聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體的制備及用途，屬于生物技術(shù)及藥物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]血小板減少癥是臨床上常遇到的疾病，常見于腫瘤放療、化療和骨髓移植患者，也見于特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、肝炎誘發(fā)的血小板減少綜合征、骨髓增生異常綜合征(MDS)及慢性肝病。血小板減少癥是一種常見的血液病，腫瘤患者接受化療和放療后，骨髓受到不同程度的抑制，造成貧血、粒細(xì)胞減少和血小板減少。臨床上已有重組的長效和短效EPO和G-CSF治療貧血和粒細(xì)胞減少癥，短效的重組IL-1l和TPO用于放化療后血小板減少癥，長效的Nplate用于特發(fā)性血小板減少紫癜的治療。
[0003]血小板生成素(Thrombopoietin, ΤΡ0)是調(diào)節(jié)血小板生成最主要的細(xì)胞因子，它能專一的促進(jìn)巨核細(xì)胞的生長發(fā)育和血小板的生成。人內(nèi)源性TPO由332個(gè)氨基酸組成，N端為其受體結(jié)合位點(diǎn)，C端為高度糖基化部分(Bartley etal.,CelI 77:1117-1124(1994) ; Chang et al., Journal of B1logical Chemistry270:511-514(1995) )。TPO主要在肝臟、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及腎臟合成，通過與其受體c-Mpl結(jié)合，激活信號通路，促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化從而介導(dǎo)血小板生成(Blood 82:1395-1401，1993 ；Blood 87:2162-2170，1996)。
[0004]血小板生成素模擬肽(Thrombopoietin Mimetic Peptide, TMP)是與TPO具有相似功能但不具同源結(jié)構(gòu)的多肽物質(zhì)，由Cwirla等從絲狀噬菌體展示肽庫中篩選到高活性的TPO模擬肽(AF12505)。該血小板生成素模擬肽為線性肽，其氨基酸組成為Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala,具有刺激 TPO 依賴性細(xì)胞株 Ba/ F3_mpl的增殖功能，EC50為400nmol/L (Science 276:1696-1699，1997)。但該結(jié)構(gòu)的活性肽體內(nèi)生物學(xué)活性偏低，半衰期極短，難以滿足作為一種治療性藥物的臨床應(yīng)用的需要。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TMP不會像重組TPO —樣，在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生與人TPO交叉反應(yīng)的中和抗體(NatureB1technology 15:1261-1265，1997)，提示具有優(yōu)于TPO的臨床應(yīng)用前景。
[0005]為克服TMP多肽在體內(nèi)半衰期過短的缺陷，Amgen公司設(shè)計(jì)并開發(fā)成功了重組TMP-FC融合蛋白，用于臨床治療脾切除和脾未切除慢性免疫性血小板減少性紫癜(ITP);具有一周皮下給藥一次的長效作用，于2008年8月獲得美國FDA批準(zhǔn)上市，商品名Nplate。Nplate包含2個(gè)相同的單鏈亞單元，每個(gè)單鏈包含IgG Fe恒定區(qū)域和TPO模擬肽，C末端由二硫鍵鏈接而成，其中TPO模擬肽包含2個(gè)串聯(lián)的TMP多肽序列，F(xiàn)e區(qū)域?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)長效功能(CN 1810832A)。
[0006]本發(fā)明提供了一種衍生于TPO模擬肽AF12505的血小板生成素模擬肽的二聚體，該二聚體通過含氨基末端為半胱氨酸的巰基與雙活化的聚乙二醇分子共價(jià)偶聯(lián)成同源四聚體偶聯(lián)物。
[0007]本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體偶聯(lián)物實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)血液半衰期的極大延長，在實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)單次注射給藥后顯著促進(jìn)外周血血小板數(shù)量增加的功效，可作為一種新型的長效治療血小板減少癥的藥物或者藥物組合物。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種具有長效作用的血小板生成素模擬肽的同源四聚體，以及實(shí)現(xiàn)該同源四聚體的制備方法，用于作為治療血小板減少癥的藥物。
[0010]本發(fā)明中血小板生成素模擬肽二聚體(代號NPC)的氨基酸序列衍生于TPO模擬肽AF12505，具有以下特征:
NH2-Cys-(Gly)n-1le-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala- (Gly)m-1Ie-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala-COOH
其中η和m為5-10的整數(shù)，(Gly) η優(yōu)選為5，即GlyGlyGlyGlyGly ; (Gly)m優(yōu)選為8，即 GlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyo
[0011]此外技術(shù)人員可按本領(lǐng)域常規(guī)方法設(shè)計(jì)(Gly) η和(Gly)m為5_10個(gè)Gly的序列，而不影響本專利的實(shí)現(xiàn)。
[0012]本發(fā)明提供的血小板生成素模擬肽二聚體序列SEQ ID NO:1的顯著特征是N端氨基酸殘基是半胱氨酸。
[0013]本發(fā)明的另一目的是提供制備血小板生成素模擬肽同源四聚體的制備方法和實(shí)施過程。通過血小板生成素模擬肽二聚體氨基末端半胱氨酸的游離巰基(或稱硫代基團(tuán))在一定反應(yīng)條件下形成二硫鍵而成。
[0014]本發(fā)明實(shí)施的另一方案是通過雙活化的聚乙二醇分子作為偶聯(lián)物，與血小板生成素模擬肽二聚體氨基末端半胱氨酸的游離巰基在一定反應(yīng)條件下形成共價(jià)的聚乙二醇偶聯(lián)同源四聚體，具有以下特征:
雙活化的聚乙二醇分子(PEG)是一類不含有甲氧基或者羥基、雙端均被相同基團(tuán)活化、可與硫代基團(tuán)發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)的聚乙二醇。包括雙活化的馬來酰亞胺聚乙二醇，特征為mal-PEG-mal ;或包括雙活化的巰基聚乙二醇，特征為SH-PEG-SH;或包括雙活化的鄰二硫吡啶聚乙二醇，特征為0PSS-PEG-0PSS ;或包括雙活化的乙烯基砜聚乙二醇，特征為VS-PEG-VS0
[0015]用于本發(fā)明中血小板生成素模擬肽類似物同源二聚體的聚乙二醇分子可是小分子或是大分子，分子量范圍從5,000-40,000道爾頓。通過分子量大于5，000的聚乙二醇分子作為二聚體偶聯(lián)物可實(shí)現(xiàn)將血小板生成素模擬肽類似物二聚體在體內(nèi)半衰期的顯著延長。優(yōu)選的聚乙二醇分子大小是20，000-40，000道爾頓之間。
[0016]本發(fā)明的另一目的是提供了用于制備血小板生成素模擬肽二聚體的化學(xué)固相合成或者重組DNA技術(shù)的方法。重組DNA技術(shù)指應(yīng)用表達(dá)載體插入編碼血小板生成素模擬肽二聚體的cDNA基因片段后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。再經(jīng)發(fā)酵或培養(yǎng)、純化制備相應(yīng)重組多肽的技術(shù)過程。
[0017]本發(fā)明的另一目的，提供了分離和制備血小板生成素模擬肽類似物同源二聚體的方法，包括總所周知的離子交換色譜、親和色譜、疏水層析以及反向?qū)游錾V、分子排阻色譜和超濾等技術(shù)手段。
[0018]本發(fā)明的另一目的，提供了聚乙二醇化血小板生成素模擬肽同源四聚體的升高外周血血小板作用，可作為治療血小板減少癥的藥物或藥物組合物。
[0019]作為一種藥物組合物，它包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效劑量的本發(fā)明所述的同源四聚體多肽聚乙二醇偶聯(lián)物。
[0020]本發(fā)明中所用的“同源四聚體”，是指通過共價(jià)結(jié)合鍵將氨基酸序列和組成完全相同的血小板生成素模擬肽二聚體在氨基末端共價(jià)結(jié)合而形成的四聚體。
[0021]本發(fā)明中所用的“聚乙二醇偶聯(lián)”是指由不同大小分子量的聚乙二醇在兩端分別與一個(gè)血小板生成素模擬肽二聚體的氨基末端共價(jià)而生成的聚乙二醇化同源四聚體。
[0022]本發(fā)明中所用“表達(dá)載體”，是指含有表達(dá)啟動子包括T7、Tac、Trp、Iac的大腸桿菌表達(dá)載體，或含有ct分泌因子以及AOX或GAP表達(dá)啟動子的酵母表達(dá)載體。
[0023]至此已對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，通過參考下列實(shí)例，能夠?qū)Ρ景l(fā)明有更清晰的理解。
[0024]說明書【附圖說明】:
附圖1 NPC-PEG35k-NPC的SDS-PAGE電泳和RP-HPLC分析圖譜。圖A為SDS-PAGE電泳圖，其中泳道I為蛋白Marker，泳道2為NPC-PEG35k-NPC，PEG偶聯(lián)物因遷移率變慢而比理論值偏大；圖B為RP-HPLC分析圖譜。
附圖2 pMAL-C2X-Nplate質(zhì)粒構(gòu)建不意圖。
[0025]附圖3 NPC、NPC-PEG35k-NPC和NPC-PEG4qk組在正常小鼠體內(nèi)的促進(jìn)外周血血小板增加的作用。
[0026]附圖4 NPC-PEG20k-NPC,Nplate和NPC_PEG35K_NPC在卡鉬誘導(dǎo)的血小板減少癥小鼠體內(nèi)的促進(jìn)外周血血小板增加作用。
[0027]附圖5 NPC-PEG20k-NPC,Nplate和NPC_PEG35K_NPC在ITP模型小鼠體內(nèi)的促進(jìn)外周血血小板增加作用。
[0028]附圖6 NPC-PEG35k-NPC比格犬皮下給藥藥代動力學(xué)試驗(yàn)。
[0029]下述實(shí)例僅為說明目的而并不旨在對本發(fā)明的限制。
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)例1、血小板生成素模擬肽二聚體的化學(xué)固相合成 NPC多肽氨基酸序列如下:
SEQ ID NO:1 (NPC):
Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-1le-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-1le-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-