一種新的二萜類化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的二萜類化合物及其制備方法。該化合物為首次報道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的二萜類化合物，可以從燈心草的干燥莖髓中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物能夠有效抑制HepG2細胞的生長增殖，且降低程度與化合物(Ⅰ)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應趨勢，可以用來開發(fā)成治療肝癌的藥物。本發(fā)明化合物(Ⅰ)體外試驗證明該化合物能夠有效抑制HepG2細胞的生長增殖，且降低程度與化合物(Ⅰ)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應趨勢，可以用來開發(fā)成治療肝癌的藥物。而且本發(fā)明化合物(Ⅰ)用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用，作為藥物時，可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者，因此其應用范圍較廣。
【專利說明】
一種新的二萜類化合物及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術領域，具體涉及從燈心草的干燥莖髓中分離得到的一種新的 二萜類化合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 燈心草別名燈芯草、燈草，為燈心草科植物燈心草Juncuse ffusus L.的干燥莖 髓。夏末至秋季割取莖，曬干，取出莖髓，理直，扎成小把。為多年生稀一年生草本，主產(chǎn)于江 蘇、福建、四川、貴州、云南，通常生長在草甸、沼澤、水邊及陰濕的環(huán)境中。味甘、淡，性微寒， 歸心、肺、小腸經(jīng)，是治療心煩少眠、高熱口渴、尿少澀痛、小兒疳積、口舌生瘡等癥的傳統(tǒng)藥 物。
[0003] 各國學者對燈心草屬植物的化學成分進行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)其化學成分比較復 雜，主要含二萜類、三萜類、苯并香豆素類、留類化合物，此外還含有黃酮類、糖類及苷類等 化合物。
[0004] 燈心草屬植物在中國和日本都有悠久的藥用歷史，被收錄于很多醫(yī)藥學著作。燈 心草屬植物中大部分化合物為具有二氫菲和菲母核的二萜類化合物，并且都具有酚羥基， 因此許多化合物都具有較好的生物活性。燈心草具有抗藻活性、抗菌活性、抗?jié)裾罨钚浴⒖?氧化活性、抗病毒活性、鎮(zhèn)靜作用等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種新的二萜類化合物及其制備方法，該二萜類化合物從燈 心草的干燥莖髓中分離得到。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：
[0007] -種新的二萜類化合物，具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0008]
[0009] ( I) p
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)燈心草的干燥莖髓粉碎，用 75~85 %乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和 的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙 酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用75%乙醇洗脫12個柱體 積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫物 浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、15:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0011] 進一步地，步驟(a)中，用80%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0012]進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] -種藥物組合物，該藥物組合物含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學上可 接受的載體。
[0014] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、對 人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0015] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0017]本發(fā)明化合物（I)經(jīng)體外試驗證明該化合物（I)能夠有效抑制HepG2細胞的生長增 殖，且降低程度與化合物（I)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應趨勢，可以用來開發(fā)成治療肝癌的藥 物。而且本發(fā)明化合物(I)用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用，作為 藥物時，可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者，因此其應用范圍較廣。
【附圖說明】
[0018] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實驗ECD值比較；
[0020] 圖3化合物（I)對HepG2及L02細胞增殖的影響(η = 3)。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。
[0022]實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0023] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0024] 制備方法：（a)將燈心草的干燥莖髓（8kg)粉碎，用80 %乙醇熱回流提?。?5L X 3 次），合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取 物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積， 再用75%乙醇洗脫12個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏 (145g);(c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個柱體 積）、50:1 (8個柱體積）、30:1 (6個柱體積）、15 :1 (8個柱體積)和1:1 (5個柱體積）的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(47g)用正相硅膠進一步分離，依次用 體積比為20:1(8個柱體積）、15:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2(26g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純 的化合物（I)(39mg)。
[0025] 結(jié)構(gòu)確證:冊431]\^顯示[]\1+他]+為111/2 483.1612，結(jié)合核磁特征可得分子式為 〇24112809，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)511( ??111，0130-(16,6001〇^):!1-1(5.03，(1，了 = 4.9)，H-2(4.47，br，d，J=4.9)，H-3(4.03，br，s)，H-5(2.77，s)，H-7(5.75，s)，H-9(2.88， s)，H-12(5.38，s)，H-14(2.61，d，J=16.0)，H-14(2.18，d，J=16.0)，H-15(5.81，dd，J = 17.8，11.2)，H-16(5.16，d，J=11.2)，H-16(4.98，d，J=17.8)，H-17(1.03，s)，H-19(1.43， s)，H-20(1 · 01，s)，2-0Ac(2 · 16，s)，12-0Ac(1 · 97，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ。（ppm，DMS〇-d6， 150MHz):80.1(CH，1-C)，75.2(CH，2-C)，76.6(CH，3-C)，46.0(C，4-C)，57.1(CH，5-C)，194.0 (C，6-C)，125.8(CH，7-C)，155.9(C，8-C)，45.6(CH，9-C)，41.1(C，10-C)，201.1(C，11-C)， 86.6(CH，12-C)，40.6(C，13-C)，43.0(CH2，14-C)，139.8(CH，15-C)，116.0(CH2，16-C)，20.1 (CH 3，17-C)，175.2(C，18-C)，16.9(CH3，19-C)，20.1(CH3,20-C)，169.3(C，2-0Ac)，25.1 (〇1 3,2-(^)，170.1((：，12-(^)，25.3(〇13，12-(^);碳原子標記參見圖1。紅外光譜表明該 化合物含有羥基（3437CHT 1)和羰基（1758(31^1)基團。4和13C匪R譜表明該化合物含有兩個 酮羰基(一個為不飽和酮羰基），一個酯羰基，兩個乙酰氧基，單取代和三取代雙鍵。此外，典 型的乙烯基[雙二重峰5!15.81(了=17.8，11.2!^，!1-15)，兩個雙峰5!15.16(了=11.2!^，!1-16)，4.98(了=17.8他，!1-16)和3(：139.8((：-15)，116.0((：-16)和20.1((：-17)]和偕甲基[3 町.03(8，1^-17)]信號表明該化合物為二萜類化合物。腿8(：譜中，(：-13與16-17 ;(：-15與!1-12，H-16b，H2-14和Me-17;C-17與H-12，H2-14，H-15和H 2-16的相關性表明乙烯基和偕甲基位 于C-130C4O.6)位上。HMBC譜中C-18與Η-1，Η-3，Η-5和Me-19,以及C-1 與H-2和H-3的相關性 表明C-1和C-18之間存在內(nèi)酯環(huán)。另外，C-18和Me-19與C-40C46.O)相連，HMBC譜中的C-4和 Me-19的耦合證實了上述結(jié)論。通過HMBC譜中C-6與H-5和H-14b;C-7與H-9和H2-14;C-8與H-9和 H2-14 的相關性可知α，β-不飽和酮基結(jié)構(gòu)[SC194.0(C-6)，125.8(C-7MP155.9(C-8)W 及SH5.75(s，H-7)]位于C-5和C-9之間。HMBC譜中氫質(zhì)子信號0!14.47，1^，(1，1 = 4.9泡和 5.38,8)與相應羰基碳0(：169.3和17〇.1)的相關性，表明(：-2和(：-12位分別連有一個乙酰氧 基。N0ESY譜中，H-1和Me-20的相關性表明它們?yōu)棣寥∠颍籋-3與H-2和]^-19，]\^-19與!1-5的相 關性，表明它們?yōu)棣聵?gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數(shù) 據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基 本一致(圖2)。
[0026]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗 [0027] 一、材料和儀器
[0028] HepG2人肝癌細胞株購自中科院生物化學與細胞生物學研究所。L02正常人肝細胞 株由復旦大學中山醫(yī)院肝癌研究所饋贈?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98% APMI-1640培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司。標準小牛血清購自Biowest公司。3-(4,5-二甲基噻挫- 2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)、臺盼藍(TrypanBLue)、二氯熒光素雙 醋酸鹽(DCFH-DA)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。其他常用試劑均為分析純。 [0029] 微量天平(瑞士梅特勒-托利多，METTLRERAE2000)。普通臺式離心機(上海安亭科 學儀器廠）。數(shù)顯電熱恒溫水浴箱(上海躍進醫(yī)療機械廠，HH.W21.600S)。二氧化碳細胞培養(yǎng) 箱(美國FormaScientif ic公司）。高速冷凍離心機(美國Thermo公司，IECMICROMAXRF)。超微 量紫外分光光度計(美國ThermoHsher公司，NanoDrop-1000)。紫外成像系統(tǒng)(上海復日科技 有限公司，F(xiàn)R-200A)。酶聯(lián)免疫檢測儀，熒光分光光度計(HitachiF2500)。
[0030] 二、試驗方法
[0031] 1、細胞培養(yǎng)
[0032] 將細胞常規(guī)接種于含10% (體積分數(shù))小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、 5 % C02濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033] 2、化合物（I)干預培養(yǎng)液的配置
[0034] 將45.44mg化合物（I)溶于10mL二甲基亞砜(DMS0)制得儲備液并分別稀釋2倍、4 倍，分別得到2mmo 1 /L、4mmo 1 /L及8mmo 1 /L的化合物（I)應用液。進行細胞干預前，將5 OyL應 用液與4950yL常規(guī)培養(yǎng)液(含10%體積分數(shù)的小牛血清)充分混合，得到化合物（I)干預培 養(yǎng)液(2〇4111〇1/1^、4(^1]1〇1/1^、8(^1]1〇1/1^)。
[0035] 3、MTT法檢測細胞存活率
[0036]取對數(shù)生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200yL(5X103細胞）。培養(yǎng)12h待細胞 貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入200此不同濃度的化合物（I)培養(yǎng)液(DMS0溶解化合物（I)后以 1 %體積分數(shù)與常規(guī)培養(yǎng)液混合，使化合物（I)終濃度為20μπι〇 1/L、40μπι〇 1/L、80μπι〇 1/L)，每 組6個平行孔。同時設6個溶劑(DMS0)對照孔。培養(yǎng)24h、48h、72h，每24小時更換化合物（I)干 預培養(yǎng)液。干預結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，向各孔加入20yLMTT溶液，37 °C孵育4h后吸去各孔上清 液，加入150yL DMS0，置搖床上低速震蕩10min，待結(jié)晶充分溶解后，以DMS0調(diào)零，用酶聯(lián)免 疫檢測儀在490nm處測定各孔吸光度，計算細胞存活率（survival rate，SR)。SR =實驗組 A49〇/對照組 A49QX100%
[0037] 4、臺盼藍染色測定存活細胞數(shù)
[0038] 將相同數(shù)量(2 X106)的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細胞貼壁后，棄 去培養(yǎng)液，用洗細胞兩遍后，加入5mL的化合物（I)干預培養(yǎng)液(20ym 〇l/L、40ym〇l/L、80y mol/L)。每組三瓶細胞，同時設立三瓶溶劑(DMS0)對照。培養(yǎng)48h后，用0.25 %胰酶消化細 胞，收集細胞懸液，臺盼藍染色測定細胞數(shù)。
[0039] 5、DCFH-DA法測定細胞內(nèi)R0S活性
[0040]將相同數(shù)量(2 X106)的細胞接種于細胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)一段時間待細胞貼壁后，吸 去原培養(yǎng)液，加入5mL化合物（I)干預培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化細胞， 收集細胞懸液于1.5mL EP管中，1500rpm離心5min，棄上清，向沉淀中加入lmL DCFH-DA，吹 打混勻，37°C孵育30min，加入roS終止反應，離心收集沉淀并溶解于lmL PBS，吹打成均勻細 胞懸液，用Hitachi-F2500焚光分光光度計測定熒光值。激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm。
[0041 ]三、結(jié)果及結(jié)論
[0042] 1、細胞生長存活率
[0043] HepG2細胞經(jīng)化合物（I)干預培養(yǎng)24h、48h、72h后，低、中、高劑量組的細胞存活率 均顯著低于溶劑對照組(P〈〇.05)，且細胞存活率下降的程度與化合物（I)干預濃度之間存 在一定劑量效應趨勢(表1，aP〈〇. 05VS對照組;bP〈0.05VS低劑量組;eP〈0.05VS中劑量組）。在 同一化合物（I)干預濃度下，細胞存活率隨著干預時間的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢。而同等條 件下，L02人正常肝細胞經(jīng)化合物（I)干預后，細胞存活率無顯著變化(表2)。臺盼藍染色細 胞計數(shù)結(jié)果與MTT-致(圖3， aP〈0.05VS對照組;bP〈0.05VS低劑量組;CP〈0.05VS中劑量組）。 [0044] 2、細胞內(nèi)R0S活性
[0045] HepG2人肝癌細胞經(jīng)不同濃度化合物（I)干預后，與對照組相比，細胞內(nèi)R0S水平顯 著下降(p〈0.05)。結(jié)果見表3(aP〈0.05VS對照組;bP〈0.05VS低劑量組）。
[0046] 結(jié)論，采用不同濃度的化合物（I)對人肝癌細胞HepG2進行干預處理，經(jīng)MTT比色及 臺盼藍染色細胞計數(shù)表明，化合物（I)能夠有效抑制HepG2細胞的生長增殖，干預組細胞的 存活率較對照組顯著降低，且降低程度與化合物（I)濃度呈現(xiàn)一定的劑量效應趨勢，同時在 同一化合物（I)濃度下，細胞存活率隨著干預時間的增加而呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢。與此同 時，相同劑量的化合物（I)干預對L02正常肝細胞并不產(chǎn)生抑制作用。
[0047] 表1化合物（I)對HepG2細胞生長存活率的影響(X土s，n = 6)
[0048]
[0049] 表2化合物（I)對L02細胞生長存活率的影響(X土s，n = 6)
[0050]
[0051 ] 表3化合物（I)對HepG2細胞R0S水平的影響（X 土 s，η = 6)
[0052] _
[0053] 實施例3
[0054] 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0055] 實施例4
[0056] 口服液制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0057] 實施例5
[0058] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0059] 實施例6
[0060] 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0061 ] 實施例7
[0062] 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0063] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權項】
1. 一種新的二萜類化合物，其特征在于，具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將燈 心草的干燥莖髓粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石 油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇 萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再 用75%乙醇洗脫12個柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏；（c) 步驟(b)中75 %乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30:1、15:1和 1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離， 依次用體積比為20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組 分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫， 收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，步驟(a)中，用80%乙醇 熱回流提取，合并提取液。4. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有治療有效量的權利要求1所述的化 合物(I)和藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K31/366GK106008543SQ201610356780
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】董秋月
【申請人】杭州更藍生物科技有限公司