹽性。目前對皂素廢水的處理多采用物理或化學的方法，現(xiàn)有技術中還沒有微生物降解方法和用于降解皂素廢水有機污染物的菌株的報導。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種枯草芽孢桿菌DS3，它能有效去除含有高濃度硫酸根離子的皂素廢水有機污染物。本發(fā)明為解決上述技術問題所采取的技術方案為
枯草芽孢桿菌DS3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010146?？莶菅挎邨U菌DS3的菌落形態(tài)為菌落呈白色或淡黃色、不透明、圓形、表面粗糙，中間有皺起、邊緣不整齊；需氧，革蘭氏陽性芽孢桿菌。最適生長PH值6. 5 7. 5，最適生長溫度25-35。。。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明取得的有益效果是枯草芽孢桿菌DS3在高濃度硫酸根離子環(huán)境中具有較強的生長能力和良好的去除皂素廢水中有機污染物的能力，該菌株能在72小時之內去除皂素廢水中的COD 2150mg/L，去除效率達到50. 71%。本發(fā)明為降解皂素廢水高濃度有機污染物提供了有用的菌源，拓寬了對枯草芽孢桿菌功能方面的應用，具有較強的應用價值。


圖1為枯草芽孢桿菌DS3的PCR產物瓊脂糖電泳圖(左為Marker ;右為擴增產物)。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的描述，當然下述實施例不應理解為對本發(fā)明的限制。一、枯草芽孢桿菌DS3的篩選
(一)、材料準備1、實驗廢水和池底污泥取自湖北省十堰市某黃姜皂素生產廠生產排放廢水的生化處理系統(tǒng)。2、培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基3g/L牛肉膏，10g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉，20g/L瓊脂，pH6. 8。富集培養(yǎng)基(g/L) 30g/L磷酸氫二鉀，100mg/L無水硫酸鎂，10g/L磷酸二氫鉀，10mg/L四水硫酸猛,5g/L硝酸銨，10mg/L七水硫酸亞鐵，lg/L硫酸鈉,5mg/L氯化|丐，冰箱保存。使用時，稀釋10倍，加入10%葡萄糖，pH值7. O 7. 2。LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10. 0g/L，蒸餾水IOOOmL,ρΗ7·O。LB固體培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水IOOOmL,瓊脂 15g/L (固)，ρΗ7· O。LB斜面培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，氯化鈉10.0g/L，蒸餾水IOOOmL,瓊脂 20g/L (固)，ρΗ7· O。3、實驗儀器和設備
國華SHA-B恒溫振蕩器，
東器SPX生化培養(yǎng)箱，
立式壓力蒸汽滅菌器，
光學顯微鏡-----Olympus有限公司，
pH 計等-----sarporiusPD-10,
超凈工作臺，
PTC200 型 PCR 儀，
電泳儀及電泳槽，
UVP凝膠紫外觀測儀。(二)、菌株的篩選分離與純化1.篩選分離
1)稱取2克黃姜皂素生產廠廢水處理系統(tǒng)中酸化池尾區(qū)的池底污泥樣品，加入事先滅菌好的裝有IOOmL無菌水的250mL的三角瓶內，30°C恒溫振蕩200rpm，將菌膠團打碎，得泥水混合物，備用；
2)將泥水混合物轉入裝有IOOmL篩選培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，30°C恒溫靜置培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁，得到菌懸液A ;
3)取5mL菌懸液A于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周；將培養(yǎng)一周后的菌懸液取5 mL于裝100 mL新鮮的篩選培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)一周，重復操作5-6次，最后得到的菌懸液B ；
2.用無菌移液管吸取O. 5mL上述菌懸液B，稀釋涂布于固體培養(yǎng)基上。37°C左右恒溫培養(yǎng)3d，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，在LB固體培養(yǎng)基上反復劃線培養(yǎng)三次直至獲得單一菌株，并于LB斜面培養(yǎng)基上保存，得到一株菌株DS3，即枯草芽孢桿·菌DS3。二、枯草芽孢桿菌DS3的鑒定1、對枯草芽孢桿菌DS3的鑒定
對枯草芽孢桿菌DS3進行了生理生化的鑒定、16S rRNA分子的鑒定并結合Biolog微生物自動分析系統(tǒng)，從分子水平確定枯草芽孢桿菌DS3的種屬。16S rRNA序列分析主要按照以下步驟
I)細菌核DNA的提取
使用北京百泰克生物技術有限公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒。2) 16S rRNA 基因的 PCR 擴增
PCR 擴增引物參照 Weisburg 等人(Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A. 16Sribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. J. Bacteriol, 1991,173: 697 - 703)的方法合成。P1:正向引物 5 ’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ’
P2 :反向引物 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT3’
在50mL反應體積中，加入ImL模板DNA (O.1mg), O. 5mL Pl和P2 (終濃度為O. 5mM),ImLdNTP (每種 NTP0. 2 禮)，O. 5mLTaq 聚合酶(2 U)和 5 mL IOXPCR 緩沖液。PCR 擴增條件為:94°C預變性5 min ;在94°C變性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)30次;最后72 ° C終延伸10 min。3) PCR產物的回收
將PCR產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1. 5mL離心管中加2倍體積TE，65°C水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的lOmol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用濃度為70%乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水。4) 16S rDNA的全序列測定和分析
PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人(Hiraishi A, Shin Y K, Ueda Y.Automated Sequencing of PCR-amplified 16S rDNA on ‘Hydrolink’ Gels[J]. J.Microbiol. Methods, 1994, 19: 145 — 154)方法合成。P-f CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；
P-r GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。加入ImL模板DNA (〈0· lmg)，PCR擴增 30 個循環(huán)(94 °C I min, 55 °C 30s, 72 。C 2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應。然后,在Applied Biosystem373 A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。2、16S rRNA 序列測定
本發(fā)明采用對16SrRNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑒定。以細菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度為1437bp的擴增帶(用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1所示。PCR產物經純化后，測定其全序列，其序列見SEQ ID NO:1。三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
枯草芽孢桿菌DS3的菌落形態(tài)為菌落呈白色或淡黃色、不透明、圓形、表面粗糙，中間有皺起、邊緣不整齊；需氧，革蘭氏陽性芽孢桿菌。最適生長PH值6. 5 7. 5，最適生長溫度25-35 °C。不能在60 °C生長。四、枯草芽孢桿菌DS3為新的菌株 采用BLAST分析法對菌株DS3的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據庫比較分析發(fā)現(xiàn)，菌株DS3與枯草芽孢桿菌心Subtilis)的同源性高達99. 0%。綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結果，菌株DS3命名為枯草芽孢桿菌{Bacillus SubtHis)收 。查閱有關資料，尚無枯草芽孢桿菌屬有關降解皂素廢水能力研究的報道?？莶菅挎邨U菌(feci77心為新的菌株，已于2010年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC M 2010146。本發(fā)明從湖北省十堰市某黃姜皂素生產廠排放廢水的生化處理系統(tǒng)污泥中篩選分離出這一株細菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解皂素廢水中有機污染物的功能。這拓寬了人們對枯草芽孢桿菌UaciBm Subtilis)在其功能方面的應用研究思路，并為降解高濃度有機污染物黃姜皂素廢水及其他皂素廢水提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。五、枯草芽孢桿菌DS3的應用
挑取活化后的枯草芽孢桿菌(Mcillus Subtilis) DS3單菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的枯草芽孢桿菌(feci77w5· Subtilis)!)^ :阜素廢水(即實驗廢水,取自湖北省十堰市某黃姜皂素生產廠排放廢水的生化處理系統(tǒng))的體積比為O. 5-2 :100接種，30-35°C恒溫培養(yǎng)，pH值為6-8，反應48-72小時。在本實施例中，具體的應用方法為用接種環(huán)挑取單菌落DS3，于50mL LB液體培養(yǎng)基中30°C震蕩培養(yǎng)過夜；取ImL菌液接種于9mL皂素廢水(脫酸水初始COD 4700 mg/L左右、pHl.28)中；另取一支裝有9mL皂素廢水的試管，加入ImL LB液體培養(yǎng)基作為空白對t匕。調節(jié)水樣pH值約為7. 0，置于35°C、150rpm振蕩培養(yǎng)3d，測定水樣的COD值，從而計算得到菌株對廢水的COD去除效率。該菌株能在72小時之內去除皂素廢水中的C0D2150mg/L，去除效率達到50. 71%。需要說明的是，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
權利要求
1.枯草芽孢桿菌DS3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010146。
全文摘要
本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌DS3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2010146。該枯草芽孢桿菌DS3在高濃度硫酸根離子環(huán)境中具有較強的生長能力和良好的去除皂素廢水中有機污染物的能力，該菌株能在72小時之內去除皂素廢水中的COD2150mg/L，去除效率達到50.71%。本發(fā)明為降解皂素廢水高濃度有機污染物提供了有用的菌源，拓寬了對枯草芽孢桿菌功能方面的應用，具有較強的應用價值。
文檔編號C02F3/34GK103013874SQ201210537890
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權日2012年12月13日
發(fā)明者鄭丹, 鮑建國 申請人:中國地質大學(武漢)