專利名稱：新的得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種的抗增殖蛋白的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及免疫學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及從蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種中分離、純化和鑒定一種新的抗增殖蛋白。
相關(guān)技術(shù)選擇性地對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抗增殖特性的藥劑具有成為抗癌藥物的潛力。人們一直在從合成和天然兩種來源尋找著這類藥劑。這類具有抗增殖特性的化合物就其性質(zhì)而言可能是蛋白質(zhì)，也可能是非蛋白質(zhì)類的。
已知，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都能合成對真核細(xì)胞具有毒性的蛋白質(zhì)。蘇云金芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，在其芽孢形成過程中可合成大量蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在被昆蟲攝入后可將其殺死(Hofte和Whiteley，1989)。30多年來，這種蛋白質(zhì)一直被用作微生物殺蟲劑，而且被認(rèn)為對人無害(Green等，1990)。這類殺蟲蛋白在細(xì)菌內(nèi)組裝成伴孢晶體，有三種不同的大小133-145kDa；65-67kDa和27kDa。不同的蘇云金芽孢桿菌亞種可能表達三類大小中的一種或多種。133-145kDa的蛋白質(zhì)是一種熱毒素，在被中腸胃道蛋白酶降解時生成保留毒性部分的約67kDa的氨基末端片段(Ogiwara等，1992)。67kDa的毒素與其它蘇云金芽孢桿菌亞種的毒素具有一重要的結(jié)構(gòu)同源性。但是，27kDa的毒素與任何其它大小的毒素沒有同源性，但在亞種內(nèi)具有高度同源性(Luthy等，1982)。已對以色列亞種(Bacillus thuringiensis israeliensis)、kyushunsis亞種(Bacillusthuringiensis kyushunsis)和morrisoni亞種(Bacillus thuringiensis morrisoni)的27kDa毒素的基因進行了克隆，而且發(fā)現(xiàn)，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的毒素與蘇云金芽孢桿菌morrisoni亞種的毒素僅相差一個堿基；但與蘇云金芽孢桿菌kyushunsis亞種毒素的一致性只有39％(Waalwijk等，1985；Ward和Ellar，1986；Galjart等，1987；Koni和Ellar，1993)。許多亞種的毒素已被證明對培養(yǎng)中的昆蟲細(xì)胞具有溶胞性。
約20年前，有報道稱得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的毒素在體內(nèi)具有對某些鼠腫瘤，例如Yoshida腹水瘤的抗腫瘤活性。然后，得自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的某種毒素也被證明在體外具有抗某類鼠腫瘤細(xì)胞的的抗腫瘤活性。根據(jù)后繼腫瘤移植注射判斷，蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種蛋白加強了大鼠和豚鼠的體液免疫系統(tǒng)，由此誘導(dǎo)持久的抗腫瘤免疫。但是這種抗腫瘤蛋白的結(jié)構(gòu)特征，以及其功能是否與上述許多其它亞種的殺蟲性毒素相關(guān)，是未知的。
現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種有效抑制多種腫瘤生長的手段。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中長期以來的這一需求。
發(fā)明概述本發(fā)明描述了從革蘭氏陽性菌蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種中分離和鑒定一種被稱為癌毒素的蛋白質(zhì)。對癌毒素的鑒定在一定程度上是以其對人組織細(xì)胞淋巴瘤U-937細(xì)胞的抗增殖活性為基礎(chǔ)的。使用這種分析法，可以通過溴化鈉差速梯度超速離心、蛋白酶消化，再經(jīng)DEAE親和膠藍(lán)色親和性色譜來分離癌毒素。癌毒素活性使之與DEAE親和膠藍(lán)樹脂結(jié)合，并可用0.05M NaCl洗脫。在變性條件下，其分子量約為20kDa。
純化蛋白的生物活性對包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和鏈霉蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白酶敏感，對酸性條件(pH4以下)敏感，對三氟乙酸(0.1％)和乙腈(50％)敏感。但是，癌毒素活性能夠耐受高溫(100℃，30分鐘)和還原性條件(1毫摩爾濃度(mM)二硫蘇糖醇)。該蛋白質(zhì)的氨基端氨基酸序列包括NH2-Pro-Ser-Thr-Val-Val-Asn-Val-Ser-Asn-Leu-Lys-Pro-Gly-Asp-Thr-Ile-Glu-Lys-Glu-Phe-。與已公開的其它蛋白質(zhì)序列相比，該序列具有獨特性。以該序列為基礎(chǔ)的合成肽被用于在兔體內(nèi)制備多克隆抗體，這些抗體在抗血清的濃度即使為1∶10,000時，仍完全中和了癌毒素的生物活性。利用這些抗體的Western印跡分析也顯示一條20kDa癌毒素的條帶。
除了胸苷摻入法之外，臺盼藍(lán)排阻和MTT法也證明了高度純化的癌毒素對U-937細(xì)胞長期生長的完全抑制作用。該癌毒素對許多不同的腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出抗增殖作用，其中包括髓細(xì)胞系(U-937，THP-1，H1-60)，淋巴細(xì)胞系(Raji，Jurkat)，成紅細(xì)胞系(K-562)，乳腺癌細(xì)胞系(CLO，MCF-7)，卵巢癌細(xì)胞系(OVCA429，OVCA432，OVCA433)，腎細(xì)胞系(A-293)和肝癌細(xì)胞系(Hep3B，HepG2)。但是，在相似條件下，人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(U-251)和鼠纖維瘤(L-929)對癌毒素具有耐受性。正常的人二倍體包皮成纖維細(xì)胞和正常的人外周血淋巴細(xì)胞也對高達100微克/毫升(μg/ml)的癌毒素具有耐受性。用癌毒素處理U-937細(xì)胞24小時后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，造成了DNA的斷裂，這表明癌毒素令細(xì)胞致死的機制很可能是通過細(xì)胞凋亡?？傊?，本發(fā)明證明分離到一種新的細(xì)菌蛋白，它對許多腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用。
在本發(fā)明實施方式之一中，提供了一種組合物，其中包含分離和純化自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的分子量經(jīng)SDS-PAGE測定約為20kDa，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
在本發(fā)明實施方式之二中，提供了一種藥物組合物，其中包含本發(fā)明的新蛋白質(zhì)和藥學(xué)上認(rèn)可的載體。
在本發(fā)明實施方式之三中，提供了一種制備本發(fā)明蛋白質(zhì)的方法。
在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了一種處理腫瘤細(xì)胞的方法，其中包括對所述細(xì)胞使用治療有效量的本發(fā)明組合物。
通過以下對優(yōu)選實施方式的描述，本發(fā)明的其它方面內(nèi)容、特點和優(yōu)點將是顯而易見的，這些描述僅以說明為目的。


為了便于達到和具體理解本發(fā)明的上述特點、優(yōu)點、目的及其它，將參照某些實施例來更具體地說明以上概述的本發(fā)明，附圖對這些實施方式進行了說明。這些附圖是本發(fā)明的一部分。但是，需要指出的是，附圖表示本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，因而不應(yīng)被理解成對其范圍的限定。
圖1顯示對癌毒素的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分析。如后文所述，1微克癌毒素在15％的丙烯酰胺凝膠上分離。
圖2對癌毒素氨基末端氨基酸序列的分析。
圖3A顯示利用Western印跡分析來檢測癌毒素。圖3B顯示抗合成癌毒素肽抗體對癌毒素生物活性的中和作用。
圖4顯示癌毒素與以其氨基酸序列為基礎(chǔ)的合成肽的作用的比較。
圖5顯示多種蛋白酶對癌毒素生物活性的作用。
圖6顯示pH(圖6A)和有機溶劑(圖6B)對癌毒素生物活性的作用。
圖7顯示對癌毒素的生物測定。在96孔微滴板中將5×103細(xì)胞(0.2ml)與癌毒素一起在37℃孵育72小時，然后以后文所述的含氚胸苷摻入法測定細(xì)胞活性。所有測定均一式三份。
圖8顯示癌毒素對不同髓細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖9A顯示癌毒素對不同淋巴細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖9B顯示癌毒素對成紅細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖10顯示癌毒素對不同乳腺癌細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖11顯示癌毒素對不同卵巢癌細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖12顯示癌毒素對不同肝癌細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖13顯示癌毒素對人胚腎細(xì)胞系的劑量依賴性作用。
圖14顯示癌毒素對人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的劑量依賴性作用。
圖15顯示癌毒素對鼠纖維肉瘤的劑量依賴性作用。
圖16顯示經(jīng)臺盼藍(lán)排阻法(圖16A)和MTT法(圖16B)測定，癌毒素對人組織細(xì)胞淋巴瘤U-937細(xì)胞生長的劑量依賴性作用。
圖17顯示癌毒素對正常二倍體人成纖維細(xì)胞(圖17A)和對正常人外周血淋巴細(xì)胞(圖17B)的劑量依賴性作用。
圖18顯示癌毒素對U-937細(xì)胞DAN斷裂的劑量依賴性作用。
圖19顯示與得自蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種(Bacillus thuringiensis Kurstaki)的Cry IIA毒素的癌毒素活性比較。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及包含分離和純化自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白質(zhì)的組合物，該蛋白質(zhì)的分子量經(jīng)SDS-PAGE測定約為20千道爾頓(kDa)，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如后文所述，該新的蛋白對蛋白酶和酸性條件敏感，而且其細(xì)胞毒性能夠耐受二硫蘇糖醇和100℃的處理。
雖然本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)對許多腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，但是主要對U-937細(xì)胞、髓細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成紅細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性。該蛋白對正常人細(xì)胞無細(xì)胞毒性，例如外周血淋巴細(xì)胞和人包皮成纖維細(xì)胞。該細(xì)胞毒性受抗該蛋白抗體的抑制。
我們特別考慮到，可以用本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)制備藥物組合物。此時，藥物組合物中包含本發(fā)明的新的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上認(rèn)可的載體。無需過多的實驗，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員就可確定本發(fā)明新蛋白質(zhì)的合適劑量和給藥途徑。
當(dāng)在體內(nèi)用于治療時，給病人或動物使用的本發(fā)明蛋白質(zhì)需是治療有效量的，即消除或縮小腫瘤的量。通常采用非腸胃給藥，以靜脈給藥為佳，但其它給藥途徑也適用。劑量和劑量方案將取決于癌癥的性質(zhì)(初期，還是已轉(zhuǎn)移)及其數(shù)量，具體的免疫毒素的特征例如其治療指數(shù)、病人、病人的病史，以及其它因素。蛋白質(zhì)的給藥量通常在約0.1至約10毫克/千克病人體重。療程將持續(xù)至獲得最佳療效，但需權(quán)衡治療的副作用。參見《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’sPharmaceutical Science)，第17版(1990)，Mark Publishing Co.，Easton，Penn；和Goodman和Gilman's《治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》(The Pharmacological Basis ofTherapeutics)，第8版(1990)Pergamon Press；以上文獻均在此引用參考。
為了用于非腸胃給藥，通常將該蛋白與藥學(xué)上認(rèn)可的非腸胃用媒質(zhì)一起配制成可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)單位劑量。這類媒質(zhì)最好是無毒性和非治療性的。這類媒質(zhì)的實例為水、生理鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用非水性媒質(zhì)，例如混合油和油酸乙酯。也可使用脂質(zhì)體作為載體。媒質(zhì)中可含有微量的添加劑，例如加強等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，例如緩沖液和防腐劑。配制在這種媒質(zhì)中的免疫毒素的濃度通常約為0.1mg/ml至10mg/ml。
近年來，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的分子生物學(xué)水平顯著提高。根據(jù)本說明書，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員就能夠進行該新的細(xì)胞毒性蛋白基因的克隆。
本發(fā)明還涉及一種處理腫瘤細(xì)胞的方法，它包括對所述細(xì)胞使用治療有效量的本發(fā)明組合物。較好的是，腫瘤細(xì)胞選自髓細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成紅細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。通常，腫瘤細(xì)胞是人或動物體內(nèi)的。特別考慮到的是，新的組合物將抑制腫瘤病情的復(fù)發(fā)，延長所述腫瘤細(xì)胞的宿主的存活時間。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以用在體外方法中。例如，該方法可被用于殺死取白骨髓的腫瘤細(xì)胞。在該方法中，先從患有腫瘤疾病的個體中取出骨髓。然后，用殺死細(xì)胞有效量的本發(fā)明蛋白處理骨髓，以消滅殘留的腫瘤細(xì)胞?？梢詫⑻幚砗蟮墓撬杓?xì)胞回輸給病人，以在為了消除所有內(nèi)源性腫瘤血液毒性細(xì)胞而接受強烈化療和/或放療之后促進免疫系統(tǒng)的重建。
以下實施例是為了說明本發(fā)明的各種實施方式，而不是對本發(fā)明任何形式的限定。
實施例1材料RPMI-1640由Whittaker MA Bioproducts(Walkersville，MD)提供。胎牛血清(FBS)和慶大霉素由GIBCO(Grand Island，NY)提供。其它化學(xué)試劑和生物化學(xué)試劑由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)提供。U-937(組織細(xì)胞淋巴瘤，CRL1593)，前髓細(xì)胞性白血病HL-60(CCL 240)；急性骨髓性白血病KG-1a(CCL246.1)；乳腺癌MCF-7(HTB 22)；上皮癌HepG-2(CCL 23)；乳腺癌BT-20(HTB19)；Burkitt淋巴癌Raji(CCL 86)；和Jurkat(急性T細(xì)胞白血病，TIB 152)細(xì)胞系由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)提供。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在補充了谷胺酰胺(2mM)，慶大霉素(50mM)和胎牛血清(10％)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。利用重組DNA方法獲得的蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素由Ecogen Inc.(Langhorne，PA)的William P.Donovan博士提供。
實施例2癌毒素的生物測定通過癌毒素在人組織細(xì)胞淋巴瘤U-937細(xì)胞內(nèi)，在72小時內(nèi)抑制胸苷摻入的能力檢測其生物活性。根據(jù)已有文獻的記載進行該項測定(Higuchi和Aggarwal，1992)。簡而言之，將細(xì)胞(5×103/0.1ml)平板培養(yǎng)在96孔Falcon板上。將癌毒素的連續(xù)稀釋液加入靶細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)72小時。在72小時培養(yǎng)的最后6小時中，在各孔中加入(0.5m Ci/孔)含氚胸苷(6.7居里/毫摩爾(Ci/mmole)；New EnglandNuclear，Boston，MA)。然后，用Packard Filtermate 196細(xì)胞收獲儀將細(xì)胞懸浮液收獲在玻璃纖維濾膜上，并在Packard Matrix 9600直接β計數(shù)儀(Packard Co.，Meriden，CT)中測定與濾膜結(jié)合的放射性。將處理后細(xì)胞內(nèi)的摻入量除以非處理細(xì)胞中的量，計算出相對細(xì)胞活性，并將其表示為百分比。
利用修改過的四唑氮鹽法(MTT)(Hansen等，1989)測定U-937細(xì)胞的生長。簡而言之，在0.1ml的最終體積中，在有或無不同濃度癌毒素存在下，將細(xì)胞(5000細(xì)胞/孔)在37℃培養(yǎng)不同的天數(shù)。然后在各孔中加入0.025ml MTT溶液(5mg/ml的PBS溶液)。在37℃培養(yǎng)2小時后，加入0.1ml提取緩沖液(20％十二烷基硫酸鈉，50％二甲基甲酰胺)。在37℃培養(yǎng)過夜后，用96孔復(fù)式掃描自動讀數(shù)儀(Dynatech MR 5000)測定570納米(nm)處的光密度，以提取緩沖液為空白。
實施例3微生物和生長條件蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種由Immunology and Virology Laboratory，F(xiàn)acultyof Biological Science，Autonoma University of Nuevo Leon提供。于4℃將細(xì)菌維持在營養(yǎng)瓊脂斜面上，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)每3個月傳代一次(Cheung和Hammock，1985)。
實施例4晶體和孢子的產(chǎn)生根據(jù)已有文獻的描述進行晶體和孢子的產(chǎn)生(Yamanoto和McLaughlin，1981；Yamamoto和Ilzuka，1983)。簡而言之，細(xì)菌在營養(yǎng)發(fā)酵液中于30℃振蕩培養(yǎng)18小時。從該培養(yǎng)物中取樣接種到瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)燒瓶中，在30℃培養(yǎng)72小時，然后通過在4℃、10,000rpm離心30分鐘(Beckman)，將晶體收獲在1M NaCl中。沉淀用1M NaCl洗滌3次，保存于-20℃。
實施例5蛋白質(zhì)晶體的分離利用以下溴化鈉梯度(30，31.5，33，34.5和36％)在4℃以25,000rpm的速度差速超速離心90分鐘，由此將晶體與孢子分離。將含有晶體的條帶匯集，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥后保存于-20℃(Ang和Nickerson，1978)。
實施例6晶體的增溶此步驟按Prasad和Shethna(1974)所述進行。簡而言之，在室溫下將100毫克晶體蛋白在20毫升含1M NaOH的0.1M甘氨酸中懸浮5小時，然后離心(4℃，20,000rpm，30分鐘)。用pH7.2的磷酸鹽緩沖液透析被稱為堿溶解的晶體的上清液。將樣品冷凍干燥后于-20℃保存。
實施例7利用胰蛋白酶活化堿溶解的晶體該步驟采用Choma等(1990)所述的方法。簡而言之，用胰蛋白酶(10％；w/w)在37℃，在0.1M pH7.2的甘氨酸緩沖液中處理堿溶解的晶體(5mg/ml)30分鐘。樣品在4℃以20,000rpm的速度離心(Beckman離心機)30分鐘，然后用pH7.2的磷酸鹽緩沖液透析上清液。
實施例8DEAE-親和膠藍(lán)色親和性色譜將由以上步驟獲得的一份癌毒素(約2mg/ml)上樣在DEAE-親和膠藍(lán)色色譜柱(1×6.5厘米(cm))上，色譜柱在pH8的20mM Tris中預(yù)平衡。用平衡緩沖液洗滌色譜柱，然后用遞進梯度0.05-1.0M的NaCl洗脫。利用生物測定法來鑒定癌毒素組份，利用Biorad法測定蛋白質(zhì)濃度。
實施例9DNA斷裂的分析用癌毒素(50微克/毫升(μg/ml))處理細(xì)胞(5×106/ml)24或72小時，然后離心沉淀，用PBS洗滌，重懸在10mM tris-Cl，pH7.4和1mM EDTA，pH8中。然后用裂解緩沖液(10mM tris-Cl，pH8，100mM NaCl，25mM EDTA和0.5％SDS)裂解細(xì)胞，加入RNase(1微升10mg/ml的溶液)去除RNA。在50℃培養(yǎng)30分鐘后，在各試管中加入1微升蛋白酶K(20mg/ml)，在50℃繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。加入0.4微升加樣染料(0.025％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯腈藍(lán)FF和30％甘油水溶液)之后，將樣品在有TAE緩沖液(0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA)的1.2％瓊脂糖中分離。
實施例10氨基酸序列分析在Baylor College of Medicine(Houston，TX)，由蛋白質(zhì)測序?qū)嶒炇疫M行癌毒素的氨基酸序列分析。蛋白質(zhì)被從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在473A型微測序儀(Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA)上進行序列分析。在National Center for Biotechnology Information(NCBI)，利用BLAST網(wǎng)絡(luò)服務(wù)進行序列同源性的研究。
實施例11肽的合成根據(jù)對癌毒素的氨基酸序列分析，由Baylor College ofMedicine(Houston，TX)的蛋白質(zhì)化學(xué)核心實驗室合成了一段18個氨基酸長的肽。用Fmoc多抗原肽(MAP)樹脂來合成癌毒素肽。利用反相HPLC純化合成的肽，并測定其氨基酸組成。
實施例12抗體的產(chǎn)生利用以上合成的肽來制造抗體(Bethyl Laboratories，Montgomery，TX)，即用100微克抗原的完全Freund佐劑溶液(多位點)皮下免疫兔。然后在第14天和第21天，兩次肌內(nèi)注射各50微克抗原的不完全Freund佐劑溶液。然后，在癌毒素生物測定中在血清中進行中和滴度的檢測，并利用Western印跡分析檢測其免疫反應(yīng)性。
實施例13Western印跡分析在SDS-聚丙烯酰胺凝膠(15％)上進行蛋白質(zhì)樣品的電泳。在電泳后，將樣品轉(zhuǎn)移到浸在含有Tris-HCl(25mM，pH8.3)，甘氨酸(192mM)和甲醇(20％，v/v)的緩沖液中的硝酸纖維素濾紙上。用封閉緩沖液，即含有BSA(5％)和吐溫20(Tween20)(0.1％，v/v)的PBS(PBS吐溫緩沖液)在室溫下封閉1小時，將硝酸纖維素濾紙上的非特異性結(jié)合減至最小。在用PBS吐溫緩沖液洗滌3次后，濾紙在室溫下與抗癌毒素抗體(1∶10,000稀釋液)一起孵育1小時。濾紙經(jīng)再次洗滌后，與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物(1∶10,000稀釋液)一起在室溫下孵育1小時。然后，將濾紙洗滌4次，利用加強化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham)目測條帶。
實施例14癌毒素的分離及其理化性質(zhì)鑒定利用U-937細(xì)胞毒性生物測定和包括梯度超速離心、蛋白酶反應(yīng)和DEAE親和膠藍(lán)色親和性色譜的純化步驟，分離到一種在0.05M NaCl時從DEAE上洗脫的蛋白質(zhì)。該蛋白在本文中被稱為癌毒素。在變性條件下的SDS-PAGE分析顯示，利用考馬斯藍(lán)和銀染色，都在約20kDa處具有一主條帶(圖1)。將癌毒素電印跡到PVDF膜上，然后進行氨基酸序列分析。圖2表示了由此獲得的氨基末端的序列。無論用肽還是用核苷酸序列數(shù)據(jù)庫進行檢查，癌毒素的序列都是新的。
根據(jù)該序列來合成肽，并將其用于免疫兔。由此獲得的抗癌毒素肽的抗體在Western印跡分析中與癌毒素蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)(圖3A)。該抗體即使在1比10,000的抗血清稀釋液時，仍能夠中和癌毒素的生物活性。雖然比全長蛋白質(zhì)短得多，合成癌毒素仍具有一定程度的抗U-937細(xì)胞活性(圖4)。
用多種蛋白酶胰蛋白酶、、胰凝乳蛋白酶和鏈霉蛋白酶(10％，w/w)處理癌毒素24小時，蛋白質(zhì)的活性被消除(圖5)。該結(jié)果表明生物活性存在于全長蛋白質(zhì)中。除了蛋白酶之外，癌毒素的活性還被發(fā)現(xiàn)對酸性條件敏感。當(dāng)癌毒素處于pH2條件下時，雖然不是全部但大部分活性被破壞(圖6A)。癌毒素的活性還被發(fā)現(xiàn)對三氟乙酸(0.1％)或乙腈(50％)處理敏感(圖6B)。但是，該活性能夠耐受二硫蘇糖醇(1mM，2小時)處理或在100℃處理30分鐘(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例15癌毒素的生物學(xué)鑒定根據(jù)胸苷摻入的測定，用癌毒素對U-937細(xì)胞處理72小時可抑制這些細(xì)胞的生長(圖7)。在癌毒素濃度為50微克/毫升時可觀察到50％的抑制作用。還在幾種其它細(xì)胞系中檢測了癌毒素的這一作用。癌毒素對以下細(xì)胞具有抑制性髓細(xì)胞(圖8)，淋巴細(xì)胞(包括B細(xì)胞和T細(xì)胞)(圖9A)，成紅細(xì)胞(圖9B)，乳腺癌細(xì)胞(圖10)，卵巢癌細(xì)胞(圖11)和肝癌細(xì)胞(圖12)。胚腎細(xì)胞對癌毒素相對具有抗性(圖13)。人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞和鼠纖維瘤被發(fā)現(xiàn)對癌毒素具有完全耐受性(圖14和圖15)。在分析誘導(dǎo)50％生長抑制所需的癌毒素量時，該量根據(jù)腫瘤細(xì)胞的類型而有顯著差異(表I)。
表I癌毒素對人腫瘤細(xì)胞系生長的抑制作用細(xì)胞系[濃縮] 50％生長抑制性(微克/毫升)人巨噬細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系組織細(xì)胞性淋巴瘤(U-937) 15急性單核細(xì)胞白血病(THP-1)32前髓細(xì)胞性白血病(HI-60) 52人肝細(xì)胞癌肝細(xì)胞癌(Hep 3B) 15肝細(xì)胞癌(Hep G2) 78人T和B淋巴細(xì)胞急性T細(xì)胞白血病(Jurkart) 25Burkitt B細(xì)胞淋巴瘤(Raji)63人乳腺癌乳腺癌(MCF-7)35乳腺癌(CLO) 90人紅白血病慢性骨髓性白血病(K-562) 80人卵巢癌卵巢癌(OVCA-429) 40卵巢癌(OVCA-432) 50卵巢癌(OVCA-433) 100人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(U-251)＞100其它人轉(zhuǎn)化胚腎(A-293) ＞100鼠纖維瘤(L-929)＞100正常細(xì)胞人包皮二倍體成纖維細(xì)胞 ＞100人外周血淋巴細(xì)胞 ＞100
細(xì)胞(5×103)在96孔平板中于37℃培養(yǎng)72小時。在最后6小時中，用含氚胸苷對細(xì)胞進行脈沖。所有測定均重復(fù)進行三份。
除了胸苷摻入之外，還用臺盼藍(lán)排阻法和用MTT染色細(xì)胞對細(xì)胞的生長進行了檢測。圖16顯示了在有或無癌毒素條件下，利用這兩種方法獲得的U-937細(xì)胞生長曲線。這些結(jié)果也證明了癌毒素對細(xì)胞生長的完全抑制。
除了腫瘤細(xì)胞之外，還測試了幾種正常細(xì)胞對癌毒素的敏感性(圖17)。正常、新鮮的外周血淋巴細(xì)胞和人包皮成纖維細(xì)胞都被發(fā)現(xiàn)對即使是100微克/毫升的癌毒素具有耐受性。該結(jié)果表明癌毒素只對腫瘤細(xì)胞具有抑制性。
從形態(tài)學(xué)上說，有兩種類型的細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡的特征為DNA的斷裂、膜的分解和染色體的縮聚，而壞死性細(xì)胞死亡則涉及線粒體的膨脹。對U-937細(xì)胞的癌毒素處理造成DAN斷裂(圖18)，由此表明細(xì)胞死亡是通過細(xì)胞凋亡。
還將癌毒素的活性與分離自蘇云金芽孢桿菌其它亞種的毒素進行了比較。人們已經(jīng)對得自蘇云金芽孢桿菌庫氏變種的毒素的cDNA進行了克隆。由其推斷的氨基酸序列與癌毒素的不同。利用重組DNA技術(shù)制得的蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素具有約66kDa的分子量(稱為Cry IIA)(Donovan等，1988)。在生物測定中，Cry IIA毒素沒有作用(圖19)。
本發(fā)明證明蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種表達一種分子量約20kDa的新的蛋白質(zhì)。被稱為癌毒素的該蛋白質(zhì)具有獨特的氨基酸序列，并且能夠殺死多種腫瘤細(xì)胞，但不殺死正常細(xì)胞，這很可能是通過細(xì)胞凋亡機制。
得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的癌毒素的氨基酸序列非常獨特。已經(jīng)對得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的晶體蛋白Cry A4分子量為130kDa)的基因進行了克隆(Brizzard和Whiteley，1988)。癌毒素的序列與該蛋白質(zhì)明顯不同。而且，據(jù)報道，有一種得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的分子量為13kDa的酸性毒素同時具有抗腫瘤和殺蟲活性。該抗腫瘤蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種蛋白質(zhì)并不是癌毒素，因為其分子量不同(13kDa，癌毒素為20kDa)，而且其中有大量酸性殘基(42％的Asp和Glu)。它們的分離方法也與本文的不同，主要在于它們的活性組份是在0.27M的NaCl時從DEAE纖維素上洗脫的(癌毒素是在0.05M NaCl時洗脫的)，而且其中沒有胰蛋白酶消化步驟。該酸性毒素還缺少含硫氨基酸殘基，但具有晶體形態(tài)。沒有報道該13kDa的蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
據(jù)報道得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的另一種蛋白質(zhì)是一種原毒素，它能夠被胰蛋白酶活化而釋放出一種分子量為70,000的毒素，該毒素進一步降解成為分子量為55,000的次級毒素(Huber-Lukac等，1983)。該毒素可被熱和堿滅活，這表明了其特殊構(gòu)象和巰基基團的作用。相反，癌毒素的大小為20kDa，而且對熱(100℃，30分鐘)和還原性條件穩(wěn)定。得自蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素需要強堿條件來完全表現(xiàn)出其生物活性(Gringorten等，1992)，這一特征也與癌毒素不同。而且，蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的蛋白沒有被證明具有抗腫瘤活性。這與在此所述用重組蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的毒素所觀察到的一致。另外一種得自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的、20kDa的蛋白質(zhì)促進CytA蛋白質(zhì)(27.3kDa)晶體的形成，由此抑制了CytA的毒性(Wu和Federici，1993)。
得自蘇云金芽孢桿菌不同亞種的大多數(shù)晶體蛋白質(zhì)具有兩個結(jié)構(gòu)域，具有毒素活性的氨基末端段α螺旋結(jié)構(gòu)，和β鏈與卷曲交錯的羧基末端段，這對晶體結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定性具有重要意義(Convents等，1990)。d-內(nèi)毒素(cry IIIA，60-70kDa)的晶體結(jié)構(gòu)顯示其具有3個結(jié)構(gòu)域，一個7螺旋束，一個3片層結(jié)構(gòu)域和一β夾心層(Li等，1991)。有人提出，螺旋是為了在膜中形成孢子，而片層結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)受體的結(jié)合。
人們對于得自蘇云金芽孢桿菌的蛋白質(zhì)抗腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒性知道的很少。已經(jīng)證明，25kDa的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的毒素本身具有對鼠腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，而且在體外和體內(nèi)加強某些抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒性(Thomas&Ellar，1983；Yokoyama等，1988；Yokoyama等，1991)。在許多化療藥物中，它與博來霉素的協(xié)同作用最大。得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白顯示在體內(nèi)對鼠腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性。(Prasad和Shethna，1973，1974)。
有關(guān)蘇云金芽孢桿菌衍生的蛋白質(zhì)殺死腫瘤細(xì)胞的機制還不知道，但是已經(jīng)證明，蘇云金芽孢桿菌以色列亞種衍生的毒素結(jié)合特定的細(xì)胞膜脂質(zhì)體，造成脂質(zhì)的去垢劑樣重排，破壞了膜的完整性，最后造成細(xì)胞裂解(Thomas和Ellar，1983)。在昆蟲細(xì)胞中，毒素抑制(Na，K)-ATPase(English等，1986)。對于癌毒素是否通過相似的機制殺死如此之多的細(xì)胞還不清楚。癌毒素在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)DNA的斷裂，后者是細(xì)胞凋亡機制的標(biāo)志之一。而且，癌毒素被發(fā)現(xiàn)對正常細(xì)胞無毒。但是，并非所有的腫瘤細(xì)胞都對癌毒素敏感。
本文參考了以下文獻Ang，B.J.等，1978?！独脜^(qū)帶梯度離心純化得自蘇云金芽孢桿菌的蛋白質(zhì)晶體》(Purification of the protein crystal form Bacillus thuringiensis by zonalgradient centrifugation)，《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》(Appl.Environ.Microbiol.)36625-626
Adang，M.J.等，1985?！短K云金芽孢桿菌庫氏亞種HD-73的晶體蛋白的經(jīng)鑒定全長和截短質(zhì)粒克隆，及其對煙草天蛾(Manduca sexta)的細(xì)胞毒性》(Characterized full-length and truncated plasmid clones of the crystal protein ofBacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-73 and their toxicity to Manduca sexta)，《基因》(Gene)36289-300Brizzard，B.L.等，1988。《克隆自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的又一種晶體蛋白基因的核苷酸序列》(Nucleotide sequece of an additional crystal protein genecloned from Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis)《核酸研究》(Nucleic AcidRes.)16(6)2723-2724Bosch，D.等，1994?！毒哂行碌奶匦缘闹亟M蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白耐受性操作的可能性》(Recombinant Bacillus thuringiensis crystal protein with newpropertiesPossibilities for resistance Management.)，《生物/技術(shù)》(Bio/Technology)12915-918Cheung，P.等，1985?！稄奶K云金芽孢桿菌以色列變種的伴孢晶體中分離三種不同的生物活性》(Seperation of three biologically distinct activity from parasporalcrystal of Bacillus thuringiensis var.israelensis)，《現(xiàn)代微生物學(xué)》(CurrentMicrobiology)12121-126Choma，C.T.等，1990。《得自蘇云金芽孢桿菌的原毒素和毒素的異常蛋白酶解。結(jié)構(gòu)的含意?！?Unusual proteolysis of the protoxin and toxin from Bacillusthuringiensis.Structural implication)，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.189523-527Convents，D.等，1990?！短K云金芽孢桿菌d-內(nèi)毒素》(The Bacillusthuringiensis d-endotoxins)，《生物化學(xué)雜志》(J.Bio.Chem.)2651369-1375Convents，D.等和Lauwereys，M.，1991。《作為蘇云金芽孢桿菌d-內(nèi)毒素毒性片段的一般性折疊的兩個結(jié)構(gòu)域》(Two structural domain as a general fold of thetoxic fragment of the Bacillus thuringiensis d-endotoxins)，《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)195631-635Donovan W.P.等，(1988)，《P2晶體蛋白的氨基酸序列和殺蟲活性得自蘇云金芽孢桿菌庫氏變種的昆蟲毒素》(Amino acid sequence and entomocidal activityof the P2 crystal proteinan insect toxin from Bacillus thuringiensis var.kurstaki)《生物化學(xué)雜志》(J.Bio.Chem.)263561-567English，L等，1986。《δ內(nèi)毒素是一種(Na，K)ATPase的強抑制劑》(Deltaendotoxin is a potent inhibitor of the(Na，K)-ATPase)，《生物化學(xué)雜志》(J.Bio.Chem.)2611170-1173Green，M.等，1990?！段⑸餁⑾x劑蘇云金芽孢桿菌的公共健康意義傳染學(xué)研究，Oregon，1985-86》(Public health implications of the microbial pesticideBacillus thuringiensisAn epidemiological study，Oregon，1985-86)《美國公共健康雜志》(American J.Public Health)80848-862Gringorten等，1992?！独玫蛪A性pH來抑制蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素活性》(Suppression of Bacillus thuringiensis δ-endotoxin activity by low alkaline pH)《無脊椎動物病理學(xué)雜志》(J.Invertebrate Pathol.)6047-52Galjart，N.等，1987。《對于編碼得自蘇云金芽孢桿菌morrisoni亞種(PG-14)的27.3kDa溶胞性蛋白的基因的質(zhì)粒定位、克隆和序列分析》(Plasmid location，cloning，and sequence analysis of the gene encoding a 27.3 kilodalton cytolyticprotein from Bacillus thuringiensis subsp.morrisoni(PG-14)，《現(xiàn)代微生物學(xué)》(Current Microbiol.)16171-177Geiser，M.等，1986?！对诰幋a蘇云金芽孢桿菌昆蟲病原體晶體蛋白的基因內(nèi)的超變區(qū)域庫氏亞種HDlkurdhl基因的核苷酸序列》(The hypervariable regionin the genes coding for entomopathogenic crystal proteins of Bacillus thuringiensisnucleotide sequence of the kurdh 1 gene of subsp.kurstaki HD1.)，《基因》(Gene)48109-118Hofte，H.等，1989?！短K云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白》(Insecticidal crystalproteins of Bacillus thuringiensis)，《微生物學(xué)評論》(MicrobiologicalReviews)53(2)242-255Huber-Lukac，M.等1983?！犊固K云金芽孢桿菌蘇云金變種活化d-內(nèi)毒素單克隆抗體的特異性》(Specifities of monoclonal antibodies against the activated d-endotoxin of Bacillus thuringiensis var.thuringiensis)，《傳染與免疫》(Infect.andImmun.)40608-612Higuchi，M等，1992?！秲煞N類型腫瘤壞死因子受體及其通過可溶性受體與其單克隆抗體發(fā)生的細(xì)胞應(yīng)答的模型》(Modulation of two forms of tumor necrosisfactor receptors and their cellular response by soluble receptor and their monoclonalantibodies)，《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)26720892Hansen，M.B.等，1989。《對測定細(xì)胞生長/細(xì)胞死亡的正確和快速染色法的重新檢查和進一步發(fā)展》(Re-examination and further development of a precise andrapid dye method for measuring cell growth/cell kill.)，《免疫學(xué)方法》(Immunol.Method.)119203Koni，P.A.等，1993?！秾π碌奶K云金芽孢桿菌溶胞性δ內(nèi)毒素的克隆與鑒定)》(Cloning and Characterization of a novel Bacillus thuringiensis cytolytic delta-endotoxin)，《分子生物學(xué)雜志》(Mol.Biol.)*319-327Luthy，P.等，1982。《蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素的生理學(xué)包括超微結(jié)構(gòu)和組織病理學(xué)研究。在人疾病載體的微生物殺蟲劑的基礎(chǔ)生物學(xué)中》(Physiology ofthe delta endotoxin of Bacillus thuringiensis including the ultrastructure andhistopathological studies.in Basic Biology of Microbial Larvicide of Vectors ofHuman Disease；)，Proc.of Consultation Convened in Geneva pp 29-36Lereclus，D.等，1995。《蘇云金芽孢桿菌spo OA突變株內(nèi)包被殺蟲晶體蛋白的超量生產(chǎn)》(Overproduction of encapsulated insecticidal crystal protein in aBacillus thuringiensis spo OA mutant)，《生物/技術(shù)》(Bio/Technology)1367-71Li，J等，1991。《得自蘇云金芽孢桿菌的d內(nèi)毒素在2.5埃分辨率的晶體結(jié)構(gòu)》(Crystal structure of insecticidal d-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 Aresolution)《自然》(Nature)353815-821.
Montgomery R等，1981?！短烊粊碓吹目鼓[瘤化合物中的寡聚肽和蛋白質(zhì)》(Oligopeptides and Proteins in Antitumor Compounds of Natural Origin)，(Aszalos A編輯)CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L.
Mummigatti，S.G.等，1990?！督橘|(zhì)組成對蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種的d內(nèi)毒素產(chǎn)生的影響》(Influence of media composition on the production of d-endotoxin by Bacillus thuringiensis var.thuringiensis)，《無脊椎動物病理學(xué)雜志》(J.Invertebrate Pathol.)55147-151Ogiwara K.等，1992?！独枚喾N昆蟲幼蟲的胃液加工蘇云金芽孢桿菌kurtaki亞種HD-1和HD-73的d-內(nèi)毒素》Processing ofd-endotoxin from Bacilllusthuringiensis subsp.kurstaki HD-1 and HD-73 by gut juice of various insect larvae.《無脊椎動物病理學(xué)雜志》(J.Invertebrate Pathol.)60121-126.
Prasad，S.等，1973?！短K云金芽孢桿菌蘇云金變種伴孢晶體對Yoshida腹水瘤的抑制活性》(Inhibitory activity of the parasporal crystal of Bacillus thuringiensisvar.thuringiensis.on Yoshida ascites sarcoma)《現(xiàn)代科學(xué)》(Current Sci)42568-570Prasad，S.等，1974?！稄奶K云金芽孢桿菌蘇云金變種的d內(nèi)毒素中純化、結(jié)晶和部分鑒定抗腫瘤和殺蟲性蛋白質(zhì)亞基》(Purification Crystallization andpartial characterization of the antitumor and insecticidal protem subunit from the d-endotoxin of Bacillus thuringiensis var.thuringiensis)《生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報》(Biochim.Biophy.Acta.)3663558-566Prasad，S.等，1975?！独锰K云金芽孢桿菌蘇云金變種蛋白晶體加強免疫應(yīng)答》(Enhancement of immune response by the proteinaceous crystal of Bacillusthuringiensis var.thuringiensis)《生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊》(Biochim.Biophy.Res.Commun.)62517-523Prasad，S.等，1976a。《在用蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種蛋白質(zhì)晶體處理后對Yoshida腹水瘤的抗腫瘤免疫性》(Antitumor immunity against Yoshida ascitessarcoma after treatment with the proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensisthuringiensis)《抗微生物藥物和化學(xué)》(Antimicrobial Agent&Chemo.)14285-288Prasad，S.等，1976b?！兜米蕴K云金芽孢桿菌蘇云金變種蛋白質(zhì)晶體的純化抗腫瘤蛋白對Yoshida腹水瘤細(xì)胞的作用方式》(Mode of action of a purifiedantitumor protein from the proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensisthuringiensis on Yoshida ascites sarcoma cell)《抗微生物藥物和化學(xué)》(AntimicrobialAgent&Chemo.)10(2)293-298Prasad，S.等，1976c?！短K云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)晶體的生物化學(xué)和生物學(xué)活性》(Biochemistry and biological activity of the proteinaceous crystal of Bacillusthuringiensis)《生物化學(xué)評論》(Biochemical Rev.)4770-76Schnepf，H等，1985?！队蒁NA堿基序列推導(dǎo)的蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白的氨基酸序列》(The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillusthuringiensis deduced from DNA base sequence)《生物化學(xué)雜志》(J.Biochem.)260(10)6264-6272Thomas，W.等，1983。《蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種晶體d內(nèi)毒素在體外和體內(nèi)對昆蟲和哺乳動物細(xì)胞的作用》(Bacillus thuringiensis var thuringiensiscrystal d-endotoxineffects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo)《細(xì)胞科學(xué)雜志》(J.Cell Sci.)60181-197Vandre D等，1982?！禠argomycin制備特性和結(jié)構(gòu)》(LargomycinPreparation properties and structure)《生物化學(xué)》(Biochemistry)60181-197Waalwiik，C等，1985?！短K云金芽孢桿菌以色列亞種的Mr28,000晶體蛋白質(zhì)基因的分子克隆和核苷酸序列》(Molecular cloning and the nucleotide sequenceof the Mr28,000 crystal protein gene of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)《核酸研究》(Nucleic Acids Res)138207-8217Ward，E.等，1986。《蘇云金芽孢桿菌以色列變種的d內(nèi)毒素的核苷酸序列和對其在蘇云金芽孢桿菌和大腸桿菌中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的鑒定》(Bacillus thuringiensisvar.israelensis d-endotoxin nucleotide sequence and characterization of thetranscripts in Bacillus thuringiensis and Escherichia Coli.)《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)1911-11Ward，E.等，1986?！短K云金芽孢桿菌以色列變種的δ內(nèi)毒素。毒素在有孢子和無孢子枯草芽孢桿菌內(nèi)的克隆和表達》(Bacillus thuringiensis var.israelensisδ-endotoxin.Cloning and expression of the toxin in sporogenic and asporogenic strainof Bacillus subtillis)《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)19113-22Wu，D.和Chang，F(xiàn).N.，1985?！兜米蕴K云金芽孢桿菌以色列亞種的26和65kDa蛋白質(zhì)在殺蚊活性方面的協(xié)同作用》(Synergism in mosquitocidal activity of26 and65 kDa protein from Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)(crystal FEBSLett)190232-236Wu，D.和Federici，B.A.，1993?！兑环N20千道爾頓的蛋白質(zhì)保存細(xì)胞活性并且在蘇云金芽孢桿菌內(nèi)孢子形成過程中促進cytA晶體的形成》(A 20-kilodaltonprotein preserve cell viability and promotes cytA crystal formation during sporulationin Bacillus thuringiensis)《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)1755276-5280Waring M.J.和Ponder B.A.J.(編輯)(1992)。《尋找新的抗癌藥物》(The searchfor new anticancer drugs)Kluwer Acad.Press，Boston.
Yamamoto，T.等，1981。《從蘇云金芽孢桿菌庫氏變種的伴孢晶體中分離蛋白質(zhì)對蚊子幼蟲帶喙伊蚊(Aedes taeniarhynchus)具有毒性》(Isolation of a proteinfrom the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var.kurstakitoxic to themosquito larva，Aedes taeniarhynchus)BBRC 103414-421Yamaoto，T.和Ilzuka，T.，1983。《蘇云金芽孢桿菌庫氏亞種的伴孢晶體內(nèi)兩種類型的殺蟲毒素》(Two types of entomocical toxins in the parasporal crystal ofBacillus thuringiensis krustaki)《生物化學(xué)和生物物理學(xué)文獻》(Arch.Biochem.Biophys)227233-241Yokoyama，Y.等，1988?！独锰K云金芽孢桿菌以色列亞種的毒素加強抗癌藥物在L1210培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)胞毒性作用》(Potentiation of the cytotoxic activityof anti-cancer drugs in cultured L 1210 cells by Bacillus thuringiensis subsp.sraelensistoxin)《化學(xué)藥物學(xué)》(Chem.Pharm.Bull)364499-4504
Yokoyama，Y.等，1991?！独锰K云金芽孢桿菌以色列亞種的毒素加強博來霉素在小鼠體內(nèi)對實體瘤的抗腫瘤活性》(Potentiation of the antitumor activity ofbleomycin towards solid tumous in mice by Bacillus thuringiensis subsp.israelensistoxin)《抗癌研究》(Anticancer Res.)111625-1628Yokoyama，Y.等，1992。《在蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的d-內(nèi)毒素存在下過熱加強博來霉素的細(xì)胞毒性》(Hyperthermic potentiation of bleomycincytotoxicity in the presence of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis d-ensotoxin)Yokoyama，Y.和Kohda，K.，1994。《由蘇云金芽孢桿菌以色列亞種的d-內(nèi)毒素與博來霉素的協(xié)同加強作用增加DNA鏈的斷裂而引起的細(xì)胞毒性的加強》(Enhanced cytotoxicity caused by increased DNA strand breakage resulting fromsynergistic potentiation of bleomycin with Bacillus thuringiensis subsp.israelensis d-endotoxin)Yan，X.和McCarty，W.J.，1991。《對蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種(HD-524)的經(jīng)胰蛋白酶活化的內(nèi)毒素的化學(xué)修飾酪氨酸殘基在鱗翅目細(xì)胞裂解中的意義》(Chemical modification of Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis(HD-524)trypsin-activated endotoxinimplication of tyrosine residue in lepidopteran celllysis)《無脊椎動物病理學(xué)雜志》(J.Invertebrate Pathol.)57101-108.
Yoshisue，H.等，1993?！兜米蕴K云金芽孢桿菌以色列亞種的晶體蛋白編碼基因cry IVB的啟動子的鑒定》(Identification of a promoter for the crystal protein-encoding gene cry IVB from Bacillus thuringiensis subsp.israelensis)《基因》(Gene)137247-251本發(fā)明書中提到的專利或出版物都體現(xiàn)著所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的研究水平。本發(fā)明對此進行了相同程度的引用和參考，即具體、單獨對其進行了說明，以表示在此被引用和參考。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明非常適合實施本發(fā)明的目的，并獲得所述的以及隱含的結(jié)果和優(yōu)點。在此描述的實施例、方法、過程、處理方法、分子和具體的化合物都代表著優(yōu)選的實施方式，它們是范例性質(zhì)的，而不是對本發(fā)明范圍的限定。屬于后文權(quán)利要求書精神范圍內(nèi)的改動和其它用途對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
序列表(1)一般信息(i)申請人Aggarwal，Bharat B.和Padilla，Cristina Rodriguez(ii)發(fā)明名稱新的得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金變種的抗增殖蛋白(iii)序列數(shù)量1(iv)聯(lián)系地址(A)收件人James F.Weiler，Attorney-at-Law(B)街道One Riverway，Suite 1560(C)城市Houston(D)州德克薩斯(E)國家美國(F)郵政編碼77056(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型DS，HD1.44Mb/1.44Mo(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect 6.0(vi)本申請信息(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Weiler，James F.(B)登記號16,040(C)文獻/卷宗號D-5789(ix)通訊信息(A)電話713-626-8646(B)電傳713-963-5853(2)SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)長度20
(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型(A)種類蛋白質(zhì)(iii)假定無(iv)反義鏈無(vi)原來源(B)菌株(C)單獨分離株(D)發(fā)展階段(F)組織類型(G)細(xì)胞類型(H)細(xì)胞系(xi)SEQ ID NO1的序列描述Pro Ser Thr Val Val Asn Val Ser Asn Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ile Glu Lys Glu Phe1 5 10 15 20
權(quán)利要求
1.一種分離和純化自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE測定的分子量約為20千道爾頓(kDa)，所述的蛋白具有部分SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，而且，所述蛋白表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)對蛋白酶和酸性條件敏感，所述的細(xì)胞毒性作用能夠耐受二硫蘇糖醇處理或暴露于100℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)對U-937細(xì)胞、髓細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成紅細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述的細(xì)胞毒性作用受抗該蛋白的抗體的抑制。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)對正常的人外周血淋巴細(xì)胞和人包皮成纖維細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。
6.一種藥物組合物，其中包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上認(rèn)可的載體。
7.一種處理腫瘤細(xì)胞的方法，它包括對所述細(xì)胞使用治療有效量的權(quán)利要求6所述的組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞選自髓細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、成紅細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞存在于人或動物體內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的組合物抑制腫瘤的復(fù)發(fā)。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的處理延長所述腫瘤細(xì)胞宿主的存活時間。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的處理方法，其中所述的腫瘤細(xì)胞在體外。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種得自蘇云金芽孢桿菌蘇云金亞種的分離和純化蛋白,該蛋白的分子量經(jīng)SDS－PAGE測定約為20千道爾頓(kDa),所述的蛋白具有部分SEQ ID NO∶1所示的氨基酸序列,而且,所述蛋白表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。本發(fā)明還提供了一種處理腫瘤細(xì)胞的方法,該方法包括對所述細(xì)胞使用治療有效量的本發(fā)明組合物。
文檔編號A61P35/00GK1192220SQ96196036
公開日1998年9月2日 申請日期1996年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月31日
發(fā)明者B·B·阿加瓦爾, C·R·帕迪利亞 申請人:研究發(fā)展基金會, 新萊昂州自治大學(xué)