一種水解乳蛋白及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種水解乳蛋白的制備方法，在酪蛋白水溶液中加入胰酶，在100～150MPa、40～50℃下酶解4～24h后，終止酶解反應，再將酶解產(chǎn)物進行后處理，得到水解乳蛋白。本發(fā)明還提供應用該方法制備得到的水解乳蛋白及其應用。應用本發(fā)明的方法所得產(chǎn)物的分子量小于10 kDa，并富含氨基酸和多肽，具有生物活性，適用于細胞培養(yǎng)，能夠作為低血清或無血清培養(yǎng)基的添加劑，廣泛應用于食品營養(yǎng)、制藥、保健食品和細胞培養(yǎng)領域中。
【專利說明】
一種水解乳蛋白及其制備方法和應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術技術領域，具體涉及一種水解乳蛋白及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 水解乳蛋白是一種重要的蛋白水解物，是乳蛋白經(jīng)蛋白酶或肽酶水解的產(chǎn)物，含 有豐富的氨基酸和多肽，可為細胞生長提供多種營養(yǎng)成分、貼壁因子及生長因子類似物等， 廣泛用于生物制藥、疫苗、食品等行業(yè)。Eagle等20世紀50年代將水解乳蛋白用于細胞 和微生物培養(yǎng)基，隨后Mam 〇rU，Ami〇t等分別將水解乳蛋白用于皮膚、器官等多種細胞的培 養(yǎng)。我國學者張爾賢于1986年從原料、酶制劑及產(chǎn)品檢測等多個角度探討了細胞培養(yǎng)用水 解乳蛋白的研制過程。目前國內(nèi)水解乳蛋白主要以美國Hyclone和Gibco產(chǎn)品為主，開發(fā) 水解乳蛋白在國內(nèi)具有廣闊的市場前景。國外只有美國Gibco和Hyclone兩家公司利用牛乳 生產(chǎn)水解乳蛋白，產(chǎn)品遠銷歐、美、亞等國家。國內(nèi)水解乳蛋白的生產(chǎn)為空白，幾乎所有科研 與生產(chǎn)用戶都依賴進口產(chǎn)品，進口產(chǎn)品價格昂貴，大大增加了運營成本。
[0003] 酪蛋白，是一種大型、堅硬、致密、極困難消化分解的凝乳，是牛奶中的主要蛋白 質(zhì)，占總蛋白的80%。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾的程度和類型不同，其酪蛋白的組成也 有所不同。主要由asl-、asl-、i3-和K-四種類型的酪蛋白組成，這四種酪蛋白的分子量分別 是asl-分子量為23KD, asl-分子量為25KD, β-酪蛋白的分子量為24KD，k-酪蛋白的分子量 為19KD。酪蛋白在乳體系中的主要生理作用是新生牛生長所需氨基酸的主要來源。因此，酪 蛋白成為一種重要的蛋白水解物的前體。根據(jù)其氨基酸序列大小的不同，其在生物體內(nèi)或 體外具有免疫調(diào)節(jié)、抑制細菌和病毒、抗癌、抗氧化和清除自由基、改善元素吸收等生理功 能和作用。從而作為酪蛋白磷酸肽(〇386；[11卩110 8。11(^6。1^(168，0??8)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (Angiotensin converting enzyme, ACE)抑制肽、抗氧化肽（antioxidant peptide)和水 解乳蛋白（Lactoalbumin hydrolysate, LH)等生物活性肽的原材料。Cruz-Huerta E等采 用胰蛋白酶水解酪蛋白分離了CPPs; Solieri L等采用乳酸菌發(fā)酵法從酪蛋白中分離了ACE 抑制肽;Xie NN等采用堿性蛋白酶水解酪蛋白分離了抗氧化肽。
[0004] 目前，水解乳蛋白的制備方法主要有酸水解法，堿水解法和酶水解法。在生物技術 領域中蛋白質(zhì)的水解方法主要以酶解法為主。
[0005] 酸水解法:Braconnot在1820年第一次報道。該方法主要是用在食品領域中，主要 是增加和改善食品的風味。在生物技術領域中只占一小部分。這是因為酸水解最常用的是 硫酸水解或鹽酸水解，在蛋白質(zhì)水解過程中，有一些必需氨基酸被破壞，例如色氨酸，蛋氨 酸，胱氨酸、半胱氨酸等，谷氨酰胺和天冬酰胺進一步的被轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸。更顯 著的是酸水解破壞了蛋白質(zhì)中的特有氨基酸或者短時間內(nèi)破壞了大量的小分子肽。除此之 外，酸水解過程中鹽含量顯著的增加，脫鹽等疑難問題在下游技術中需要解決。通常酸水解 的酪蛋白和大豆蛋白用于診斷和發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0006] 堿水解法:在生物技術領域中堿水解法使用很少，但在食品領域中，堿水解蛋白質(zhì) 的方法被廣泛使用，在水解過程中有些蛋白質(zhì)被破壞。如絲氨酸和蘇氨酸，但色氨酸是完整 的。
[0007] 酶水解法：目前有大量的動物、植物和微生物蛋白質(zhì)可用多種酶進行酶解，并使用 于生物技術領域中，近幾年，發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶水解蛋白質(zhì)技術被大量學者研究。酶解蛋白 質(zhì)的主要優(yōu)勢是水解條件溫和，制造商能夠精確控制蛋白質(zhì)水解物的水解度，從而滿足不 同的用戶。蛋白質(zhì)水解常用的蛋白酶有動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物發(fā)酵的蛋白酶。動 物蛋白酶主要有胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白 酶，還有細菌和真菌性蛋白酶屬于微生物酶。蛋白質(zhì)的水解可以用單酶來完成，也可以采用 多種酶連續(xù)水解的方法來完成。酶的選擇經(jīng)常依賴于蛋白質(zhì)的來源和最終用戶的要求。例 如，蛋白質(zhì)中含有較高濃度的疏水性的氨基酸，在酶的選擇是就要選擇能夠特異性水解疏 水性氨基酸的酶。但酶水解法由于酶的專一性，其水解效果差，水解不徹底。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種水解乳蛋白的制備方法，是 利用高壓酶解酪蛋白制備得到的，所得到的水解乳蛋白適用于動物細胞培養(yǎng)，能夠作為低 血清或無血清培養(yǎng)基的添加劑。
[0009] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種水解乳蛋白的制備方法，在酪蛋白水溶液中加入 胰酶，在100~150MPa、40~50 °C下酶解4~24h后，終止酶解反應，再將酶解產(chǎn)物進行后處 理，得到水解乳蛋白。
[0010] 作為優(yōu)選，所述酪蛋白水溶液中酪蛋白的質(zhì)量百分含量為10%-15%; 作為優(yōu)選，所述酪蛋白與胰酶的質(zhì)量比為5:1。
[0011] 作為優(yōu)選，所述胰酶為多酶復合物，主要成分是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。
[0012] 作為優(yōu)選，所述終止酶解反應是將酶解產(chǎn)物沸水浴15min。
[0013] 作為優(yōu)選，所述將酶解產(chǎn)物進行后處理是將酶解產(chǎn)物離心、過濾、干燥(冷凍干燥 或噴霧干燥）;作為優(yōu)選，所述干燥為噴霧干燥。
[0014] 作為優(yōu)選，所述噴霧干燥是將濾液在進風溫度160~180°C，出風溫度為80~90°C 的條件下噴霧干燥，水分小于5%。
[0015] 本發(fā)明的第二個目的是提供應用上述的方法制備得到的水解乳蛋白。
[0016] 本發(fā)明的第三個目的是提供水解乳蛋白在細胞培養(yǎng)中的應用。
[0017] 作為優(yōu)選，所述細胞為BHK-21。
[0018] 作為優(yōu)選，所述應用的具體方法為： 將水解乳蛋白加入到培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中，使水解乳蛋白的質(zhì)量百分比濃度為〇.2%_ 0.5% 〇
[0019] 比如，將水解乳蛋白補充到|^^01^1^12、1^頂1640及歐氏液等構(gòu)成的基礎培養(yǎng) 基中，使水解乳蛋白的質(zhì)量百分比濃度為〇.2%-〇. 5%，用于培養(yǎng)細胞，根據(jù)需要，可補充1-10%FBS〇
[0020] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種細胞的培養(yǎng)方法，將水解乳蛋白加入到培養(yǎng)細胞 的培養(yǎng)基中，使水解乳蛋白的質(zhì)量百分比濃度為〇. 2%-0.5%，對細胞按常規(guī)培養(yǎng)方法進行貼 壁或懸浮培養(yǎng)。
[0021] 比如，在MEM、DMEM基礎培養(yǎng)基中添加0.2-0.5%的酪蛋白水解產(chǎn)物，根據(jù)需要可補 充1-10%FBS和部分生長因子，進行細胞的貼壁或懸浮培養(yǎng)。
[0022]應用本發(fā)明的方法所得產(chǎn)物的分子量小于10 kDa，并富含氨基酸和多肽，具有生 物活性，適用于細胞培養(yǎng)，能夠作為低血清或無血清培養(yǎng)基的添加劑，廣泛應用于食品營 養(yǎng)、制藥、保健食品和細胞培養(yǎng)領域中。
[0023]本發(fā)明的水解乳蛋白的方法用時短，在酶解同時采用了超高壓處理技術，超高壓 技術是在超高壓系統(tǒng)和一定的壓力下通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而改變了蛋白質(zhì)本身的功 能。使用超高壓協(xié)同酶解水解較酸、堿水解反應條件溫和，水解徹底，水解率高。且本方法只 需要一步水解反應，不需要使用其它酶再次水解。本發(fā)明的主要目的是對現(xiàn)有牛乳和干酪 素產(chǎn)品進行科技創(chuàng)新，產(chǎn)業(yè)升級，酶解后所獲得的生物活性肽不僅附加值高，安全性好，工 藝簡單，而且容易進行產(chǎn)業(yè)化。
【附圖說明】
[0024]附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為本發(fā)明的水解乳蛋白的游離氨基酸檢測結(jié)果； 圖2為應用本發(fā)明的水解乳蛋白培養(yǎng)BHK-21細胞的培養(yǎng)結(jié)果； 圖3為應用本發(fā)明的水解乳蛋白培養(yǎng)BHK-21細胞的細胞存活率。
【具體實施方式】
[0025] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0026] 本發(fā)明的一種酶解酪蛋白制備水解乳蛋白的方法為： 1、底物溶液的配制:按10-15%(質(zhì)量百分比濃度)稱取酪蛋白干粉置IOL反應器中，同時 加入純化水形成料液，將料液的pH調(diào)節(jié)至弱堿性(7.0~8.0)。
[0027] 2、超高壓酶解:在步驟1的料液中按照酪蛋白干粉:胰酶(E:S)=1: 5比例加入相應 量的胰酶攪拌均勻，調(diào)pH在7.5左右后，置超高壓生物反應器中，在一定的壓力（100~ 150MPa)和溫度(40~50°C)下超高壓酶解一定的時間（4~24h)。
[0028] 其中，胰酶為多酶復合酶，主要成分是胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶，還有羧肽 酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、激肽釋放酶和核糖核酸酶等，購自重慶奧力生物制藥有限公司。
[0029] 胰酶是一種多酶復合物，其與氨基酸的結(jié)合位點具有專一性。胰蛋白酶水解陽離 子氨基酸結(jié)合位點(Arg、Lys)，糜蛋白酶能夠水解芳香族和支鏈氨基酸的結(jié)合位點（Tyr， Phe, Trp, Leu)，羧肽酶A除了不能水解Asp, Glu, Arg, Lys四種氨基酸的結(jié)合位點以外， 其余各種氨基酸的結(jié)合位點都能被水解，彈性蛋白酶能夠水解Ala的結(jié)合位點。因此，本發(fā) 明所使用的胰酶能夠水解多個氨基酸位點。
[0030] 3、滅活:將步驟2的酶解產(chǎn)物沸水浴10-20min，使沒有反應完全的酶失去活性。再 將其溫度立即冷卻至室溫。
[0031] 4、離心：將滅活后的酶解產(chǎn)物3000-4000rpm離心20-40min，去除未水解的蛋白和 變性的酶。收集上清液。
[0032] 5、板框壓濾:將步驟4所得的水解液采用濾布過濾。
[0033] 6、超濾:采用IOKD的超濾膜去除大分子蛋白和殘留的水解用酶。收集濾液，即為蛋 白水解液。
[0034] 6、干燥:將步驟5中蛋白水解液在進風溫度160~180 °C，出風溫度為80~90 °C的條 件下噴霧干燥，水分小于5%，得水解乳蛋白干粉。
[0035] 7、檢測:使用氨基酸分析儀測定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法檢測氨基氮含量， 采用凱氏定氮法檢測總氮含量，最后計算水解度。對分子量進行檢測。同時與Hyclone水解 乳蛋白進行對比。如果其值與Hyclone水解乳蛋白差異不顯著，即為合格。 「〇〇361 每其氣會葛· 6氣會葛· 7k細瘡給》1娃里余m豐1
游離氨基酸檢測結(jié)果參見圖1和表2,其中，圖A為Hyclone水解乳蛋白氨基酸檢測圖 譜，圖B為本發(fā)明的水解乳蛋白氨基酸檢測圖譜；1為磷酸絲氨酸（P-Ser) ; 2為天冬氨酸 (Asp); 3為蘇氨酸(Thr) ; 4為絲氨酸（Ser) ; 5為天冬酰胺(AspNH2); 6為谷氨酸(Glu); 7為谷 氨酰胺(GluNH2) ; 8為甘氨酸(Gly) ; 9為丙氨酸(Ala) ; 10為纈氨酸(Val) ; 11為胱氨酸(Cys); 12為蛋氨酸(Met) ; 13為異亮氨酸（lie) ; 14為亮氨酸(Leu) ; 15為酪氨酸(Tyr) ; 16為苯丙氨 酸(Phe) ; 17為氨(NH3) ; 18為賴氨酸(Lys) ; 19為組氨酸(His) ; 20為精氨酸(Arg)。
由表2和圖1可以看出，Hyclone水解乳蛋白和本發(fā)明的水解乳蛋白中的氨基酸含量有 明顯的差異(P〈〇.05)，其氨基酸總量分別為24.04±0.768 %和46.202±2.263 %。本發(fā)明的 水解乳蛋白氨基酸總含量高于Hyclone水解乳蛋白的氨基酸總含量。
[0039]應用本發(fā)明方法所得產(chǎn)物的分子量小于10 kDa。
[0040]以下為本發(fā)明的水解乳蛋白的制備實施例。
[0041 ] 實施例1 一種超高壓酶解酪蛋白制備水解乳蛋白方法，包括如下步驟： 1、底物溶液的配制:稱取1500g酪蛋白干粉置IOL反應器中，同時加入純化水至IOL攪拌 均勻形成料液，將料液的pH調(diào)節(jié)至7.5。
[0042] 2、超高壓酶解:在步驟1的料液中按照E: S=I: 5比例加入胰酶300g攪拌均勻，調(diào)pH 在7.5后，置超高壓生物反應器中，在壓力150MPa、溫度45 °C下超高壓酶解4h。
[0043] 3、滅活:將步驟2的酶解產(chǎn)物沸水浴15min，使反應沒有完全的酶失去活性。再將其 溫度立即冷卻至室溫。
[0044] 4、離心:酶解產(chǎn)物經(jīng)滅活后3800rpm離心30min，去除未水解的蛋白和變性的酶。收 集上清液。
[0045] 5、板框壓濾:將步驟4所得的水解液采用濾布過濾。收集濾液，即為蛋白水解液。
[0046] 6、超濾:采用IOKD的超濾膜去除大分子蛋白和殘留的水解用酶。
[0047] 7、干燥:將步驟5中濃縮液在進風溫度180°C，出風溫度為90°C的條件下噴霧干燥， 水分小于5%，得水解乳蛋白干粉760.22g。
[0048] 8、檢測:使用氨基酸分析儀測定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法檢測氨基氮含量， 采用凱氏定氮法檢測總氮含量，最后計算水解度。同時與Hyclone水解乳蛋白進行對比。經(jīng) 檢測，各項數(shù)值均在表1、表2和圖1所示范圍內(nèi)。
[0049] 實施例2 一種超高壓酶解酪蛋白制備水解乳蛋白方法，包括如下步驟： 1、底物溶液的配制:稱取1000 g酪蛋白干粉置IOL反應器中，同時加入純化水至IOL攪拌 均勻形成料液，將料液的PH調(diào)節(jié)至7.0。
[0050] 2、超高壓酶解:在步驟1的料液中按照E: S=I: 5比例加入胰酶300g攪拌均勻，調(diào)pH 在7.6后，置超高壓生物反應器中，在壓力10010^、溫度50°(：下超高壓酶解1011。
[0051] 3、滅活:將步驟2的酶解產(chǎn)物沸水浴lOmin，使反應沒有完全的酶失去活性。再將其 溫度立即冷卻至室溫。
[0052] 4、離心:酶解產(chǎn)物經(jīng)滅活后3000rpm離心40min，去除未水解的蛋白和變性的酶。收 集上清液。
[0053] 5、板框壓濾:將步驟4所得的水解液采用濾布過濾。收集濾液，即為蛋白水解液。
[0054] 6、超濾:去除大分子蛋白和殘留的水解用酶。
[0055] 6、干燥:將步驟5中濃縮液在進風溫度170°C，出風溫度為85°C下噴霧干燥，水分小 于5%，得水解乳蛋白干粉608 · 35g。
[0056] 7、檢測:使用氨基酸分析儀測定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法檢測氨基氮含量， 采用凱氏定氮法檢測總氮含量，最后計算水解度。同時與Hyclone水解乳蛋白進行對比。經(jīng) 檢測，各項數(shù)值均在表1、表2和圖1所示范圍內(nèi)。
[0057] 實施例3 一種超高壓酶解酪蛋白制備水解乳蛋白方法，包括如下步驟： 1、底物溶液的配制:稱取1200g酪蛋白干粉置IOL反應器中，同時加入純化水至IOL攪拌 均勻形成料液，將料液的pH調(diào)節(jié)至8.0。
[0058] 2、超高壓酶解:在步驟1的料液中按照E: S=I: 5比例加入胰酶300g攪拌均勻，調(diào)pH 在7.4后，置超高壓生物反應器中，在壓力120MPa、溫度40 °C下超高壓酶解一定的時間24h。
[0059] 3、滅活:將步驟2的酶解產(chǎn)物沸水浴20min，使反應沒有完全的酶失去活性。再將其 溫度立即冷卻至室溫。
[0060] 4、離心:酶解產(chǎn)物經(jīng)滅活后4000rpm離心20min，去除未水解的蛋白和變性的酶。收 集上清液。
[0061 ] 5、板框壓濾:將步驟4所得的水解液采用濾布過濾。收集濾液，即為蛋白水解液。
[0062] 6、超濾:去除大分子蛋白和殘留的水解用酶。
[0063] 6、干燥:將步驟5中濃縮液在進風溫度160°C，出風溫度為80°C下噴霧干燥，水分小 于5%，得水解乳蛋白干粉591.95g。
[0064] 7、檢測:使用氨基酸分析儀測定各氨基酸含量，采用甲醛滴定法檢測氨基氮含量， 采用凱氏定氮法檢測總氮含量，最后計算水解度。同時與Hyclone水解乳蛋白進行對比。如 果其值與Hyclone水解乳蛋白差異不顯著，即為合格。經(jīng)檢測，各項數(shù)值均在表1、表2和圖1 所示范圍內(nèi)。
[0065] 實施例4 應用本發(fā)明的水解乳蛋白對細胞的培養(yǎng)試驗 一、應用本發(fā)明的水解乳蛋白培養(yǎng)BHK-21細胞。
[0066]細胞貼壁培養(yǎng)方法： 用含有0.25%實施例1制備得到的水解乳蛋白的基礎培養(yǎng)基(45%MEM，45%歐氏液，10% FBS)培養(yǎng)M1K-21細胞。同時以MEM培養(yǎng)基為空白組，含有0.25%Hyclone水解乳蛋白的基礎培 養(yǎng)基為對照組。
[0067]細胞活力和毒性檢測 細胞活力米用3-(4，5-dimehyl-thiazol-2-yl) 2，5-diphenyltetrazoium bromide (MTT)法進行分析，具體步驟為:將BHK-21細胞消化后制成細胞懸液，按照I X IO5個/mL的濃 度接種100μΙ與96孔板中37°C培養(yǎng)24h后，將細胞培養(yǎng)液更換為含有0.25%和0.5%水解乳蛋 白的維持液(48.5%MEM，48.5%歐氏液，3%FBS)37 °C培養(yǎng)48h，每孔加入25μ1ΜΤΤ溶液(5mg/ml， 艮P 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液終止培養(yǎng)。每孔加入125μ1二甲基亞砜 (DMSO)，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔 的吸光值。同時以MEM培養(yǎng)基為空白組。含有0.25%Hyc lone水解乳蛋白的基礎培養(yǎng)基為對照 組。
[0068] 培養(yǎng)結(jié)果參見圖2。在圖2中，A為空白組，B為試驗組，C為對照組。由圖2可以看出， BHK-21細胞培養(yǎng)24h時，空白組、試驗組和對照組的細胞均能生長至50%以上;在48h均生長 成致密單層，細胞生長正常，形態(tài)良好。但在48h試驗組和對照組的細胞密度明顯高于空白 組。這說明Hyclone水解乳蛋白和本發(fā)明的水解乳蛋白對BHK-21細胞均有促生長作用。 [0069] 細胞存活率結(jié)果參見圖3。在圖3中，MEM為空白組，0.25H為對照組，0.25ZZ和0.5ZZ 為試驗組。由圖3可以看出，用含有Hyclone水解乳蛋白或本發(fā)明的水解乳蛋白的MEM培養(yǎng)基 處理48h的BHK-21細胞與空白組比較均有較高的存活率，并具有明顯差異(P〈0.05)。其中對 照組、試驗組(0.25%zz)和試驗組(0.5%zz)的細胞存活率分別為1.281%，1.373%和1.618%。 因此，MTT分析證實，本發(fā)明的水解乳蛋白對BHK-21細胞沒有細胞毒性，反而具有促生長作 用，這與BHK-21細胞貼壁培養(yǎng)的結(jié)果相符合。
[0070] 二、應用本發(fā)明的水解乳蛋白培養(yǎng)Vero、CHO、ST、Marc-l 45或MDCK細胞。
[0071] 經(jīng)試驗，在培養(yǎng)Vero、CHO、ST、Marc-145或MDCK細胞時，將本發(fā)明的水解乳蛋白加 入到培養(yǎng)對應細胞的常用培養(yǎng)基中，使水解乳蛋白的質(zhì)量百分比濃度為〇. 2%-0.5%，對細胞 按常規(guī)培養(yǎng)方法進行貼壁或懸浮培養(yǎng)即可，就能很好的對Vero、CH0、ST、Marc-145SMDCI^H 胞進行培養(yǎng)，且細胞密度和存活率均高于使用不加入水解乳蛋白的培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果。 [0072]最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種水解乳蛋白的制備方法，其特征在于：在酪蛋白水溶液中加入胰酶，在100~ 150MPa、40~50°C下酶解4~24h后，終止酶解反應，再將酶解產(chǎn)物進行后處理，得到水解乳 蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述酪蛋白水溶液中酪蛋白的質(zhì)量百分含 量為5%-15%;作為優(yōu)選，所述酪蛋白與胰酶的質(zhì)量比為5:1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述胰酶為多酶復合物，主要成分是胰蛋 白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述終止酶解反應是將酶解產(chǎn)物沸水浴 10_15min〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述將酶解產(chǎn)物進行后處理是將酶解產(chǎn)物 離心、過濾、干燥(冷凍干燥或噴霧干燥）;作為優(yōu)選，所述干燥為噴霧干燥。6. 應用權(quán)利要求1-5任一所述的方法制備得到的水解乳蛋白。7. 權(quán)利要求6所述的水解乳蛋白在細胞培養(yǎng)中的應用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于：所述細胞為冊1(-21、￥6仰、〇10、31'、1^(3-145、]\?0(;優(yōu)選的細胞為^?-21。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于:所述應用的具體方法為:將水解乳蛋白加 入到培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中，使水解乳蛋白的質(zhì)量百分比濃度為〇. 2%-0.5%。10. -種細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于:將水解乳蛋白加入到培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中，使 水解乳蛋白的質(zhì)量百分比濃度為0.2%-0.5%，對細胞按常規(guī)培養(yǎng)方法進行貼壁或懸浮培養(yǎng)。
【文檔編號】C07K1/34GK106086136SQ201610508119
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】李明生, 馮玉萍, 馬忠仁, 靳冬武
【申請人】西北民族大學