一種從小葉蓮中提取分離半日花烷型二萜類化合物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥，特別是一種從小葉蓮中提取分離半日花燒型二祗類化合物的方 法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一。具有 療程長(zhǎng)、難治愈的特點(diǎn)。在世界衛(wèi)生組織第18屆國(guó)際抗癌癥聯(lián)盟大會(huì)上的一項(xiàng)研究報(bào)告表 明，未來20年內(nèi)新增患病人數(shù)將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因癌癥而死亡的人數(shù) 也將由每年600萬增至1000萬。全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，在我國(guó)惡性腫瘤死亡率位居全部 疾病死亡率之首。目前臨床上廣泛使用的合成的抗腫瘤藥物普遍存在著毒副作用如脫發(fā)、 貧血和胃腸不適等現(xiàn)象。因此加強(qiáng)抗腫瘤藥物的研究，延長(zhǎng)患者的生存期，改善患者的生活 質(zhì)量是藥學(xué)工作者的當(dāng)務(wù)之急。中草藥在抗腫瘤方面的應(yīng)用歷史悠久，從中草藥中尋找高 效低毒的抗腫瘤活性物質(zhì)，研制選擇性強(qiáng)、毒副作用低的新型抗腫瘤藥物是藥學(xué)科研工作 者迫切解決的首要問題。
[0003] 小葉蓮是小築科桃兒屯屬植物鬼白5;[]1〇9〇(1〇地5^1111111 emodi(Wall. )Ying.的干燥 成熟果實(shí)。鬼白是一種具有悠久歷史的藥用植物，古代《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載:殺大毒， 療咳嗽喉疾，風(fēng)邪煩感，失魄妄見。不入湯。W后的歷代本草亦多有記載，主要用于活血散 結(jié)、桂風(fēng)除濕、蟲蛇咬傷、跌打、屯、胃痛、風(fēng)寒咳嗽、月經(jīng)不調(diào)、鐵棒鍵中毒、風(fēng)濕筋骨痛及氣 管炎等癥。鬼白分布比較廣泛，我國(guó)主要分布在四川、青海、西藏、甘肅、陜西。小葉蓮作為傳 統(tǒng)藏藥始載于《月王藥診》，具有悠久的藥用歷史。化學(xué)成分研究表明主要含有木脂素和黃 酬類化合物，而半日花燒型二祗類化合物首次在該屬植物中被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明所設(shè)及的從小 葉蓮中制備半日花燒型二祗類化合物及其抗肝癌和乳腺癌活性，迄今為止未見有專利或文 獻(xiàn)報(bào)道。
[0004] 由于生物合成的復(fù)雜性，天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)也復(fù)雜多樣。W常規(guī)的色譜學(xué)方法為主 的分離純化手段往往很難將結(jié)構(gòu)非常相似的天然產(chǎn)物分離開來，而天然產(chǎn)物中混有痕量的 高活性的雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生物活性的錯(cuò)誤結(jié)論。據(jù)相關(guān)報(bào)道，天然產(chǎn)物熊果酸具有120種生物活 性，有些生物活性在不同的文獻(xiàn)中是完全相反的，如抗菌活性，細(xì)胞毒活性。出現(xiàn)運(yùn)樣結(jié)論 的原因是，測(cè)試活性所用的熊果酸樣品不是單一的熊果酸化學(xué)實(shí)體，與其共存的雜質(zhì)嚴(yán)重 影響了活性結(jié)果。因此建立完善的天然產(chǎn)物純度評(píng)價(jià)方法是其準(zhǔn)確的生物活性評(píng)價(jià)的必要 條件。同時(shí)高純度的天然產(chǎn)物也是相關(guān)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)所必須的。因此天然產(chǎn)物的純度評(píng)價(jià) 是非常重要的。
[0005] 半日花燒型二祗是W十氨糞環(huán)合而成的母核為基本骨架的二祗。具有抗炎、抗癌、 保肝利膽、降血糖、抗生育等作用。此類化合物的純度可W通過薄層色譜和高效液相色譜法 測(cè)定，運(yùn)兩種純度鑒定方法不僅需要相應(yīng)的對(duì)照品、操作方法復(fù)雜耗時(shí)長(zhǎng)，而且由于天然產(chǎn) 物特別是半日花燒型二祗類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性，容易產(chǎn)生誤差。定量核磁共振 氨譜法，由于其操作快速簡(jiǎn)便、樣品消耗量少、同時(shí)給出定性的結(jié)構(gòu)信息和定量分析結(jié)果， 特別是定量核磁共振氨譜法不依賴于被測(cè)物的高純度標(biāo)準(zhǔn)品，因此定量分析的成本大大降 低。利用定量核磁共振氨譜法進(jìn)行半日花燒型二祗類化合物的純度測(cè)定是一項(xiàng)非常重要的 研究工作。但至今尚未見到采用定量核磁共振氨譜法測(cè)定具有7(8)雙鍵的半日花燒型二祗 類化合物的純度的公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從小葉蓮中 提取半日花燒型二祗類化合物的方法及其應(yīng)用，可有效解決從小葉蓮中提取分離(制備)半 日花燒型二祗類化合物及純度測(cè)定和制備抗乳腺癌、肝癌藥物中的應(yīng)用問題。
[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，所述的從小葉蓮中提取半日花燒型二祗類化合物為 labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-13-〇ne(II)，分 子結(jié)構(gòu)式分別為：
[000引
[0009]其制備方法是，將小葉蓮6-9kg用小葉蓮重量2-5倍、體積濃度為75%-95%的乙醇 加熱回流提取3次，提取溫度為90-95°C，提取時(shí)間為1.5-2小時(shí)，減壓回收乙醇得浸膏狀乙 醇提取物，將乙醇提取物混懸于2-3.化的蒸饋水中，依次W石油酸、二氯甲燒萃取3次，每次 2-3.21^;將二氯甲燒萃取部位上硅膠柱，依次用體積比為100: 0、100: 5、100:7、100:10、100: 30的石油酸-丙酬混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度用10-1化洗脫液，流速為IO-ISmLmirTi, 每200-300ml體積為一流份，收集215個(gè)流份，各個(gè)流份用GF254薄層板，W體積比1:1的石油 酸-丙酬作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加熱3-5min，進(jìn)行 硅膠薄層色譜檢測(cè)，根據(jù)硅膠薄層色譜檢測(cè)結(jié)果合并流份1-50、51-134、135-178、179-215， 得到組份Fr. 1、組份Fr. 2、組份化.3和組份Fr. 4;將組份Fr. 4上Se地adex LH-20柱，用甲醇 洗脫，流速為1 -2mLmin-i，每5 - IOmL為一流份，收集22個(gè)流份，各個(gè)流份用GF254薄層板，W體 積比3:1的石油酸-丙酬作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加 熱3-5min，進(jìn)行硅膠薄層色譜檢測(cè)分析，根據(jù)硅膠薄層色譜檢測(cè)結(jié)果合并流份1-4、5-22,得 到亞組份化.4-1、亞組份化.4-2;將亞組份Fr. 4-2經(jīng)開放ODS柱色譜，用體積比40:60、50: 50、60:40、80:20的甲醇-水作洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為1-SmLmirTi，每3-7ml體積為一流份， 共收集45個(gè)流份，各個(gè)流份用GF254薄層板，W體積比4:1的二氯甲燒-丙酬作為展開劑，W 體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加熱3-5min，進(jìn)行硅膠薄層色譜檢測(cè)分 析，分別合并含有目標(biāo)物labda-7,13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hy化oxy-7-labden-13-〇ne( II)的流份，并分別進(jìn)行純度測(cè)定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol (I) 和14,15-dinor-30-hydroxy-7-l曰bden-13-one(II)。
[0010]該方法制備的labda-7,13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hyh〇w-7-Iabden-13-〇ne(II)具有抗乳腺癌、肝癌的活性，實(shí)現(xiàn)labda-7,13-diene-3,15-diOI (I)和 14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-l3-〇ne(II)在制備抗乳腺癌、肝癌藥物中的應(yīng)用。
[001。 本發(fā)明方法穩(wěn)定可靠，易操作，所得產(chǎn)物經(jīng)（Ih-醒R、"C-匪R、DEPT、Ih-Ih COSY、 HSQC、麗BC、N0ESY)及高分辨質(zhì)譜化R-ESI-MS)光譜技術(shù)鑒定為半日花燒型二祗類化合物 labda-7,13-diene-3,15-diol(I)和14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-13-0ne(II)，并 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和人肝癌細(xì)胞化pG2具有細(xì)胞毒活性，有效用于制備抗乳腺癌、肝 癌藥物，開拓了小葉蓮的藥用價(jià)值，是抗乳腺癌、肝癌藥物上的創(chuàng)新，有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì) 效益。
【具體實(shí)施方式】
[0012] W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0013] 本發(fā)明在具體實(shí)施中可由W下實(shí)施例給出。
[0014] 實(shí)施例1
[0015] 本發(fā)明在具體實(shí)施中，是將小葉蓮化g用小葉蓮重量3倍、體積濃度為95%的乙醇 加熱回流提取3次，提取溫度為95°C，提取時(shí)間為1.5小時(shí)，減壓回收乙醇得浸膏狀乙醇提取 物，將乙醇提取物混懸于3.化的蒸饋水中，依次W石油酸、二氯甲燒萃取3次，每次3.2レ將 二氯甲燒萃取部位上硅膠柱，依次用體積比為100: 0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油 酸-丙酬混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度用1化洗脫液，流速為ISmLmirTi，每300ml體積為 一流份，收集215個(gè)流份，各個(gè)流份用GF254薄層板，W體積比1:1的石油酸-丙酬作為展開 劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105°C加熱5min，進(jìn)行硅膠薄層色譜檢測(cè)， 根據(jù)硅膠薄層色譜檢測(cè)結(jié)果合并流份l-50、51-134、135-178、179-215，得到組份Fr.l、組份 Fr. 2、組份Fr. 3和組份Fr. 4;將組份Fr. 4上S邱hadex LH-20柱，用甲醇洗脫，流速為2mLmin -1，每IOmL為一流份，收集22個(gè)流份，各個(gè)流份用GF254薄層板，W體積比3:1的石油酸-丙酬 作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液作為顯色劑，105 °C加熱5min，進(jìn)行硅膠薄層 色譜檢測(cè)分析，根據(jù)硅膠薄層色譜檢測(cè)結(jié)果合并流份1-4、5-22,得到亞組份Fr.4-1、亞組份 化.4-2;將亞組份化.4-2經(jīng)開放ODS柱色譜，用體積比40:60、50:50、60:40、80:20的甲醇-水 作洗脫液進(jìn)行洗脫，流速為3mLmin-i，每7ml體積為一流份，共收集45個(gè)流份，各個(gè)流份用 GF254薄層板，W體積比4:1的二氯甲燒-丙酬作為展開劑，W體積比10:90的硫酸-乙醇溶液 作為顯色劑，105 °C加熱3min，進(jìn)行硅膠薄層色譜檢測(cè)分析，分別合并含有目標(biāo)物labda-7， 13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hyh(My-7-labden-13-〇ne (II)的流份，并分 別進(jìn)行純度測(cè)定，得到labda-7,13-diene-3,15-diol (I)和14,15-dino;r-30-hyh〇w-7-labden-13-one(II)。
[0016] 實(shí)施例2
[0017] 本發(fā)明在具體實(shí)施中，也可將小葉蓮化g用小葉蓮重量5倍、體積濃度為75%的乙 醇加熱回流提取3次，提取溫度為92°C，提取時(shí)間為1.8小時(shí)，減壓回收乙醇得浸膏狀乙醇提 取物，將乙醇提取物混懸于化的蒸饋水中，依次W石油酸、二氯甲燒萃取3次，每次化;將二 氯甲燒萃取部位上硅膠柱，依次用體積比為100:0、100:5、100:7、100:10、100:30的石油酸-丙酬混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫，每一梯度用IOL洗脫液，流速為IOmLmirTi,每200ml體積為一流 份，收集215個(gè)流份，