枯草芽孢桿菌se201412及富有機(jī)硒菌劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)SE201412，其保藏編號(hào)為CCTCC No.M 2015708，該菌株十分耐硒，能在含硒培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)硒含量達(dá)5000mg/L?12000mg/L的發(fā)酵液，將該發(fā)酵液制備成富有機(jī)硒菌劑施用于處于生長(zhǎng)期作物的液面，能夠生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品，且生產(chǎn)得到的農(nóng)產(chǎn)品能夠達(dá)到富有機(jī)硒糧、油、水果、蔬菜、干果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且能夠提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，產(chǎn)量，增強(qiáng)農(nóng)作物抗病能力。CCTCC NO：M201570820151126
【專(zhuān)利說(shuō)明】
枯草芽孢桿菌SE201412及富有機(jī)砸菌劑
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及枯草芽孢桿菌SE201412及富有機(jī)硒菌劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 硒是人類(lèi)和動(dòng)物必須的微量元素，缺硒可引40多種起多種疾病，目前研究表明，每 天每人滿(mǎn)足50微克硒，可使人健康長(zhǎng)壽，而且通過(guò)食品補(bǔ)有機(jī)硒被認(rèn)為是最安全，最方便的 手段。
[0003] 全世界75 %的國(guó)家和地區(qū)缺硒少硒，我國(guó)缺硒省市達(dá)20多個(gè)，土壤中硒含量約 0.03-0. lmg/kg，向土壤補(bǔ)硒是獲得富硒農(nóng)產(chǎn)品（食品）的一種有效辦法。多年來(lái)，人們以富 硒礦石、富硒煤矸石等原料，經(jīng)粉碎、堿處理得到少部分(20 % )可溶性無(wú)機(jī)硒，與氮、磷、鉀、 銅、鋅、鐵、鎂、硼等無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)質(zhì)復(fù)混成富硒肥料，或把硒制備成硒酸鈉、亞硒酸鈉，并以 其溶液再與無(wú)機(jī)或有機(jī)肥料混配成富硒肥料，噴施到作物葉片或直接施到土壤中，這些富 硒肥料雖然可以生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品和富硒食品，但作物對(duì)肥料中無(wú)機(jī)硒的利用率僅10 % -15%〇
[0004] 此外，一方面，富硒礦石、富硒煤矸石中伴生有超標(biāo)的重金屬鎘、鉛、砷、汞、釩，使 用富硒礦石、富硒煤矸石礦粉作為富硒肥料，易污染良田。另一方面，硒酸鈉、亞硒酸鈉價(jià)格 每噸超過(guò)百萬(wàn)元，如果植物的總利用率僅為10%-15%，則生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品費(fèi)用太高。
[0005] 農(nóng)用微生物菌劑是一類(lèi)有別于無(wú)機(jī)復(fù)合肥料、有機(jī)肥料的功能性微生物肥料。農(nóng) 用微生物菌劑利用有益微生物轉(zhuǎn)化硒，把無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，以提高農(nóng)作物對(duì)硒利用率， 進(jìn)而提尚農(nóng)廣品含砸量。
[0006] 目前富硒微生物包括：富硒酵母、富硒食用菌、光合細(xì)菌等。專(zhuān)利CN200710010871 發(fā)明的一種富硒聯(lián)合固氮菌劑，在制備菌劑中加入可溶性無(wú)機(jī)硒，利用固氮菌將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn) 化為有機(jī)硒，但其制劑中只采用固氮菌，僅具有單一固氮生理功能的富硒微生物肥料并作 為作物根部使用的固體肥料，不能直接大量生產(chǎn)出水溶性有機(jī)硒。
[0007] 專(zhuān)利CN102618469A，發(fā)明名稱(chēng):一種莢膜紅細(xì)菌及其應(yīng)用，公開(kāi)了一種莢膜紅細(xì)菌 AYGHJ-16，屬光合細(xì)菌，利用光能對(duì)物質(zhì)進(jìn)行代謝，促進(jìn)無(wú)機(jī)硒的轉(zhuǎn)化和吸收，并有固氮和 固碳作用，不能直接大量生產(chǎn)出水溶性有機(jī)硒。
[0008] 專(zhuān)利100512666C，發(fā)明名稱(chēng):一種含硒微生物飼料添加劑及其制備方法，公開(kāi)了利 用微生物活菌為紅假單孢菌、納豆菌芽孢桿菌和酵母菌進(jìn)行液體發(fā)酵、固體發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)無(wú)機(jī) 硒的微生物轉(zhuǎn)化，不能直接大量生產(chǎn)出水溶性有機(jī)硒。
[0009]施用水溶性有機(jī)砸是大幅度提尚作物對(duì)砸利用率和生廣富有機(jī)砸糧、油、水果、疏 菜、干果的重要途徑。但是，目前市場(chǎng)生產(chǎn)的富硒酵母不能直接生產(chǎn)出水溶有機(jī)硒，而現(xiàn)有 技術(shù)也沒(méi)有生產(chǎn)出水溶有機(jī)硒超過(guò)3000mg/kg的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年的大量反復(fù)篩選，得 到了一株十分耐硒，且能分泌水溶性有機(jī)硒的菌株。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案之一是:一種枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)SE201412,該 菌已于2015年11月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC;地址：中國(guó)武漢，武漢 大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號(hào)CCTCC NO.M2015708。
[0012] 該菌株是從湖北恩施市鹽業(yè)復(fù)烤廠發(fā)酵煙草廢棄物中分離得到的，該菌株十分耐 硒，能在無(wú)機(jī)硒高達(dá)30000mg/kg濃度的發(fā)酵液中正常生長(zhǎng)，且能在發(fā)酵液中分泌水溶性有 機(jī)硒5000mg/L-12000mg/L，其中所述的水溶性有機(jī)硒為但不局限于硒氨基酸、硒低聚糖、硒 肽中的一種或多種。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二是:所述枯草芽孢桿菌SE201412在生產(chǎn)富有機(jī)硒菌劑中的 應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的技術(shù)方案之三是：一種富有機(jī)硒菌劑的制備方法，將枯草芽孢桿菌 SE201412接種于含硒培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液即得。
[0015] 所述含硒培養(yǎng)基可在本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入亞硒酸鈉得到。本發(fā)明優(yōu)選 的含硒培養(yǎng)基為:葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化鈉2-6g/ L，亞硒酸鈉0.3-30g/L，pH6.8-7.6。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的含硒培養(yǎng)基為:葡萄糖6g/L，蔗糖 5g/L，牛肉膏 5g/L，蛋白胨 1 Og/L，氯化鈉 4g/L，亞硒酸鈉 0.5-22g/L，pH7.2-7.6。
[0016] 在大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中，所述含硒培養(yǎng)基內(nèi)還添加有消泡劑，所述消泡劑可根據(jù)本 領(lǐng)域常識(shí)進(jìn)行選擇，本發(fā)明優(yōu)選GPE-6330生物發(fā)酵專(zhuān)用消泡劑，所述消泡劑的用量?jī)?yōu)選為 0·5_1·5g/L〇
[0017] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可依據(jù)本領(lǐng)域常識(shí)確定，本發(fā)明優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:溫 度30-37°C，壓力0.04-0.06MPa，攪拌轉(zhuǎn)速160-220r/min，發(fā)酵液體積與通入空氣體積比1: (0.2-0.4)。進(jìn)一步優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：溫度32-35°(：，壓力0.051〇^，攪拌轉(zhuǎn)速190-200r/min，發(fā)酵液體積與通入空氣體積比1:0.3。
[0018] 發(fā)酵培養(yǎng)采用的菌株是經(jīng)過(guò)活化和擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的，所述活化和擴(kuò)大培養(yǎng)可采 用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。將擴(kuò)大培養(yǎng)后的種子液接種進(jìn)入含硒培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培 養(yǎng)，接種量為本領(lǐng)域常規(guī)接種量，優(yōu)選為1 -2.5 %。
[0019] 其中，所述活化采用的固體培養(yǎng)基為:葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L， 蛋白胨8-12g/L，氯化鈉2-6g/L，瓊脂15-20g/L，pH6 · 8-7 · 6。優(yōu)選為，葡萄糖6g/L，鹿糖5g/L， 牛肉膏5g/L，蛋白胨1 Og/L，氯化鈉4g/L，瓊脂18g/L，pH7.2-7.6。
[0020] 所述活化的具體操作為:將固體培養(yǎng)基加入試管內(nèi)，滅菌后擺斜面，冷卻凝固，將 枯草芽孢桿菌SE201412接種在培養(yǎng)基上，于30-35°C培養(yǎng)試管斜面長(zhǎng)滿(mǎn)菌。
[0021 ]所述擴(kuò)大培養(yǎng)采用的種子液培養(yǎng)基為:葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/ L，蛋白胨8-12g/L，氯化鈉2-6g/L，pH6 · 8-7 · 6。優(yōu)選為，葡萄糖6g/L，鹿糖5g/L，牛肉膏5g/L， 蛋白胨 1 〇g/L，氯化鈉 4g/L，pH7 · 2-7 · 6。
[0022] 所述擴(kuò)大培養(yǎng)的條件為:溫度30-37°C，壓力0.04-0.061〇^，攪拌轉(zhuǎn)速160-22(^/ 11^11，發(fā)酵液體積與通入空氣體積比1 :(0.2-0.4)，發(fā)酵時(shí)間12-2411。優(yōu)選為，溫度32-35°(：， 壓力0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速190-200r/min，發(fā)酵液體積與通入空氣體積比1:0.3，發(fā)酵時(shí)間14-18h〇
[0023] 在發(fā)酵制備富有機(jī)硒菌劑時(shí)，將菌株(或種子液)接入發(fā)酵培養(yǎng)基后，每隔2-4小時(shí) 取發(fā)酵液樣品，用酸度計(jì)測(cè)定pH并保持發(fā)酵液pH在6.8-7.6之間；同時(shí)，用可見(jiàn)光分光光度 計(jì)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞濃度，當(dāng)前后兩次取樣檢測(cè)到的細(xì)菌細(xì)胞濃度在最大吸光值處沒(méi)有明顯增 加時(shí)，即可認(rèn)定發(fā)酵結(jié)束。
[0024]經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，發(fā)酵時(shí)間為12_24h，優(yōu)選為14-18h〇
[0025]本發(fā)明所述菌株可在較大的亞硒酸鈉范圍內(nèi)（0.3_30g/L)進(jìn)行發(fā)酵，在工業(yè)化大 生產(chǎn)過(guò)程中，為了充分確保發(fā)酵效果，一般而言，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的亞硒酸鈉用量超過(guò)lg/L 時(shí)，采用分批加入亞硒酸鈉進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的方式。
[0026]優(yōu)選地，在配制培養(yǎng)基的時(shí)候，先加入25-35 %重量的亞硒酸鈉，剩余的亞硒酸鈉 用水溶解后，在發(fā)酵過(guò)程中，分批逐漸加入發(fā)酵罐內(nèi)。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選地，先將25-35 %重量的亞硒酸鈉加入起始發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后將剩余 的亞硒酸鈉用其重量5-7倍的水溶解后，在發(fā)酵2-4h后每隔1-1.5h向發(fā)酵體系中加入適量 溶液。
[0028]所述適量沒(méi)有特殊限制，以能夠在發(fā)酵結(jié)束前加完，且最后一次添加后發(fā)酵尚未 結(jié)束，能夠繼續(xù)發(fā)酵一段時(shí)間以消耗新加入的亞硒酸鈉為宜。
[0029]再進(jìn)一步優(yōu)選地，先將30%重量的亞硒酸鈉加入起始發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后將剩余 的亞硒酸鈉用其重量6倍的水溶解后，在發(fā)酵3h后每隔lh向發(fā)酵體系中加入溶解液總體積 1/10的溶液。
[0030] 采用上述任意一種制備方法得到的發(fā)酵液，其有機(jī)硒含量為500mg/kg-30000mg/ kg，其中溶于水的有機(jī)硒占總有機(jī)硒的60%-90%，其中10%-40%為微生物自身合成的有 機(jī)硒，并經(jīng)酶降解后可生產(chǎn)出完全溶于水的有機(jī)硒。此外，此種方法培養(yǎng)得到的發(fā)酵液，其 內(nèi)并不含有鎘、鉛、砷、汞等重金屬，在作為菌肥應(yīng)用于作物種植時(shí)，更加安全，不會(huì)對(duì)土壤 造成重金屬污染。
[0031 ]本發(fā)明的技術(shù)方案之四是：一種富有機(jī)硒菌劑，所述富有機(jī)硒菌劑是采用上述任 意一種制備方法得到的。
[0032] 具體地，發(fā)酵菌劑可以為液體或固體粉末，例如，可以直接取發(fā)酵液包裝后制成液 體菌劑;也可以將發(fā)酵液濃縮后再包裝制成液體菌劑;或者將發(fā)酵液濃縮后經(jīng)過(guò)冷凍干燥 制成固體粉末菌劑。具體的制備方法可為:發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，采用固液離心機(jī)處理發(fā)酵液， 取上清液;或濃縮所述上清液取濃縮液或?qū)⑸锨逡簼饪s、干燥后取干粉即得水溶性有機(jī)硒。 對(duì)于離心后的沉淀物可采用如下方法回收利用：向沉淀物中加入纖維素酶酶解，離心酶解 液，再將酶解沉淀物用蛋白酶酶解后離心，合并兩次離心液，其內(nèi)仍含有水溶性有機(jī)硒。也 可將兩次離心液濃縮得濃縮液;或?qū)饪s液凍干得干粉。
[0033] 本發(fā)明所述的富有機(jī)硒菌劑不添加防腐劑即可長(zhǎng)期保存，且能保持良好的功效。 在具體的生產(chǎn)中，也可以向其中加入防腐劑以進(jìn)一步延長(zhǎng)其保存期限，所述防腐劑可選自 E-聚賴(lài)氨酸、脫氫乙酸鈉、丙酸鈣、雙乙酸鈉、乳酸鈉、乳酸鏈球菌素中的一種或幾種。防腐 劑的加入量可依據(jù)本領(lǐng)域常識(shí)而定，本發(fā)明優(yōu)選的防腐劑的加入質(zhì)量占發(fā)酵液體積的 0·1%-0·6%〇
[0034] 優(yōu)選地，富有機(jī)硒菌劑中有機(jī)硒含量為300mg/kg-30000mg/kg。
[0035]優(yōu)選地，富有機(jī)硒菌劑中枯草芽孢桿菌SE201412的活菌數(shù)為10-30億/mL，進(jìn)一步 優(yōu)選為15-25億/mL。
[0036]本發(fā)明的技術(shù)方案之五是：富有機(jī)硒菌劑在作物種植中的應(yīng)用。其中，所述作物優(yōu) 選為糧食作物、油料作物、水果、蔬菜、干果、木本油料中的任何一種。
[0037]具體地，所述糧食作物包括但不局限于水稻、玉米、小麥、蕎麥、馬鈴薯、紅薯;所述 油料作物包括但不局限于大豆、芝麻、油菜、花生;所述水果包括但不局限于荔枝、龍眼、香 蕉、橙子，橘子、蓮霧、蘋(píng)果、棗;所述蔬菜包括但不局限于白菜、蘿卜、花菜、大蒜、蔥、芹菜，所 述干果包括但不局限于核桃、板栗;所述木本油料包括但不局限于油茶、油桐。
[0038]所述富有機(jī)硒菌劑的具體應(yīng)用方式為：用水稀釋所述富有機(jī)硒菌劑至有機(jī)硒含量 為20mg/kg-5 Omg/kg，使用稀釋后的富有機(jī)硒菌劑對(duì)生長(zhǎng)期的作物葉面或經(jīng)濟(jì)林葉面噴施 1_3次即可。
[0039] 優(yōu)選地，噴施2或3次時(shí)，噴施間隔時(shí)間為6-8天。
[0040] 優(yōu)選地，噴施量為10-50L/667M2。
[0041]采用本發(fā)明的富有機(jī)硒菌劑對(duì)生長(zhǎng)期的作為進(jìn)行干預(yù)，能夠使得作物中總硒含量 達(dá)到0.01-0.0511^/1^，其中有機(jī)硒達(dá)到80%-85%，達(dá)到富有機(jī)硒糧、油、水果、蔬菜、干果的 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并能夠提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，產(chǎn)量和增強(qiáng)農(nóng)作物抗病能力。
[0042]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，即得本發(fā)明各較佳 實(shí)施例。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1為菌株SE201412顯微鏡（1000X)觀察照片；
[0044] 圖2為菌株SE201412的平板菌落形態(tài)；
[0045] 圖3為菌株SE201412進(jìn)化樹(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明涉及到的原料 或試劑均可市購(gòu)獲得;涉及到的操作如無(wú)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。本發(fā)明采用GB/ T5009.93-2003《食品中硒的測(cè)定》、GB/T5009.11-2003《食品中總砷和無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》、GB/ T23942-2009化學(xué)試劑、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法通則、杭州市農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范 DB3301檢測(cè)發(fā)酵液中的有機(jī)硒和重金屬含量。
[0047]其中，枯草芽孢桿菌SE201412的分離鑒定方法如下：
[0048] 分離:從湖北恩施市鹽業(yè)復(fù)烤廠發(fā)酵煙草廢棄物中取材料lg，在無(wú)菌超凈工作臺(tái) 上，用無(wú)菌水振蕩稀釋?duì)?^-ΠΓ8，用移液管取0. lml-0.2ml移入已滅菌倒有專(zhuān)用培養(yǎng)基（自 來(lái)水1000ml，硒（由亞硒酸鈉提供)5g、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化鈉、0.5g牛肉膏升、酵 母膏0.25%、磷酸氫二鉀0.1 %、PH 7.5)的培養(yǎng)皿上，用涂布棒涂勻，無(wú)菌培養(yǎng)，選取在高硒 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛的單菌落。
[0049] 鑒定:經(jīng)鑒定，該菌株形態(tài)或生理生化特征是:革蘭氏染色陽(yáng)性、細(xì)胞桿狀、直徑< lum、如圖1所示，形成芽孢，不膨大，無(wú)伴胞晶體;接觸酶、氧化酶陽(yáng)性，好氧生長(zhǎng)，VP試驗(yàn)陽(yáng) 性，VP <PH6試驗(yàn)陽(yáng)性，VP > PH7試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陰性，利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、 甘露醇產(chǎn)酸;利用葡萄糖不產(chǎn)氣;利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽，水解淀粉、液化明膠、分解酪 素。在?冊(cè)、7%恥(：1、70°(：均生長(zhǎng)。
[0050]根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和基因序列測(cè)定結(jié)果，該菌株SE201412鑒定為枯草 芽孢桿菌Baci 1 lus Subti 1 is，已于2015年11月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱(chēng) CCTCC;地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號(hào)CCTCC No.M2015708。
[0051]該菌株的顯微鏡觀察照片、平板菌落形態(tài)、進(jìn)化樹(shù)分別如圖1、圖2、圖3所示。表1列 出了該菌株16S rRNA基因測(cè)序BLAST結(jié)果，表2，表3列出了該菌株的生理生化特性 [0052] 表1菌株SE201412 16S rRNA基因測(cè)序BLAST結(jié)果

[0055] 表2菌株SE201412生理生化特性-酶活、碳源同化
[0058] +:陽(yáng)性反應(yīng);陰性反應(yīng)
[0059] 表3菌株SE201412生理生化特性一利用碳源產(chǎn)酸
[0062] +:陽(yáng)性反應(yīng);-:陰性反應(yīng);W:弱陽(yáng)性
[0063] 實(shí)施例1富有機(jī)硒菌劑的制備方法
[0064] (1)菌株活化:將復(fù)壯培養(yǎng)基加入試管中，置伽馬射線輻照機(jī)下，在2.5kGy條件下 滅菌后，擺成斜面，冷卻凝固；將4°C冷藏中的枯草芽孢桿菌SE201412試管菌種用接種環(huán)種 取1環(huán)接種在試管復(fù)壯培養(yǎng)基上，接種100支試管種，置32°c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至SE201412試管 斜面長(zhǎng)滿(mǎn)菌；
[0005]其中，所述復(fù)壯培養(yǎng)基為:6g葡萄糖、5g鹿糖、5g牛肉膏、10蛋白胨、4g氯化鈉、18g 瓊脂、1000毫升水、PH7.4。
[0066] (2)擴(kuò)大培養(yǎng):取曝氣的自來(lái)水100L裝入200L發(fā)酵罐中，再加入600g葡萄糖、500g 蔗糖、500g牛肉膏、1000g蛋白胨、400g氯化鈉，GPE-6330生物發(fā)酵專(zhuān)用消泡劑0.1kg，用氫氧 化鈉調(diào)PH7.4，用伽馬射線輻照機(jī)3kGy滅菌發(fā)酵罐通氣管道、滅菌發(fā)酵罐罐體，滅菌發(fā)酵液， 然后將100支枯草芽孢桿菌SE201412復(fù)壯試管種接入發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵攪拌速度195轉(zhuǎn)/ 分鐘，罐內(nèi)溫度32°C，罐內(nèi)壓力0.05MPa，罐內(nèi)空氣流量l:0.3(v/v)。接入種子后，每隔3小時(shí) 取樣發(fā)酵液用酸度計(jì)測(cè)定PH(維持發(fā)酵液PH7.4)和用722可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞 濃度，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液12h細(xì)菌細(xì)胞濃度與15h細(xì)菌細(xì)胞濃度在最大吸光值處沒(méi)有明顯增增加， 結(jié)束發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間15h。
[0067] (3)富硒菌劑的生產(chǎn):在2噸的發(fā)酵罐中加入1噸曝氣自來(lái)水，再加入6000g葡萄糖、 5000g蔗糖、5000g牛肉膏、10000g蛋白胨、4000g氯化鈉，純度99%亞硒酸鈉673.7g，GPE-6330生物發(fā)酵專(zhuān)用消泡劑lkg，調(diào)PH7.6。用伽馬射線輻照機(jī)4kGy滅菌發(fā)酵罐通氣管道、滅菌 發(fā)酵罐罐體，滅菌發(fā)酵液，將擴(kuò)大培養(yǎng)的100L枯草芽孢桿菌SE201412菌種子液在無(wú)菌條件 下送入發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵攪拌速度195轉(zhuǎn)/分鐘，罐內(nèi)溫度32°C，罐內(nèi)壓力0.05MPa，罐內(nèi)空 氣流量1:0.3(v/v)。接入種子后，檢測(cè)發(fā)酵液的pH值并維持發(fā)酵液的pH值為7.4,并采用分 光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)酵進(jìn)程，發(fā)酵15h結(jié)束發(fā)酵。
[0068]經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中有機(jī)硒含量為300mg/L。
[0069] 實(shí)施例2富有機(jī)硒菌劑的制備方法
[0070] (1)菌株活化:將復(fù)壯培養(yǎng)基加入試管中，置伽馬射線輻照機(jī)下，在2.5kGy條件下 滅菌后，擺成斜面，冷卻凝固；將4°C冷藏中的枯草芽孢桿菌SE201412試管菌種用接種環(huán)種 取1環(huán)接種在試管復(fù)壯培養(yǎng)基上，接種200支試管種，置32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至SE201412試管 斜面長(zhǎng)滿(mǎn)菌；
[007?]其中，所述復(fù)壯培養(yǎng)基為：12g葡萄糖、10g鹿糖、10g牛肉膏、20蛋白胨、8g氯化鈉、 36g瓊脂、2000毫升水、PH7 · 6。
[0072] (2)擴(kuò)大培養(yǎng)：取曝氣的自來(lái)水200L裝入0.5噸發(fā)酵罐中，再加入1200g葡萄糖、 l〇〇〇g蔗糖、l〇〇〇g牛肉膏、2000g蛋白胨、800g氯化鈉，GPE-6330生物發(fā)酵專(zhuān)用消泡劑0 · 2kg， 調(diào)PH7.5，用伽馬射線輻照機(jī)3kGy滅菌發(fā)酵罐通氣管道、滅菌發(fā)酵罐罐體，滅菌發(fā)酵液，然后 將接種的200支枯草芽孢桿菌SE201412復(fù)壯試管種接種接入發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵攪拌速度 195轉(zhuǎn)/分鐘，罐內(nèi)溫度35 °C，罐內(nèi)壓力0.05MPa，罐內(nèi)空氣流量1:0.3 (v/v)。接入種子后，檢 測(cè)發(fā)酵液的pH值并維持發(fā)酵液的pH值為7.6,并采用分光光度計(jì)檢測(cè)發(fā)酵進(jìn)程，發(fā)酵15h結(jié) 束發(fā)酵。
[0073] (3)富硒菌劑的生產(chǎn)：在2噸的發(fā)酵罐中加入2噸曝氣自來(lái)水，再加入12000g葡萄 糖、10000g蔗糖、10000g牛肉膏、20000g蛋白胨、8000g氯化鈉，GPE-6330生物發(fā)酵專(zhuān)用消泡 劑2kg，純度99 %亞硒酸鈉6666.7g，調(diào)PH7.6，用伽馬射線輻照機(jī)3.5kGy滅菌發(fā)酵罐通氣管 道、滅菌發(fā)酵罐罐體，滅菌發(fā)酵液，然后將擴(kuò)大培養(yǎng)的200L種子液在無(wú)菌條件下倒入2噸發(fā) 酵罐中，設(shè)定發(fā)酵攪拌速度195轉(zhuǎn)/分鐘，罐內(nèi)溫度35 °C，罐內(nèi)壓力0.05MPa，罐內(nèi)空氣流量1: 〇.3(v/v)，采用與步驟(2)相同方式檢測(cè)pH值和發(fā)酵進(jìn)程。
[0074] 該實(shí)施例使用的亞硒酸鈉總量為22444.6g，發(fā)酵罐里先加6666.7g亞硒酸鈉，剩余 的亞硒酸鈉裝脈沖輸液瓶中用l〇〇kg無(wú)菌水溶解后，用伽馬射線輻照機(jī)3.5kGy滅菌，在發(fā)酵 3h后每隔lh均勻向罐內(nèi)輸送10kg亞硒酸鈉溶液并向罐內(nèi)加氫氧化鈉溶液保持發(fā)酵液PH為 7.5。
[0075]發(fā)酵罐培養(yǎng)15h結(jié)束發(fā)酵，管道輸入儲(chǔ)罐，用自動(dòng)灌裝機(jī)灌裝，每瓶灌5L封蓋后用 伽馬射線輻照機(jī)3kGy滅菌后存放1年。
[0076] 經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中有機(jī)硒含量為5000mg/L。
[0077]實(shí)施例3富有機(jī)硒菌劑的制備方法
[0078] (1)菌株活化:將復(fù)壯培養(yǎng)基加入試管中，置伽馬射線輻照機(jī)下，在2.5kGy條件下 滅菌后，擺成斜面，冷卻凝固；將4°C冷藏中的枯草芽孢桿菌SE201412試管菌種用接種環(huán)種 取1環(huán)接種在試管復(fù)壯培養(yǎng)基上，接種50支試管種，置32°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至SE201412試管斜 面長(zhǎng)滿(mǎn)菌；
[0079] 其中，所述復(fù)壯培養(yǎng)基為:3g葡萄糖、2.5g蔗糖、2.5g牛肉膏、5蛋白胨、2g氯化鈉、 9g瓊脂、500毫升水、PH7 · 5。
[0080] ⑵擴(kuò)大培養(yǎng):取曝氣的自來(lái)水50L裝入100L發(fā)酵罐中，再加入300g葡萄糖、250g蔗 糖、250g牛肉膏、500g蛋白胨、200g氯化鈉，GPE-6330生物發(fā)酵專(zhuān)用消泡劑0.05kg3lPH7.6， 用伽馬射線輻照機(jī)4kGy滅菌發(fā)酵罐通氣管道、滅菌發(fā)酵罐罐體，滅菌發(fā)酵液，然后將接種的 50支枯草芽孢桿菌SE201412復(fù)壯試管種接種接入發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵攪拌速度195轉(zhuǎn)/分 鐘，罐內(nèi)溫度35°C，罐內(nèi)壓力0.045MPa，罐內(nèi)空氣流量1:0.35(￥八），發(fā)酵罐培養(yǎng)1511，結(jié)束發(fā) 酵。
[0081 ] (3)富硒菌劑的生產(chǎn):在1噸的發(fā)酵罐中加入0.5噸水，再加入3000g葡萄糖、2500g 蔗糖、2500g牛肉膏、5000g蛋白胨、2000g氯化鈉，純度99 %亞硒酸鈉3366 · 9g，GPE-6330生物 發(fā)酵專(zhuān)用消泡劑〇. 5kg，用氫氧化鈉調(diào)PH7.6，用伽馬射線輻照機(jī)2kGy滅菌發(fā)酵罐通氣管道、 滅菌發(fā)酵罐罐體，滅菌發(fā)酵液，然后將擴(kuò)大培養(yǎng)的50L枯草芽孢桿菌SE201412種子液在無(wú)菌 條件下接入發(fā)酵罐中，設(shè)定發(fā)酵攪拌速度195轉(zhuǎn)/分鐘，罐內(nèi)溫度34°C，罐內(nèi)壓力0.05MPa，罐 內(nèi)空氣流量1: 〇. 3(v/v)。發(fā)酵罐培養(yǎng)15h，管道輸入儲(chǔ)罐，用自動(dòng)灌裝機(jī)灌裝，每瓶灌5L封蓋 后置，用伽馬射線輻照機(jī)2kGy滅菌后存放1年。
[0082]經(jīng)檢測(cè)，發(fā)酵液中有機(jī)硒含量為3000mg/L。
[0083]效果實(shí)驗(yàn)例一 [0084]實(shí)驗(yàn)方法：
[0085] (1)分別取有機(jī)硒含量200mg/kg富有機(jī)硒菌劑1 · 2L、2 · 4L、3 · 6L、4 · 8L，兌水25L依 次稀釋為10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的富硒菌劑，制備成四種不同硒含量的菌劑 供水稻田備用，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照(純水）；
[0086] (2)分別將四種菌劑以及純水施用于處于抽穗開(kāi)花生長(zhǎng)期的水稻葉面上（施用一 次），施用量約為25L/667M 2;
[0087] (3)大米收獲后，測(cè)定大米硒含量，有機(jī)硒利用率等數(shù)值，結(jié)果列于表4:
[0088] 表4發(fā)酵有機(jī)硒生產(chǎn)富有機(jī)硒大米效果
[0090] 注：以上數(shù)據(jù)由國(guó)家富硒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(恩施州產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所)檢 測(cè)提供;試驗(yàn)地土壤中不含硒。
[0091] 效果實(shí)驗(yàn)例二 [0092]實(shí)驗(yàn)方法：
[0093] (1)分別取有機(jī)硒含量200mg/kg富有機(jī)硒菌劑1 · 2L、2 · 4L、3 · 6L、4 · 8L，兌水25L依 次稀釋為10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的富硒菌劑，制備成四種不同硒含量的菌劑 供蘋(píng)果園備用；同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照(純水）；
[0094] (2)分別將四種菌劑及純水施用于處于蘋(píng)果開(kāi)花初期樹(shù)葉面上(施用一次），施用 量約為 25L/667M2;
[0095] (3)蘋(píng)果收獲后，測(cè)定蘋(píng)果硒含量，有機(jī)硒利用率等數(shù)值，結(jié)果列于表5:
[0096] 表5發(fā)酵有機(jī)硒生產(chǎn)富有機(jī)硒蘋(píng)果效果
[0097]
[0098] 注：以上數(shù)據(jù)由湖北民族學(xué)院生物示范中心開(kāi)放平臺(tái)檢測(cè)提供;試驗(yàn)地土壤中不 含硒。
[0099] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)SE201412,其保藏編號(hào)為CCTCC No.M 2015708。2. 權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌SE201412在生產(chǎn)富有機(jī)硒菌劑中的應(yīng)用。3. -種富有機(jī)硒菌劑的制備方法，其特征在于:將枯草芽孢桿菌SE201412接種于含硒 培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液即得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述含硒培養(yǎng)基為:葡萄糖4-8g/L，蔗 糖 3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化鈉 2-6g/L，亞硒酸鈉0 · 3-30g/L，pH6 · 8-7 · 6; 優(yōu)選地，葡萄糖6g/L，鹿糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉4g/L，亞硒酸鈉0.5_ 22g/L，pH7.2-7.6。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于:所述含硒培養(yǎng)基內(nèi)還含有消泡劑， 所述消泡劑優(yōu)選為GPE-6330，所述消泡劑的用量?jī)?yōu)選為0.5-1.5g/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫 度30-37°C，壓力0.04-0.06MPa，攪拌轉(zhuǎn)速160-220r/min，發(fā)酵液體積與通入空氣體積比1: (0 · 2-0 · 4)，發(fā)酵時(shí)間 12-24h; 優(yōu)選地，溫度32-35 °C，壓力0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速190-200r/min，發(fā)酵液體積與通入空氣 體積比1:0.3，發(fā)酵時(shí)間14-18h。7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：當(dāng)所述含硒培養(yǎng)基中亞硒酸 鈉含量超過(guò)lg/L時(shí)，先加入25-35%重量的亞硒酸鈉配制培養(yǎng)基，然后以水溶解剩余亞硒酸 鈉，并在發(fā)酵過(guò)程中將其分批加入發(fā)酵體系中； 優(yōu)選地，用剩余亞硒酸鈉重量5-7倍的水溶解亞硒酸鈉，并在發(fā)酵2-4h后每隔1-1.5h將 其分批加入發(fā)酵體系中。8. 權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述制備方法得到的富有機(jī)硒菌劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的富有機(jī)硒菌劑，其特征在于:所述富有機(jī)硒菌劑的有機(jī)硒含量 為300mg/kg-30000mg/kg;優(yōu)選地，所述富有機(jī)硒菌劑中枯草芽孢桿菌SE201412的活菌數(shù)為 10-30億/mL。10. 權(quán)利要求3-7任一項(xiàng)所述制備方法得到的富有機(jī)硒菌劑或權(quán)利要求8或9所述富有 機(jī)硒菌劑在作物種植中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01N59/02GK105950503SQ201610338121
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】劉金龍, 鄭威, 劉欋霄, 鄭倬, 溫亮, 戴光忠, 楊軍, 孫志國(guó)
【申請(qǐng)人】湖北民族學(xué)院, 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)研究所, 湖北省富硒產(chǎn)業(yè)研究院