Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽，其氨基酸序列由Tocilizumab模擬表位肽(KTMSAEEFDNWL)的C端和CH12偶聯(lián)模擬表位肽(WHTEILKSYPHE)的C端通過連接肽(GGGSGGS＝SGGGSGGG)(“＝”表示二硫鍵)連接而成。3個多肽可以運用化學(xué)合成法進行合成，結(jié)構(gòu)為線性。用該偶聯(lián)肽制備的雙特異性抗體，不僅能識別IL?6R，而且能識別EGFRvIII，從而同時抑制IL?6和EGF的活性，產(chǎn)生Tocilizumab單抗與CH12單抗相加的效果，同時克服了需要多次被動免疫的問題。本發(fā)明的偶聯(lián)肽為預(yù)防和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他疾病提供了新的藥物途徑。
【專利說明】
Toci I izumab/GH12偶聯(lián)模擬表位肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的模擬抗原肽，具體是一種T〇CiliZUmab/CH12偶 聯(lián)模擬表位肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、多向性的炎性自身免疫性疾病，主要累及 手足小關(guān)節(jié)，最大的特征就是持續(xù)性的滑膜炎，癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫脹以及進展性的 關(guān)節(jié)破壞，最終導(dǎo)致患者的殘疾。
[0003] 目前，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物主要包括激素，非留體抗炎藥，改善病情的抗 風(fēng)濕藥物(DMARDs)和新興的生物制劑。相對于傳統(tǒng)藥物，生物制劑直接作用于主要的炎癥 因子，可更迅速、有效地緩解癥狀，抑制關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞。目前，用于治療RA的生物制劑有單克 隆抗體(單抗）、細胞因子以及拮抗劑，包括抗T淋巴細胞表面分化抗原單抗、抗白介素-2受 體(IL-2R)單抗、抗CD54受體單抗、抗腫瘤壞死因子(TNF)-a抗體、重組人白細胞介素-1受體 詰抗劑等。
[0004] 2010年，Tocilizumab(ROACTEMRA)抗體經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。 To c i 1 i z umab是一個新型的革E1向IL-6R的單克隆抗體，通過將鼠抗人的IL-6 R抗體的互補決 定區(qū)移至人IgGl抗體的框架上從而減少在病人身上可能發(fā)生的免疫原性反應(yīng)，從抗原的結(jié) 合位置和抑制IL-6功能這兩方面來說，人源化抗體同最初的鼠抗體和抗IL-6R的嵌合性抗 體是一樣的。而人源化抗體的免疫原性更小且半衰期更長。Toci lizumab能夠特異性結(jié)合可 溶性IL-6受體和膜IL-6受體，并且抑制可溶性IL-6和膜IL-6的信號傳導(dǎo)，它在2005年獲得 了日本的藥物許可證明，用于治療Castelman綜合癥。Toci lizumab單克隆抗體是第一個臨 床試驗證明單用療效好于抗TNF的單抗以及MTX單抗的抗體(Jones G，Sebba A，Gu J et al.Comparison of tocilizumab monotherapy versus methotrexate monotherapy in patients with moderate to severe rheumatoid arthritis: the AMBITION study.Ann Rheum Dis，69:88;96,2010;Kremer JM，et al.Tocilizumab inhibits structural joint damage in rheumatoid arthritis patients with inadequate responses to methotrexate:results from the double-blind treatment phase of a randomized placebo-controlled trial of tocilizumab safety and prevention of structural joint damage at one year.Arthritis Rheum.63(3):609_21，2011)D 同時，該抗體與 DMARDs同用也顯示了其超越DMARDs單用的治療效果（Weinblatt M，et al.Safety of Tocilizumab monotherapy and TCZ plus DMARDs in a US RA population with inadequate response to biologies or DMARDs:The ACT-STAR study.London:EULAR, 2011)。因此Tocilizumab的應(yīng)用前景可能優(yōu)于抗TNF生物制劑。
[0005] 雖然臨床上各種單克隆抗體的生物療法推進了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫病或其 他難治性疾病的治療，但單克隆抗體在免疫治療中仍舊存在著許多不足之處:①抗體免疫 治療中為維持抗體的足夠效價，必須反復(fù)進行免疫;②反復(fù)免疫導(dǎo)致抗體的使用費用非常 昂貴;③抗體治療的副作用也限制了其應(yīng)用范圍，主要為易發(fā)感染和藥物超敏反應(yīng)。所以， 通過主動免疫誘導(dǎo)機體產(chǎn)生所需的抗體成為研究者新的選擇，其能克服被動免疫需重復(fù)進 行和非人源部分對人體的免疫傷害等缺點。
[0006] 為了克服單克隆抗體的這些應(yīng)用問題，國外學(xué)者提出了模擬表位肽的設(shè)計。模擬 表位肽，又稱鏡像表位，是一種能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫的多肽，它的最小結(jié)構(gòu)是6~20 個氨基酸長度。模擬表位肽能激活機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生主動免疫靶向靶分子，從而起到治 療疾病的作用，從而避免了單克隆抗體臨床上的問題。模擬表位肽的序列有可能和自然表 位的序列不同，但兩者的空間結(jié)構(gòu)類似，免疫動物后產(chǎn)生的多克隆抗體不僅能結(jié)合模擬表 位肽，而且能結(jié)合自然表位，介導(dǎo)進一步的生物學(xué)行為。通過免疫模擬表位肽，誘導(dǎo)機體自 身產(chǎn)生抗體祀向目標(biāo)分子。其成本低廉，安全性好，特異性高(Riemer AB，Jensen-Jarolim E.Mimotope vaccines: epitope mimics induce anti-cancer antibodies. Immunol Lett 20070ct 31；113(l):l-5)〇
[0007] 中國專利公開號104945485A(【公開日】2015-09-30 )公開了 一種抗IL-6受體 Toci 1 izumab的模擬表位肽。用該模擬表位免疫刺激機體產(chǎn)生的抗體，不僅能識別模擬表 位，還能夠識別IL-6受體從而抑制IL-6的活性，產(chǎn)生與Tocil i zumab單抗同樣的效果，同時 克服了需要多次被動免疫的問題。
[0008] 一些類風(fēng)濕性疾病與惡性腫瘤具有明顯的相關(guān)性，如皮膚炎與各種實體腫瘤、干 燥綜合征與淋巴瘤、系統(tǒng)性硬化與肺腺癌等，長期使用免疫抑制劑也可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者合并惡性腫瘤的情況國內(nèi)外均有報道，其具體發(fā)病機制不詳。近年來的相 關(guān)報道顯示，RA患者不但與血液和淋巴系統(tǒng)腫瘤如白血病、淋巴瘤等有一定的相關(guān)性，而且 與實體腫瘤如肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等也有一定的關(guān)聯(lián)。RA患者可先有惡性腫瘤，以后出 現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，也有的患者在患類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎若干年后發(fā)生惡性腫瘤，也有兩種病變同 時發(fā)生并有平行的病程。
[0009] RA與惡性腫瘤之間的關(guān)系較明確，加強這方面的認識和探索對診斷和治療有著重 要意義，然而目前在診斷和治療中還缺乏相應(yīng)的藥物。
[0010] 有鑒于此，特提出本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種T〇CiliZUmab/CH12偶聯(lián)模擬 表位肽，其免疫動物后所得的多克隆抗體能靶向兩類疾病的特異性靶點，并抑制這兩個靶 點的信號通路及惡性表型，進而達到治療效果。
[0012] 本發(fā)明提供的T〇Cilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽，氨基酸序列如SEQ ID N0:1所 示，由SEQ ID N0:2所示的Tocilizumab模擬表位肽的C端與SEQ ID N0:3所示的CH12模擬表 位肽的C端通過SEQ ID N0:4所示的連接肽連接而成;其中，
[0013] Tocilizumab模擬表位肽段:N基端-C末端KTMSAEEFDNWL(SEQ ID N0:2);
[0014] CH12模擬表位肽段:N基端-C末端WHTEILKSYPHE(SEQ ID N0:3);
[0015] 連接肽:N基端-C末端GGGSGGS = SGGGSGGG(SEQ ID從):4)，其中"="表示二硫鍵。
[0016] SEQ ID NO: 1的氨基酸序列如下：
[0017] KTMSAEEn)NWLGGGSGGS = SGGGSGGGEHPYSKLIETHW，兩邊的氨基酸K 和氨基酸 W為多 肽N基端，連接肽兩端的氨基酸L和氨基酸E為多肽C末端，連接肽為GGGSGGS = SGGGSGGG，= 表-?硫鍵。
[0018] CH12是一個尚處于實驗階段的抗EGFRvIII的單克隆抗體，其能結(jié)合只在腫瘤或一 些惡性疾病中表達的EGFRvIII和過表達的EGFR(與正常表達水平的EGFR不結(jié)合），從而抑制 下游的信號通路。單克隆抗體CH12在多種腫瘤的動物模型中都能有效抑制腫瘤的細胞惡性 表型，顯示出了很好的應(yīng)用前景（參見文獻：Xu W，et al.Combination of an anti-EGFRvIII antibody CH12with Rapamycin synergistically inhibits the growth of EGFRvIII+PTEN-glioblastoma in vivo . Oncotarget.2016Mar 26.doi:10.18632/ oncotarget.8407；Xu ff et al. Synergistic antitumor efficacy against the EGFRvIII+HER2+breast cancers by combining trastuzumab with anti-EGFRvIII antibody CHI2.Oncotarget.2015Nov 17；6(36):38840-53；Jiang H et al.The monoclonal antibody CH12augments 5_fluorouracil-induced growth suppression of hepatocellular carcinoma xenografts expressing epidermal growth factor receptor variant III.Cancer Lett.2014Jan 1；342(1):113-20；Yang Y et al. The monoclonal antibody CH12enhances the sorafenib-mediated growth inhibition of hepatocellular carcinoma xenografts expressing epidermal growth factor receptor variant III .Neoplasia· 2012Jun; 14(6): 509-18) D鑒于EGFR/EGFRvIII在類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎等惡性疾病以及惡性腫瘤中可能存在的重要致病機制，本發(fā)明以EGFR及其突變體 作為治療祀點，對識別該祀點的單克隆抗體CH12進行模擬表位設(shè)計，并與Toci 1 izumab模擬 表位偶聯(lián)，獲得了上述偶聯(lián)模擬表位肽，以期實現(xiàn)其抗體能夠雙靶點結(jié)合治療的效果。
[0019] 設(shè)計時:T〇Cilizumab模擬表位肽的C端連連接肽的N端，CH12偶聯(lián)模擬表位肽的C 端連連接肽的C端。而在實際制作中，可選的一種實施方式是:Tocili zumab模擬表位肽連同 連接肽的一半是一同通過化學(xué)合成法完成的(KTMSAEEFDNWLGGGSGGS)，同理，CH12偶聯(lián)模擬 表位肽連同連接肽的另一半是一同通過化學(xué)合成完成的(WHTEILKSYPHEGGGSGGGS)，最后兩 段用二硫鍵連起來。
[0020]通過線性連接肽將Tocilizumab模擬表位肽和CH12模擬表位肽進行偶聯(lián)，中間的 連接肽為線性，具有較高靈活性和擺動性的特點。這樣的結(jié)構(gòu)激活免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生雙特異 性抗體，該抗體能同時革G向IL-6R和EGFRvII I。這樣的設(shè)計產(chǎn)生的抗體能取代兩個不同的單 克隆抗體，發(fā)揮兩個單克隆抗體相加的作用。在未來可能的臨床應(yīng)用中，減少藥物使用的次 數(shù)，減少藥物的使用成本，提高安全性。
[0021] 本發(fā)明還提供了一組功能性基因序列，轉(zhuǎn)錄后翻譯獲得的多肽可以用于構(gòu)成上述 Toci 1 izumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽，其包括Toci 1 izumab模擬表位肽的編碼基因，CH12偶聯(lián) 模擬表位肽的編碼基因，以及連接肽的編碼基因。在多肽的氨基酸序列已知的情況下，每個 氨基酸殘基對應(yīng)的密碼子可以是一種或多種，基于此，可以根據(jù)需要采用現(xiàn)有技術(shù)手段做 出不同的密碼子連接組合，每條多肽對應(yīng)的多個密碼子組合形成的不同編碼基因，均在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0022] Tocilizumab模擬表位肽的編碼基因，優(yōu)選為5'_aag acg atg agt get gag gag ttt gat aat tgg ctg ggt gga ggt tcg_3'(SEQ ID NO:5)。
[0023] 0112模擬表位肽的編碼基因，優(yōu)選為5'-七88〇3七3(^838 31:1：(^8 338 1：(31:七&七 ccg cat ggg ggt gga ggt tcg_3'（SEQ ID N0:6)。
[0024] 上述的T〇Cilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽的編碼基因也在本發(fā)明的保護范圍之 內(nèi)。該編碼基因同樣可以為不同的密碼子組合形成的多條DNA序列中的任意一條。
[0025] 本發(fā)明還提供了含有上述編碼基因的生物材料，所述生物材料為表達載體、轉(zhuǎn)基 因細胞系或宿主囷。
[0026]上述1'〇〇;[1丨21111^13/0112偶聯(lián)模擬表位肽作為抗原在制備誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的藥物中 的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0027] Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽上的Tocilizumab模擬表位肽和CH12模擬表位 肽能同時發(fā)揮其生物學(xué)功能，作為免疫原激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生雙特異性抗體，該抗體能同時 靶向 IL-6R 和 EGFRvIII。
[0028]本發(fā)明還提供了一種多克隆抗體，是由以上所述的Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表 位肽免疫動物制備獲得。所述抗體能夠特異性識別IL-6R和EGFRvII I。
[0029] 本發(fā)明還提供上述多克隆抗體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防和/或治 療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0030] 本發(fā)明還提供上述多克隆抗體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防和/或治 療腫瘤。
[0031] 優(yōu)選地，所述腫瘤為組織細胞淋巴瘤、宮頸癌、肺癌、肝癌或腦膠質(zhì)瘤。
[0032] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0033] 本發(fā)明通過偶聯(lián)兩個不同的模擬表位肽，發(fā)現(xiàn)免疫動物后所得到的多克隆抗體能 靶向兩個疾病特異性的靶點IL-6R和EGFRvIII，并抑制著兩個靶點的信號通路及惡性表型。 由此證明由偶聯(lián)模擬表位肽所引起的主動免疫能同時產(chǎn)生與Toe i 1 izumab (R0ACTEMRA)和 CH12單克隆抗體類似的治療效果，并且特異性高(靶向疾病特異性靶點）、成本低(多肽合成 價格低廉）、安全(多肽合成過程無感染源）、不需要反復(fù)用藥(類似疫苗，只需免疫3-4次)和 副作用小(不涉及種屬異質(zhì)性），因此優(yōu)于單克隆抗體生物治療。
【附圖說明】
[0034] 圖1是運用免疫印跡實驗檢測多克隆抗體是否能結(jié)合受體過表達細胞系或腫瘤細 胞系表達的IL-6R和EGFRvII I電泳結(jié)果。頂部標(biāo)注為Tocilizumab的電泳結(jié)果圖顯示單抗 Tocilizumab與IL-6R結(jié)合情況，頂部標(biāo)注為pur if ied pAb的電泳結(jié)果圖顯示純化的多克隆 抗體與IL-6R結(jié)合情況，頂部標(biāo)注為CH12的電泳結(jié)果圖顯示單抗CH12與EGFR/EGFRvIII結(jié)合 情況，頂部標(biāo)注為purifiedpAb的電泳結(jié)果圖顯示純化的多克隆抗體與EGFR/EGFRvIII結(jié) 合情況。
[0035]圖2是運用免疫印跡實驗檢測多克隆抗體是否能結(jié)合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎患 者滑膜組織表達的IL-6R和EGFRvIII的電泳結(jié)果。其中，頂部標(biāo)注mimo-pAb的電泳圖表示免 疫印跡法檢測T 〇Cilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物產(chǎn)生的多克隆抗體的結(jié)合檢測 結(jié)果；頂部標(biāo)注Tocilizumab的電泳圖表示單抗Tocilizumab的結(jié)合檢測結(jié)果；頂部標(biāo)注 CH12的電泳圖表示單抗單抗CH12的結(jié)合檢測結(jié)果；EGFR相對位置條帶為170KD附近， EGFRvIII相對位置條帶為130KD附近，IL-6R相對位置條帶為72KD及55KD附近，beta-actin 為內(nèi)參蛋白。
[0036] 圖3是運用免疫印跡實驗檢測多克隆抗體是否能結(jié)合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎患 者成纖維滑膜細胞表達的IL-6R和EGFRvII I的電泳結(jié)果。圖中標(biāo)注同圖2。
[0037] 圖4是運用免疫熒光實驗檢測多克隆抗體所引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維滑膜 細胞表達的IL-6R和EGFRvIII內(nèi)化降解結(jié)果照片。圖中，第一排從左到右，依次為①核染色 劑DAP I②IL-6R結(jié)合的對照組多抗③IL-6R④核染色劑DAP I⑤與IL-6R結(jié)合的偶聯(lián)模擬肽組 多抗⑥IL-6R;第二排從左到右，依次為①核染色劑DAPI②與EGFRvIII結(jié)合的對照組多抗③ EGFRvIII④核染色劑DAPI⑤與EGFRvIII結(jié)合的偶聯(lián)模擬肽組多抗⑥EGFRvIII; control pAb表示對照組多抗，mimo-pAb表示本發(fā)明偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物制備的多抗(模擬肽組 多抗），DAPI表示為細胞核染色劑。
[0038] 圖5是運用免疫印跡實驗檢測偶聯(lián)模擬表位肽制備的多克隆抗體對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎患者成纖維滑膜細胞EGF和IL-6信號通路抑制情況的實驗結(jié)果。
[0039] 圖6是運用細胞計數(shù)試劑盒觀察偶聯(lián)模擬表位肽制備的多克隆抗體對于類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎患者成纖維滑膜細胞EGF和IL-6刺激后增殖的影響柱形圖。
【具體實施方式】
[0040] 下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。
[0041 ] Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽制備和鑒定流程基本包括：
[0042] 1、合成Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽；
[0043] 2、T〇Cilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物；
[0044] 3、純化動物血清，得到多克隆抗體；
[0045] 4、運用免疫印跡法檢測純化到的多克隆抗體結(jié)合過表達細胞系和腫瘤細胞系表 達的IL-6R和EGFRv III的能力；
[0046] 5、運用免疫印跡法檢測純化到的多克隆抗體結(jié)合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織表達的 I L_6R 和 EGFRv III 的能力；
[0047] 6、運用免疫印跡法檢測純化到的多克隆抗體結(jié)合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細 胞表達的IL-6R和EGFRv III的能力；
[0048] 7、運用免疫印跡法檢測純化到的多克隆抗體對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細 胞IL-6和EGF信號通路的影響；
[0049] 8、運用細胞計數(shù)試劑盒觀察純化到的多克隆抗體對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑 膜細胞IL-6和EGF引發(fā)增殖的影響。
[0050] 生物材料及試劑來源：
預(yù)染蛋白Marfei· Formentas公司 TEMED Signm 公司 DMSO MPBiO 公習(xí) 牛血清白蛋白(BSA) Sigma公司 PVDF'膜 Milliporc 公司 丙煉· S先胺 Amersham-Pharmacia 公司 十二烷基硫酸鈉 (SDS> Sigma公司 過繞酸銨 _Sigma公司_ 蛋白定:i；試劑盒（BCA法） Thermo Hsher公司 CCK-8細胞增殖檢測試劑盒 Promega公司 Montage ProSep G 抗體純化試 ΜΠΠροιχ、公司 劑盒 p-Aki (Scr473) Cell Signa丨ing Technology 公司 Akl Cell Signa丨ing Technology 公司 p-p44/42 Erk(Thr202/Tyr404) Cell Signaling Technology 公司
[0052] p44/42 Erk Cell Signaling Technology 公司 STAT3 Cell Signa丨ing Technology 公習(xí) p -STAT3(Tyr7〇5) Cell Signaling Technology 公'3] p38 Cell Signaling Technology 公'3] p-p38(lyrI80) Cell Signaling Technology 公司 BCL-XL Cell Signaling Technology 公司 JNK Cell Signaling Techno丨ogy 公司 p-JNK(lyrl80) Cell Signaling Techno丨ogy 公司 EGFR Cell Signaling Technology 公司 β-Actin 中杉金橋生物公司 Norlhcrnlighis546 anli-ral IgG R&D 公司 Tocilizumab (1L-6R 單克隆抗 ROCHE 公司 體） (.?12 (EGFR單克隆抗體） 上海市腫瘤研究:所
[0053] 一、Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物
[0054] (l)Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽的準(zhǔn)備
[0055] 多肽的合成和偶聯(lián)由北京賽百勝（SBS)公司進行，純度>98%。設(shè)置相似長度的多 肽為對照組多肽(對照肽為：
[0056] MTLHSNSTTSPLGGGSGGGS = SGGGSGGGFPNISSSWVHSP，其偶聯(lián)的方法方式同本發(fā)明） 以T〇Cilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽（以下簡稱偶聯(lián)肽)和對照肽作為免疫的抗原，每次免 疫的劑量為200yg蛋白，應(yīng)用的佐劑為完全弗式佐劑（第一次免疫）和不完全弗式佐劑(第 二、三、四次免疫）。
[0057] (2)Wistar大鼠的準(zhǔn)備
[0058] Wistar大鼠由維通利華公司提供，飼養(yǎng)地點為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心，SPF級 Wi star大鼠，8周齡，雌性。大鼠分2組，1組為偶聯(lián)肽組(免疫Toe i 1 i zumab/CHl 2偶聯(lián)模擬表 位肽），1組為對照肽組(免疫對照組多肽）。
[0059] (3)Wistar大鼠的免疫
[0060] Wistar大鼠用皮下注射免疫，在第1、22、43、65天免疫，共4次，每次免疫后7天眼內(nèi) 眥取血。全血4 °C放置24hr后，4000rpm離心15min，取上清，分裝后-20 °C保存。
[0061 ]二、大鼠抗血清的純化
[0062] 大鼠多克隆抗體的純化用Millipore公司的Montage ProSep G抗體純化試劑盒進 行純化。
[0063] (1)大鼠血清用試劑盒提供的Buffer A進行1:1的稀釋，加入純化柱后，500g室溫 離心20min。
[0064] (2)用Buffer A 15ml對純化柱洗滌一次，500g室溫離心20min。
[0065] (3)用Buffer B 10ml洗脫結(jié)合上的多克隆抗體，500g室溫離心20min。
[0066] (4)用Buffer C ΙδΟμΙ中和Buffer B〇
[0067] (5)用去鹽濃縮柱處理多克隆抗體體系，然后用PBS進行稀釋，分裝后_20°C保存。 [0068]三、免疫印跡法(Western Blot)檢測純化后的多克隆抗體與過表達細胞系和腫瘤 細胞系EGFRvIII和IL-6R的結(jié)合能力
[0069] (1)蛋白的抽提
[0070] 分別取一平皿或培養(yǎng)瓶中生長良好的拖1^、1]937、11^1?^、!11111746?1^111、!111117- 幾-61?^431^549和了?-1細胞去除培養(yǎng)液，用適量預(yù)冷的？85洗滌細胞，在培養(yǎng)皿中加入600 μL PBS，用細胞刮刮下細胞，收集到Eppendorf管中，8000rpm離心lmin，棄上清;沉淀加入現(xiàn) 配的細胞裂解液1〇〇μ1，按體積比1:100加入蛋白酶抑制劑，吹打懸浮沉淀，冰上放置30min， 12000rpm離心15min，收集上清，BCA法測蛋白濃度。
[0071] (2)配制PAGE電泳用膠：
[0072]分離膠配方：
[0074] 濃縮腔配方：
[0077]濃縮膠加在分離膠的上方，并插入加樣梳，室溫放置15min。待積層膠凝固以后，即 可拔出加樣梳備用。
[0078] ( 3 )上樣：細胞提取蛋白加入6 X蛋白電泳上樣液混勾，沸水浴處理1 5min。 1 OOOOrpm離心5min，取20yg上樣進行蛋白電泳。
[0079] (4)電泳:恒定電壓進行電泳。首先80V電壓約30min使蛋白樣品至濃縮膠和分離膠 界面后轉(zhuǎn)為120V電壓約1~1.5hr直至蛋白跑至分離膠底部。
[0080] (5)電轉(zhuǎn):恒定電流250mA約2.5hr進行濕式電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至預(yù)先經(jīng)甲醇活化 的PVDF膜上。
[0081 ] (6)封閉：用TBST配制5 %牛血清白蛋白封閉液于室溫條件下封閉lhr，搖床上輕 搖。
[0082] (7)孵育一抗:將多克隆抗體（lOμg/ml)與PVDF膜共同孵育，4°C條件下于搖床上輕 搖過夜。
[0083] (8)漂洗:用TBST漂洗一抗，在搖床上輕搖漂洗，每次15min，共3次。
[0084] (9)孵育二抗:根據(jù)一抗來源選擇二抗，所用濃度為1:10000,室溫下于搖床上輕搖 lhr，二抗均是由中心實驗室提供的熒光抗體。
[0085] (10)漂洗:用TBST漂洗二抗，在搖床上輕搖漂洗，每次15min，共3次。
[0086] (11)掃描:將漂洗完后的PVDF膜平鋪到蛋白印跡掃描儀上，點擊Odyseey軟件，進 行掃描并保存實驗結(jié)果。
[0087]結(jié)果提示偶聯(lián)肽免疫動物產(chǎn)生的多克隆抗體能夠結(jié)合過表達細胞系和腫瘤細胞 系表達的EGFRvIII和IL-6R。參見圖1，頂部標(biāo)注為Tocilizumab的電泳結(jié)果圖顯示單抗 1'〇(^1丨21111^13與11^-61?結(jié)合情況，頂部標(biāo)注為。111^;1^6(1口413的電泳結(jié)果圖顯示上述純化的多 克隆抗體與IL-6R結(jié)合情況，IL-6R相對位置條帶為72KD及55KD附近，黑色條帶顯示結(jié)合，顏 色越深代表結(jié)合濃度越高。圖1中頂部標(biāo)注為CH12的電泳結(jié)果圖顯示單抗CH12與EGFR/ EGFRvIII結(jié)合情況，頂部標(biāo)注為purified pAb的電泳結(jié)果圖顯示上述純化的多克隆抗體與 EGFR/EGFRvII I結(jié)合情況，EGFR相對位置條帶為170KD附近，EGFRvII I相對位置條帶為130KD 附近，黑色條帶顯示結(jié)合，顏色越深代表結(jié)合濃度越高。
[0088] 四、Western Blot檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織EGFRvIII或IL-6R的表達
[0089]滑膜組織蛋白的提取方法基本同細胞總蛋白的提取方法，基本方法為:取-80°C凍 存的RA和0A患者來源的滑膜組織等待至室溫，剪刀剪取一塊約5mm3滑膜組織至EP管中，并 稱重，隨后按質(zhì)量體積比為1:5的比例，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上用小剪 刀充分剪碎組織塊，后用組織勻漿器勻漿，轉(zhuǎn)速4000rpm，共3次，每次30秒，直至成均勻的組 織懸液，整個過程均在冰上操作，隨后用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。Western blot 方法同步驟二.。
[0090]結(jié)果提示偶聯(lián)肽免疫動物產(chǎn)生的多克隆抗體能夠檢測到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜 組織中表達的EGFRv III和IL-6R，參見圖2。
[0091] 五、Western Blot檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞EGFRvIII或IL-6R的表達 [0092]方法同三，所用細胞為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞。
[0093]結(jié)果提示偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物產(chǎn)生的多克隆抗體能夠檢測到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 患者成纖維樣滑膜細胞中表達的EGFRvIII和IL-6R(參見圖3)。
[0094] 六、免疫焚光法（Immunofluorescence)觀察多克隆抗體對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣 滑膜細胞受體內(nèi)化的影響
[0095] (1)將類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞細胞接種到confocal皿中（1.0 X 104)，37 °C 5 % C〇2培養(yǎng)至70 % -90 %。
[0096] (2)用 PBS 洗 3 次，每次 10min。
[0097] (3)細胞用4%多聚甲醛于室溫固定15min。
[0098] (4)用 PBS 洗 3 次，每次 10min。
[0099] (5)用10%羊血清(溶于PBS/pH 7.3)，室溫封閉lhr。
[0100] (6)用 PBST 洗 3 次，每次 10min。
[0101] (7)多克隆抗體(10μg/ml)室溫孵育lhr。
[0102] (8)用 PBST洗3次 XIOmin。
[0103] (9)加 Northernlights546anti-rat IgG抗體（1:100)及DAPI(1:1000)，均稀釋于 PBS，室溫孵育30min。
[0104] (10)用 PBS 洗 3 次，每次 15min。
[0105] (11)用甘油封片。
[0106] (12)用普通熒光顯微鏡觀察，照相。
[0107] 結(jié)果提示多克隆抗體能使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細胞表面的受體發(fā)生 內(nèi)化降解。參見圖4,紅色為結(jié)合的多克隆抗體，綠色為IL-6R或EGFR受體。陰性對照多肽組 的多抗（control-pAb)與IL-6R和EGFR幾乎不結(jié)合(DAPI:用于細胞核染色；control-pAb紅 光微弱;EGFRvIII和IL-6R綠色熒光強），偶聯(lián)肽多抗組，顯示多抗的結(jié)合率非常高(mimo-pAb紅色熒光強;EGFRvIII和IL-6R綠色熒光弱，顯示受體發(fā)生內(nèi)化降解）。
[0108] 七、Western Blot檢測多克隆抗體對IL-6和EGF刺激引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成 纖維樣滑膜細胞信號通路的影響
[0109] (1)取一平皿生長良好的RA-FLS細胞，傳代至9個6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)細胞至長滿整個 平皿。
[0110] (2)傾去含血清的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基饑餓48hr。
[0111] (3)傾去無血清的培養(yǎng)基，加入陽性對照組:Tocilizumab和CH12(10μg/ml)，多克 隆抗體(分為5個濃度梯度：10μg/ml、lμg/ml、0. lμg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml)，37°C孵育 3hr〇
[0112] (4)3hr 后加入 EGF+IL-6(100ng/ml)。細胞因子刺激 30min。
[0113] (5)適量預(yù)冷的roS洗滌細胞，在培養(yǎng)皿中加入600μ1 roS，用細胞刮刮下細胞，收 集到Eppendorf管中，8000rpm離心lmin，棄上清;沉淀加入現(xiàn)配的細胞裂解液100μΙ，按體積 比1:100加入蛋白酶抑制劑，吹打懸浮沉淀，冰上放置30min; 12000rpm離心15min，收集上 清，BCA法測蛋白濃度。細胞提取蛋白加入6 X蛋白電泳上樣液混勻，沸水浴處理15min。 1 OOOOrpm離心5min，取30yg上樣進行蛋白電泳。
[0114] (6)孵育一抗:按1:1000濃度稀釋信號通路相關(guān)抗體并與PVDF膜共同孵育，4 °C條 件下于搖床上輕搖過夜。
[0115] (7)漂洗:用TBST漂洗一抗，在搖床上輕搖漂洗，每次15min，共3次。
[0116] (8)孵育二抗:根據(jù)一抗來源選擇二抗，所用濃度為1:10000,室溫下于搖床上輕搖 lhr，二抗均是由中心實驗室提供的熒光抗體。
[0117] (9)漂洗:用TBST漂洗二抗，在搖床上輕搖漂洗，每次15min，共3次。
[0118] (1〇)掃描:將漂洗完后的PVDF膜平鋪到蛋白印跡掃描儀上，點擊Odyssey軟件，進 行掃描并保存實驗結(jié)果。
[0119]結(jié)果參見圖5,信號通路蛋白及大小在左方顯示，上方為加入的細胞因子及抗體注 釋。第1列不加任何細胞因子或抗體;第2列加入100ng/ml的EGF和IL-6;第3列加入100ng/ml 的EGF和IL-6,以及 10μg/ml的Tocilizumab單抗;第4列，加入 100ng/ml的EGF和IL-6,以及10 μg/ml的CH12單抗;第5~9列，加入100ng/ml的EGF和IL-6，以及分別對應(yīng)10~0.001μg/ml濃 度的多克隆抗體。提示Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物產(chǎn)生的多克隆抗體能夠 抑制IL-6和EGF引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細胞信號通路的活化。
[0120]八、CCK-8法檢測多克隆抗體對IL-6和EGF引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜 細胞增殖的影響
[0121 ]取生長狀態(tài)良好的RA-FLS細胞接種于96孔板。每孔接種細胞數(shù)為5.0 X 103，每個 處理組設(shè)5個復(fù)孔，分組為：
[0122] 無血清組:為DMEM培養(yǎng)基（陰性對照）；
[0123] 血清陽性組:為DMEM培養(yǎng)基加10%FBS血清（陽性對照）；
[0124] IL-6 組：只加 IL-6(濃度為 100ng/ml);
[0125] EGF組：只加 EGF(濃度為 100ng/ml)
[0126] IL-6+EGF 組：加入 IL-6 和 EGF(濃度為 100ng/ml)
[0127] IL-6+EGF+CH12 組：加入 IL-6、EGF 和 CH12 單抗（IL-6 和 EGF 的濃度為 100ng/ml，CH12 單抗的濃度為l〇μg/ml)
[0128] IL-6+EGF+Tocilizumab 組：加入 IL-6、EGF 和 Tocilizumab 單抗（IL-6 和 EGF 的濃度 為100ng/ml，Tocilizumab單抗的濃度為10μg/ml)
[0129] IL-6+EGF+多克隆抗體(5個濃度)組:加入IL-6、EGF和多克隆抗體（IL-6和EGF的濃 度為 100ng/ml，多克隆抗體的濃度為 10μg/ml、lμg/ml、0 · lμg/ml、0 · 01μg/ml、0 · 001μg/ml)。
[0130] 不同處理條件作用于RA-FLS細胞72hr后棄培養(yǎng)基，每孔用無血清的培養(yǎng)基洗滌一 次，后每孔加入DMEM培養(yǎng)基100μΙ，每孔再加入20μ1 CCK8細胞增殖檢測液，于5 %C02的37°C 細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2hr，最終用酶標(biāo)儀測定490nm波長的吸光度值，比色以空白細胞孔調(diào) 零。
[0131] 按下列公式計算細胞百分活率(Percentage of cell viability):
[0132] 細胞存活率％ = (平Aiffi麵疽）X 100%。
[0133] 結(jié)果參見圖6,縱坐標(biāo)為吸光度值，代表細胞增殖的系數(shù)，橫坐標(biāo)為組別。從左至右 依次為無血清組、血清陽性組、IL-6組、EGF組、IL-6+EGF組、IL-6+EGF+CH12組、IL-6+EGF+ Tocilizumab組、IL-6+EGF+多克隆抗體(5個濃度)組。結(jié)果提示偶聯(lián)模擬表位肽免疫動物產(chǎn) 生的多克隆抗體能夠抑制IL-6和EGF引起的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者成纖維樣滑膜細胞的增殖。
[0134] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1 .Tocilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示， 由SEQ ID N0:2所示的Tocilizumab模擬表位肽的C端與SEQ ID N0:3所示的CH12模擬表位 肽的C端通過SEQ ID NO:4所示的連接肽連接而成;其中， Toe i 1 i zumab 模擬表位肽:N 基端-C 末端 KTMSAEEFDNWL; CH12偶聯(lián)模擬表位肽:N基端-C末端WHTEILKSYPHE; 連接肽:N基端-C末端GGGSGGS = SGGGSGGG，其中"="表示二硫鍵。2. -組功能性基因序列，轉(zhuǎn)錄后翻譯獲得的多肽可以用于構(gòu)成權(quán)利要求1所述的 Tocilizumab/CHl 2偶聯(lián)模擬表位肽，其特征在于，包括Tocilizumab模擬表位肽的編碼基 因，CH12偶聯(lián)模擬表位肽的編碼基因，以及連接肽的編碼基因。3. 權(quán)利要求1所述的T〇Cilizumab/CH12偶聯(lián)模擬表位肽的編碼基因。4. 含有權(quán)利要求3所述的編碼基因的生物材料，所述生物材料為表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞 系或宿主囷。5. 權(quán)利要求1所述的Tocilizumab/CHl 2偶聯(lián)模擬表位肽作為抗原在制備誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生 的藥物中的應(yīng)用。6. -種多克隆抗體，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的Tocil izumab/CH12偶聯(lián)模擬表位 肽免疫動物制備獲得。7. 權(quán)利要求6所述的多克隆抗體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防和/或治療類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。8. 權(quán)利要求6所述的多克隆抗體在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于預(yù)防和/或治療腫 瘤。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為組織細胞淋巴瘤、宮頸癌、肺 癌、肝癌或腦膠質(zhì)瘤。
【文檔編號】A61K39/395GK106046174SQ201610431258
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】楊麟
【申請人】楊麟