一種促紅細(xì)胞生成素模擬肽以及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種促紅細(xì)胞生成素模擬膚，具體地說，本發(fā)明設(shè) 及一種能夠和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活促紅細(xì)胞生成素受體或者能起促紅細(xì)胞生 成素激動作用的促紅細(xì)胞生成素模擬膚及其制備方法，本發(fā)明還設(shè)及所述模擬膚在制備治 療W缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 促紅細(xì)胞生成素（&ryt虹opoietin，EP0)是一種糖蛋白激素，分子量約34kD。血 漿中存在的促紅細(xì)胞生成素由165個(gè)氨基酸組成，糖基化程度很高，糖的成分主要是唾液 酸。根據(jù)碳水化合物含量不同，天然存在的促紅細(xì)胞生成素分為兩種類型即α型和0 型，其中，α型含34%的碳水化合物，β型含26%的碳水化合物。兩種類型在生物學(xué)特 性、抗原性及臨床應(yīng)用效果上均相同。人類促紅細(xì)胞生成素基因位于7號染色體長22區(qū)。 1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重組技術(shù)開始大批量生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生成 素（recombinanthumaner}ftbopoietin,rH證P0)，廣泛用于臨床。應(yīng)用重組DNA技術(shù)已 經(jīng)生物合成出促紅細(xì)胞生成素巧grie，JC，Strickland,TW，Lane,J等（986)免疫生物學(xué) (Immunobiol)72:213-224)，其是插入到中國倉鼠的卵巢組織細(xì)胞（CH0細(xì)胞）中并且表達(dá) 的克隆的人促紅細(xì)胞生成素基因的產(chǎn)物。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素首先翻譯成含有 166個(gè)氨基酸并且166位是精氨酸的多膚鏈。在翻譯后修飾中，用徑膚酶裂解掉166位精氨 酸。沒有糖基的人邸0的多膚鏈的分子量是1823抓曰，在完整的促紅細(xì)胞生成素分子中，糖 基占整個(gè)分子量的大約40% (J.Biol.Chem. 262:12059)。
[0003] 促紅細(xì)胞生成素是最早應(yīng)用于臨床的細(xì)胞因子，是迄今所知作用最單一、且安全 可靠的升血紅蛋白制劑。對于腎貧血、再生障礙性貧血、多發(fā)性骨髓瘤及陣發(fā)性夜間血尿等 均有一定療效；此外，應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素還可減少手術(shù)中的輸血量，并能在一定程度上糾 正由惡性腫瘤、化療及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的貧血。由于促紅細(xì)胞生成素主要由腎小管內(nèi) 皮細(xì)胞產(chǎn)生，腎性疾患引起的貧血是促紅細(xì)胞生成素的首選適應(yīng)證；促紅細(xì)胞生成素糾正 腎性貧血的療效幾乎100%，但并不能改善腎功能。促紅細(xì)胞生成素的治療安全、有效，適合 長期治療，也能避免血源緊張。在2006年的全球生物技術(shù)藥市場上，促紅細(xì)胞生成素類的 重組藥物占了 119億美元，有巨大的市場容量。
[0004] 早在1989年，美國抑A就正式批準(zhǔn)重組人促紅素巧P0GEN)用于腎性貧血的治療， 但直到1992年才在我國上市。我國慢性腎炎的年發(fā)病率約為0. 25%，其中相當(dāng)一部分患者 最終會轉(zhuǎn)為腎衰，每年的腎性貧血患者約50-60萬。根據(jù)保守的用藥量估算，如果按當(dāng)前的 價(jià)格30-40元/支，加上癌癥相關(guān)性貧血等其他病人的用藥，國內(nèi)市場容量約12-16億元甚 至更大（病人平均體重按50Kg計(jì)算）。自20世紀(jì)90年代后期，促紅細(xì)胞生成素已進(jìn)入我 國重點(diǎn)城市醫(yī)院楊銷藥品行列，2003年在全國重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院用藥金額6213萬元，排名 第56位。2004年，全國重點(diǎn)城市樣本醫(yī)院購藥金額增長到8049萬元，同比增長了 30%。 陽〇化]促紅細(xì)胞生成素作為一種作用于骨髓造血細(xì)胞，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生、分化，最終 成熟的內(nèi)分泌激素，對機(jī)體供氧狀況發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在胚胎早期，促紅細(xì)胞生成素由 肝生成，然后逐漸向腎轉(zhuǎn)移，出生后主要由腎小管間質(zhì)細(xì)胞分泌。
[0006] 在促紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)紅祖細(xì)胞分化過程中，球蛋白被誘導(dǎo)，運(yùn)能使細(xì)胞吸收更 多的鐵合成功能性的血紅蛋白，運(yùn)種功能性的血紅蛋白可W和成熟的紅血球中的氧結(jié)合， 因此，紅血球和血紅蛋白在提供機(jī)體氧方面扮演了極其重要的角色。運(yùn)一過程是由促紅細(xì) 胞生成素與紅祖細(xì)胞的表面受體之間的相互作用引起的。
[0007] 當(dāng)人體處于健康狀態(tài)時(shí)，組織可W從已經(jīng)存在的紅血球中吸收足夠多的氧，此時(shí) 體內(nèi)的促紅細(xì)胞生成素濃度很低，運(yùn)種正常的較低的促紅細(xì)胞生成素濃度完全可W剌激促 進(jìn)由于年齡的問題而正常損失的紅細(xì)胞。當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中的依靠紅細(xì)胞進(jìn)行氧輸送的水平被 降低進(jìn)而出現(xiàn)缺氧情況時(shí)，促紅細(xì)胞生成素在體內(nèi)的數(shù)量將會增加，機(jī)體缺氧狀態(tài)可W由 W下原因引起的：過量的福射、因高締度或長期昏迷造成的氧攝入量減少、各種類型的貧血 等等。作為對組織處于缺氧壓力的應(yīng)答，促紅細(xì)胞生成素水平的提高可W刺激紅祖細(xì)胞的 分化達(dá)到提高紅細(xì)胞生成的能力。當(dāng)體內(nèi)的紅細(xì)胞的數(shù)量大于正常組織的需求時(shí)，循環(huán)系 統(tǒng)中促紅細(xì)胞生成素的水平被降低。正是由于促紅細(xì)胞生成素對于紅細(xì)胞的生成有著至關(guān) 重要的作用，因此運(yùn)類激素對于治療和診斷W紅細(xì)胞生成低下和缺陷為特征的血液病方面 有著很廣泛的前景。最近的研究為推測促紅細(xì)胞生成素療法在多種疾病、素亂和血液學(xué)異 常情況中的效用提供了基礎(chǔ)，運(yùn)些疾病包括：慢性腎衰竭（CR巧患者貧血癥的治療中使用 促紅細(xì)胞生成素和在艾滋病和接受化療的癌癥患者貧血癥的治療中使用促紅細(xì)胞生成素 值anna,RP，Ru化ick，SA，Abels,RI，于：MB，Garnick編著，臨床應(yīng)用中的促紅細(xì)胞生成素一 國際展望巧rythropoietininClinicalApplications-AnInternationalPerspective. MarcelDekker; 1990:p301_324)。
[0008] 促紅細(xì)胞生成素的部分生物學(xué)效應(yīng)可W通過和細(xì)胞膜表面的受體內(nèi)在作用來 調(diào)節(jié)。起先，使用從小鼠的脾臟里分離出的未成熟的紅細(xì)胞來研究細(xì)胞表面結(jié)合的促 紅細(xì)胞生成素蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)種蛋白是由兩種多聚膚組成，其分子量大約為85000~ 100000?。⊿awyer, et al.(1987)Proc.化tl. Acad. Sci. USA84:3690-3694)由比較詳細(xì)的 敘述。促紅細(xì)胞生成素的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目也被計(jì)算出來了，大約每個(gè)細(xì)胞膜含有800~ 1000個(gè)位點(diǎn)。在運(yùn)些結(jié)合位點(diǎn)中大約有300個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的Kd水平為90pM，而剩下的結(jié)合 位點(diǎn)的結(jié)合力比較弱，大約有57化M。有研究表明從感染了化iend病毒貧血株的小鼠的脾 臟紅細(xì)胞對EP0的響應(yīng)情況發(fā)現(xiàn)，大約有400個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其中Kd水平高的為10化M，Kd水 平低的為8(K)pM。
[0009] 隨后的工作就是兩種促紅細(xì)胞生成素受體被單個(gè)基因翻錄，運(yùn)個(gè)基因已經(jīng)被克 隆。例如，小鼠和人的促紅細(xì)胞生成素受體的DNA序列W及編碼膚的序列在W090/08822中 已經(jīng)有敘述。目前的模型表明促紅細(xì)胞生成素結(jié)合到促紅細(xì)胞生成素受體導(dǎo)致了兩個(gè)促紅 細(xì)胞生成素受體的活化和二聚，運(yùn)種二聚進(jìn)一步導(dǎo)致了信號傳導(dǎo)的開始。
[0010] 促紅細(xì)胞生成素克隆基因的應(yīng)用更有助于幫助尋找運(yùn)些重要受體的激動劑和括 抗劑。某種程度上能夠作用促紅細(xì)胞生成素受體的膚已經(jīng)被確定和敘述。特別是確定了一 組含有主要膚段的膚，運(yùn)些膚可W和促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并能剌激促紅細(xì)胞生成素細(xì) 胞的分化增殖。但是能夠刺激紅細(xì)胞增殖分化的膚的EC50卻很低，在20nM和250nM之間， 因此運(yùn)些膚在臨床應(yīng)用上受到了較大的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種生物活性更好、生物利用度更高的 促紅細(xì)胞生成素模擬膚或其可藥用鹽W及它們的制備方法。
[0012] 一方面，本發(fā)明的目的是提供一種具有長效促紅細(xì)胞生成功能的促紅細(xì)胞生成素 模擬膚或其可藥用鹽。
[0013] 另一方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素模擬膚的制備方法W及其在用 于制備治療W缺乏紅細(xì)胞生成素或紅細(xì)胞群缺少或缺陷為特征的疾病的藥物中的用途。
[0014] 本發(fā)明的又一方面還提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明的促紅細(xì)胞 生成素模擬膚。
[0015] 優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物為注射劑；更優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物為凍干粉針或 溶液注射劑。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的輔料成分。
[0017] 本發(fā)明提供了一種具有體內(nèi)生物活性的促紅細(xì)胞生成素模擬膚或其可藥用鹽。
[0018] 所述促紅細(xì)胞生成素模擬膚是由通式中的賴氨酸（K)通過側(cè)鏈游離氨基與烷基 酸的簇基縮合而成的，通式如下式I所示；
[0019] GGLYACHMGP口化IVCQPLRSarK-X
[0020] 式I 陽02U 其中， 陽02引化1為3-(1-糞基）A-丙氨酸，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0023]
[0024] Sar為肌氨酸，其結(jié)構(gòu)式如下： 陽0巧]
[00%] 兩個(gè)半脫氨酸形成二硫鍵，N末端乙酷化，X表示不同長度的氨基酸，如十二燒酸、 十六燒酸等。
[0027] 本發(fā)明還提供了所述促紅細(xì)胞生成素模擬膚的制備方法，所述方法包括W下步 驟：
[0028] 1)根據(jù)沈QIDNO: 1選擇氨基酸；
[0029] 2)采用DDE保護(hù)賴氨酸，使用Fmoc固相多膚合成法合成模擬膚單體；
[0030] 3)采用孤E專用脫保護(hù)劑脫去賴氨酸的孤E基團(tuán)；
[0031] 4)利用賴氨酸側(cè)鏈上游離的氨基與燒酸偶聯(lián)。
[0032] 其中，所述的Fmoc固相多膚合成方法是指W聚合物樹脂作為固相反應(yīng)基質(zhì)，將氨 基端Fmoc保護(hù)的氨基酸在偶聯(lián)