一種特異檢測水楊酸(sa)的融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種特異檢測水楊酸(SA)的融合蛋白，其中，該融合蛋白包括NPR1基因中的泛素?26s蛋白酶體降解元件區(qū)域DNA序列所編碼的蛋白和熒光蛋白，其中，該融合蛋白能夠特異地被SA誘導降解。所述的融合蛋白，其中，該融合蛋白為NPR1的泛素?26s蛋白酶體降解元件的基因和熒光蛋白基因所編碼或所表達。利用該融合蛋白，可以檢測植物體內的SA。
【專利說明】
一種特異檢測水楊酸(SA)的融合蛋白
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域中一種用于反映活體植物內的水楊酸水平及其變化的 融合蛋白和表達該融合蛋白的載體。
【背景技術】
[0002] 水楊酸(salicylic acid,SA)是植物體內普遍存在的一種簡單的小分子酸類化合 物，化學名稱為"鄰羥基苯甲酸"，是肉桂酸的衍生物。SA最早發(fā)現(xiàn)于柳樹的葉和樹皮中， 1838年Raffaele Piria將這種有效組分命名為水楊酸。鑒于SA由植物自身合成，含量較低， 于韌皮部運輸，且在植物生熱、開花、側芽萌發(fā)、性別分化等生長發(fā)育過程中起著重要的調 節(jié)作用，被確認為一種植物激素。
[0003] SA在植物體內的存在形式主要有游離態(tài)和結合態(tài)兩種形式，結合態(tài)SA是游離SA與 葡萄糖結合形成無活性的水楊酸-2-0-β-葡萄苷(SAG)，存在于細胞內部，能防止大量游離 SA對植物細胞可能產生的毒害作用。特定情況下，SAG能釋放到細胞間隙，轉化為游離SA，游 離SA進入細胞，誘導防衛(wèi)反應的發(fā)生。
[0004]陸續(xù)的研究表明，SA不僅可以調節(jié)植物的某些生長發(fā)育過程，還是激活植物過敏 反應（hypersensitive response，HR)和系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired reSistanCe，SAR)的重要內源信號分子，與植物抗鹽性、抗旱性、抗熱性和重金屬脅迫等有 相關。此外，SA在農業(yè)上常用于保鮮花卉、延緩果實成熟而提高好果率。SA與植物抗脅迫的 關系一直是研究的熱點，目前已經明確SA可作為植物抗病反應所需的信號分子來激活植物 防御保護機制，在植物信號傳導和抗逆反應中起著關鍵作用。
[0005] 目前，國內報道測定SA的方法有紫外分光光度法、離子色譜法、色譜-質譜連用法， 主要對于廢水、食品、醫(yī)藥中SA的含量進行測定，鮮有對植物樣品的提取測定。國外文獻主 要采用高效液相色譜法(HPLC)對植物樣品中的SA水平進行分析，測定受HPLC流動相、檢測 器等諸多因素的影響，更重要的是無法對活體植物內的SA進行實時監(jiān)測。
[0006] 實時監(jiān)測活體植物中水楊酸的水平是深入研究其作用和抗病機理的必要前提。

【發(fā)明內容】

[0007] 為了解決上述的技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種實時反映植物體內水楊酸水 平的方法及其專用檢測植物體內SA的融合蛋白以及表達載體。
[0008] 一方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，該蛋白包括NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解元 件的基因所編碼的蛋白和熒光蛋白基因所編碼的蛋白?；蛘咴撊诤系鞍诪镹PR1的泛素-26s 蛋白酶體降解元件的基因和熒光蛋白基因所編碼，所表達。該融合蛋白可以專一，特異地被 SA降解，相反，SA不會單獨降解熒光蛋白基因所編碼的蛋白或者NPR1的泛素-26s蛋白酶體 降解元件所編碼的蛋白，即NPR1的泛素基因所編碼的蛋白或者熒光蛋白基因所編碼的蛋白 均不會受SA誘導降解。
[0009] 在一些優(yōu)選的方式中，該融合蛋白是通過質粒載體轉入到表達載體來表達的。優(yōu) 選的，所述的質粒載體的結構從左到右順次包括:T-DNA右邊界元件序列-35S啟動子元件序 列-第一酶切位點-目的基因序列-第二酶切位點-第一接頭序列-熒光序列-第二接頭序列-細胞核定位蛋白（NLS)序列-終止子序列-35S啟動子序列-T-DNA左邊界序列。
[0010] 另一方面，本發(fā)明一種質粒載體，其中，通過把該質粒載體接種到植物體中，實時 檢測植物體中SA水平，其中，所述的質粒載體從右到左包括如下結構:T-DNA右邊界元件序 列-35S啟動子元件序列-第一酶切位點-目的基因序列-第二酶切位點-第一接頭序列-熒光 序列-第二接頭序列-細胞核定位蛋白（NLS)序列-終止子序列-35S啟動子序列-T-DNA左邊 界序列。
[0011] 再一方面，本發(fā)明提供的檢測植物體內水楊酸水平的方法，將含有來源于番茄的 SA響應蛋白NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解元件的基因片段構建到入的植物表達載體中，形 成可以表達SA誘導降解的Venus YFP融合蛋白的載體，重組載體轉入表達載體中（例如農桿 菌）；將該農桿菌浸潤植物;48小時候采用熒光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白對SA的反應介導 融合蛋白表達，通過熒光共聚焦顯微鏡可以檢測植物水楊酸的水平。所述的植物表達載體 從右到左包括如下結構:T-DNA右邊界元件序列-35S啟動子元件序列-第一酶切位點-目的 基因序列-第二酶切位點-第一接頭序列-熒光序列-第二接頭序列-細胞核定位蛋白（NLS) 序列-終止子序列-35S啟動子序列-T-DNA左邊界序列。
[0012] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，所述的T-DNA左邊界元件序列為Seq ID No:7所示。
[0013] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，所述的T-DNA右邊界元件序列為Seq ID No:8所示。
[0014] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，所述的35S啟動子元件序列為Seq ID No:9所示。
[0015] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，所述的第一接頭序列為Seq ID No: 10所示·
[0016] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，熒光蛋白序列為Seq ID No: 11所 不。
[0017] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，第二接頭序列為Seq ID No :12所 不。
[0018] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，細胞核定位蛋白（NLS)序列為Seq ID No: 13所示。
[0019] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，Bar序列為Seq ID No: 14所示。
[0020] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，終止子序列為Seq ID No: 15所示。
[0021] 在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，所述的第一酶切位點為Age頂每切位 點;第二酶切位點為Spe頂每切位點。
[0022]在上述所有實施方式中的一些優(yōu)選的方式中，NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解元件 的基因為Seq ID No:5所示。所述NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解元件的氨基酸序列Seq ID No: 6所示。
[0023]本發(fā)明提供制備檢測植物體內水楊酸水平的表達載體的構建方法，該方法包括如 下步驟：
[0024] 1)、從番茄中獲得NPR1降解元件的編碼基因序列，以番茄cDNA為模板，以引物對IK 8沖1/1〇-1?1所述的引物對進行？0財廣增，11^沖1/11^-1?1為569 10如：1，569 10如：2所 示;擴增的PCR產物純化后經測序獲得全序列，長度120bp(Seq ID N〇:5)。
[0025] 2)、步驟1中獲得的NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件的編碼基因為模板，以引物對 IKB-F2/IKB-R2擴增；引物對IKB-F2(帶有Agel酶切位點NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件 5 ' -端擴增正向引物/IKB-F1 (帶有Spel酶切位點NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件3 ' -端擴 增反向引物)為Seq ID No:3，Seq ID No:3所示；
[0026] 3)、采用Spel和Agel將步驟2中純化的擴增目的片段進行酶切，并與經Spel和Agel 雙酶切的pjp743載體進行連接，連接的系統(tǒng)和步驟如下:采用10yL體系反應，其中l(wèi)OXLiga se Buffer lyL，SpeI和Agel雙酶切線性化克隆載體pjp743 120ng，NPRl泛素-26s蛋白酶體 降解元件片段120ng，Ligase 0.4μ1，最后用ddH2〇調整體系至10yL，輕輕混勾各組分;置于 16°C反應30min;反應完成后立即將反應管置于冰水浴中，冷卻5min;然后將連接產物轉入 大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出1個具有NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件 基因序列的克??；提取包含NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件質粒的克??；通過電擊法將其 導入到農桿菌菌株GV3101，成可以表達SA誘導降解的Venus YFP融合蛋白的(GV3101)菌株。 [0027]有益效果
[0028]將含有NPR1降解元件的表達載體導入植物，可以通過在共聚焦顯微鏡下觀察GFP 的表達量，從而檢測植物體內水楊酸的水平。當植物體內無 SA積累，在細胞核可見強烈的綠 色熒光；當植物體內有SA積累，細胞核內的黃色熒光猝滅。與傳統(tǒng)的紫外分光光度法、離子 色譜法、液相色譜法等方法相比，所述表達載體檢測植物體內水楊酸水平的方法操作簡單 便捷，重復性好，可有效用于水楊酸在植物抗病防御反應的研究分析，可以實時在活體植物 上進行檢測，而不用傳統(tǒng)的提取處理過程，可以更真實的反應植物本身體內的SA的實時動 ??τ 〇
【附圖說明】
[0029] 圖1含NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件的表達載體的構建示意圖；其中pjp748為 含有正確的NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解元件的載體結構，pjp749為含有突變的NPR1的泛 素-26s蛋白酶體降解元件的載體結構示意圖。
[0030] 圖2含NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件的融合蛋白的表達后，本氏煙葉片內熒光 隨著SA濃度不同的變化結果圖（上方標注為共聚焦顯微鏡通道，右側為SA濃度）。
[0031] 圖3含有突變的NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件的融合蛋白表后，本氏煙葉片內 熒光不隨SA變化的部分結果圖（上方標注為共聚焦顯微鏡通道，右側為SA濃度）。
【具體實施方式】
[0032] 本發(fā)明所提供的實施例均按照常規(guī)實驗條件，其中所采用的引物序列如表1。
[0033]表1NPR1降解元件的編碼基因序列擴增及載體構建引物
[0035]對于4中引物序列的說明：
[0036] Seq ID NO. 1信息:NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件5'-端擴增正向引物；
[0037] Seq ID N0.2信息:NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件3'-端擴增反向引物；
[0038] Seq ID N0.3信息：帶有Agel酶切位點NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件5'-端擴增 正向引物；
[0039] Seq ID N0.4信息：帶有Spel酶切位點NPR1泛素 -26s蛋白酶體降解元件3'-端擴增 反向引物；
[0040] Seq ID N0.16信息：帶有Agel酶切位點突變的NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件 5'_端擴增正向引物。
[0041 ] 實施例1:NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件的克隆和測定
[0042] 以引物對IKB_Fl(Seq ID No:l)/IKB_Rl(Seq ID No:2)和擴增番茄NPR1 基因泛 素-26s降解元件序列，PCR擴增體系為：9yL DEPC水、25yL 2XPCR Buffer for K0D FX Neo、10yL2mM dNTPs、上下游引物（（10μΜ each)各 1.5yL、2yL cDNA模板、lyL K0D FX Neo聚 合酶。總反應體系為50yL。各片段的反應條件為:94°C2min;94°C15s，60°C30s，68°C45s，35 個循環(huán);68°C10min。擴增的PCR產物純化后經測序獲得全序列，長度120bp(Seq ID No:5)。
[0043] 實施例2:NPR1泛素 -26s蛋白酶體降解元件YFP融合蛋白及其突變載體的構建和測 M.
[0044] 根據(jù)實施例1獲得的全序列，設計引物對IKB-F2/IKB-R2。以實施例1中DNA為模板， 以引物對IKB-F2/IKB-R2擴增。采用Spel和Agel將純化的擴增目的片段酶切，并與經Spel和 Agel雙酶切的pjp743載體進行連接，采用10yL體系反應，其中l(wèi)OXLigase Buffer lyL， Spel和Agel雙酶切線性化克隆載體pjp743 120ng，NPRl泛素-26s蛋白酶體降解元件片段 120ng，Ligase 0.4μ1，最后用ddH2〇調整體系至10yL，輕輕混勾各組分。置于16°C反應 30min。反應完成后立即將反應管置于冰水浴中，冷卻5min，最終獲得轉化質粒載體，結構如 圖1所示的載體主要結構(組成載體的主要結構單元的序列見附圖和基因序列表）。然后將 連接產物轉入大腸桿菌Machl (購自全式金公司），挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出1 個具有正確NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件基因序列的克隆。提取包含NPR1泛素-26s蛋白 酶體降解元件質粒，將該策略構建的載體命名為pjp748(圖1)。通過電擊法將其導入到農桿 菌菌株GV3101，形成可以表達SA誘導降解的Venus YFP融合蛋白的(GV3101)菌株。該NPR1泛 素-26s蛋白酶體降解元件的氨基酸序列為SEQ，NO: 6所示。
[0045] 采取以上同樣方法，設計NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件突變引物mIKB-F2。以實 SEQ，NO: 17所示的DNA為模板(突變體DNA)，以引物對mIKB-F2/IKB-R2擴增(表1)。采用SpeI 和Agel將純化的擴增目的片段酶切，并與經Spel和Agel雙酶切的pjp743載體進行連接，采 用l〇yL體系反應，其中l(wèi)OXLigase Buffer lyL，SpeI和Agel雙酶切線性化克隆載體 pjp743120ng，NPRl泛素-26s蛋白酶體降解元件突變片段120ng(SEQ，N0:17所示），Ligase 〇.4μ1，最后用ddH2〇調整體系至10yL，輕輕混勾各組分。置于16°C反應30min。反應完成后立 即將反應管置于冰水浴中，冷卻5min，最終獲得轉化質粒載體，結構如圖1所示的載體主要 結構(組成載體的主要結構單元的序列見附圖和基因序列表）。然后將連接產物轉入大腸桿 菌Machl (購自全式金公司），挑選具有全長插入的克隆，測序篩選出1個突變NPR1泛素-26s 蛋白酶體降解元件基因序列的克隆，提取該克隆質粒，將該策略構建的載體命名為pjp749 (圖1)。通過電擊法將其導入到農桿菌菌株GV3101，形成可以表達突變的SA響應元件的 Venus YFP融合蛋白的（GV3101)菌株。該突變NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件的氨基酸序 列為SEQ，N0:18所示。
[0046] 實施例4:響應SA誘導降解的Venus YFP融合蛋白的瞬時表達
[0047]將實施例子3中構建的兩種質粒載體pjp748及pjp749(其中pjp749載體的結構與 pjp748結構相同，其插入的NPR1基因泛素-26s降解元件序列為突變體，對SA的作用不響應， 圖1)分別電擊轉化導入農桿菌菌株GV3101(商業(yè)購買獲得），經菌落PCR驗證后，挑取單斑接 種于含有Kan(50mg/L)和Rif(50mg/L)抗性的LB培養(yǎng)基(基本成分是：1%蛋白胨、0.5%酵母 提取物、1 %氯化鈉）中28 °C過夜振蕩培養(yǎng);然后1:100轉接到相同抗性的LB培養(yǎng)基中，生長 至對數(shù)生長期(A6Q()值約為0.6-0.8)，經6000r/min離心5min收集菌體；用含終濃度為10mM MgCl2,10mM MES(pH 5.6)，200uM乙酰丁香酮(Ace)的無菌水重懸浮，調整菌液濃度至A600 為1.0;在室溫下放置3小時以上。
[0048] 用lml注射器(無針頭)吸取農桿菌菌液待用。選取4~6片真葉的本氏煙草，在葉片 背面緩慢將菌液(含有pjp748及pjp749質粒的農桿菌菌株GV3101)分別滲透注射到組織間 隙中。每個處理注射6~8株，將浸潤好的植株在暗處放置3~6小時后移到25 °C溫室中培養(yǎng) (16小時光照/8小時黑暗交替）。
[0049] 實施例5:融合蛋白對SA的反應
[0050] 每隔12小時對注射的實施例子4中的煙草葉片噴灑(2mL/g葉片)(ΗΗ20、10μΜ、100μ M、lmM的SA溶液，48小時候采用熒光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白對SA的反應。觀察表明， NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件YFP融合蛋白對10μΜ、100μΜ、ImM SA表現(xiàn)出敏感性，熒光強 度明顯降低，并隨SA濃度增加呈減弱趨勢；而NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件突變體YFP融 合蛋白對(1(1!1 20、1(^1、10(^1、111^34均無明顯反應（圖2和圖3)。這些結果表明構建的即1?1 泛素-26s蛋白酶體降解元件YFP融合蛋白具有響應SA生物學活性，并能實時反應植物內SA 水平，可以用來檢測植物體內的SA實時變化水平。
[0051 ] 實施例6:響應SA誘導降解的Venus YFP融合蛋白的表達以及運用 [0052]質粒載體：
[0053]將pjp748:實施例子4中的載體；
[0054] pjp749:其中pjp749載體的結構與pjp748結構一樣，除了插入的NPR1泛素-26s蛋 白酶體降解元件基因片段為突變體，對SA的作用不響應，圖1;
[0055] pjp750:其中pjp750載體的結構與pjp748結構一樣，但是只含有Seq ID N〇:5所示 的序列的基因，而焚光蛋白基因為突變體基因或者不含焚光蛋白基因；
[0056] pjp751:其中pjp750載體的結構與pjp748結構一樣，但是只含有Seq ID N〇:ll(熒 光蛋白）所不的序列的基因，但是不含有Seq ID No:5所不的序列的基因。
[0057]分別將上述4中質粒載體電擊轉化導入農桿菌菌株GV3101(商業(yè)購買獲得），經菌 落PCR驗證后，挑取單斑接種于含有Kan (50mg/L)和Rif (50mg/L)抗性的LB培養(yǎng)基(基本成分 是：1 %蛋白胨、〇. 5 %酵母提取物、1 %氯化鈉）中28 °C過夜振蕩培養(yǎng);然后1:100轉接到相同 抗性的LB培養(yǎng)基中，生長至對數(shù)生長期(A6Q()值約為0.6-0.8)，經6000以1^11離心51^11收集菌 體；用含終濃度為10mM MgCl2，10mM MES(pH 5.6)，200uM乙酰丁香酮(AS)的無菌水重懸浮， 調整菌液濃度至A?為1.0;在室溫下放置3小時以上。
[0058]用lml注射器(無針頭）分別吸取以上含有4種自立載體的農桿菌菌液待用。選取4 ~6片真葉的本氏煙草，在葉片背面緩慢將菌液(含有？」？748、？」？749、？」？750、？」？751質粒 的農桿菌菌株GV3101)分別滲透注射到組織間隙中。每個處理注射6~8株，將浸潤好的植株 在暗處放置3~6小時后移到25°C溫室中培養(yǎng)（16小時光照/8小時黑暗交替）。每隔12小時對 注射的實施例子4中的煙草葉片噴灑100μΜ的SA溶液，48小時候采用熒光共聚焦顯微鏡觀察 融合蛋白對SA的反應。具體結果如下表1:
[0059]表1，不同融合蛋白體外與SA接觸的結果(48小時）
[0061]從以上實驗結果可以看出，只有NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件-熒光蛋白形成 的融合蛋白，才特異的表現(xiàn)出響應SA的特異降解。同時，當只有NPR1泛素-26s蛋白酶體降解 元件時，不產生熒光，而只有熒光蛋白單獨存在的情況下，熒光蛋白也并不降解。隨著接觸 反應的時間延長(3天以上），以上結果仍然不變。這似乎可以說明，只有當NPR1泛素-26s蛋 白酶體降解元件和熒光蛋白基因的融合蛋白，可以特異被SA所降解，其他則不能。進一步說 明，可以用本發(fā)明的融合蛋白來特異指示SA是否存在。
[0062]同時，我們用SA的類似物做同樣的實驗，或者類似的結果（【具體實施方式】和數(shù)據(jù)
【主權項】
1. 一種特異檢測水楊酸（SA)的融合蛋白，其中，該融合蛋白包括NPR1基因的泛素-26s 蛋白酶體降解元件區(qū)域DNA序列所編碼的蛋白和熒光蛋白基因所編碼的蛋白，其中，該融合 蛋白能夠特異被SA誘導降解，導致熒光強度減弱。2. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中，該融合蛋白為NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解 元件的基因和熒光蛋白基因所編碼或所表達。3. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中，該融合蛋白可以專一，特異地被SA誘導降解， 相反，當單獨的NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解元件的基因所編碼的蛋白或者單獨的熒光蛋 白基因所編碼的蛋白均不會受到SA誘導降解而導致熒光強度減弱。4. 根據(jù)權利要求1所述的融合蛋白，其中，該融合蛋白是通過質粒載體轉入到表達載體 來表達的，所述的質粒載體的結構從左到右順次包括:T-DNA右邊界元件序列-35S啟動子元 件序列-第一酶切位點-NPR1泛素-26s蛋白酶體降解元件-第二酶切位點-第一接頭序列-熒 光蛋白序列-第二接頭序列-細胞核定位蛋白（NLS)序列-終止子序列-35S啟動子序列-Τ'-DNA 左邊界序列 ，其中所述的表達載體為農桿菌，該農桿菌是被接種到煙草中進行表達的。5. 根據(jù)權利要求1-4之一所述的融合蛋白，其中，所述的NPR1的泛素-26s蛋白酶體降解 兀件的基因為Seq ID No:5所不；焚光蛋白所編碼的基因序列為Seq ID No:ll所不。
【文檔編號】C07K19/00GK106046175SQ201610442983
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】趙晉平, 李賽賽, 燕飛, 程曄, 陳劍平
【申請人】浙江省農業(yè)科學院