本發(fā)明涉及突變酶及使用所述突變酶的類萜的制備方法。根據(jù)本發(fā)明,能夠大量生產(chǎn)經(jīng)甲羥戊酸路徑所產(chǎn)生的角鯊烯。
背景技術(shù):
類萜為超過5萬種的天然化合物群的總稱,在基本骨架中具有碳原子數(shù)5的異戊二烯單元。類萜根據(jù)碳原子數(shù)可分類為半萜(C5)、單萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、二倍半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)及其他多萜,在生物合成中,首先,通過異戊烯焦磷酸(IPP)及異戊烯焦磷酸經(jīng)異構(gòu)化所生成的二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的縮聚,制備數(shù)量不同的各種異戊二烯焦磷酸。從碳原子數(shù)10的香葉基焦磷酸中生物合成單萜(C10),從碳原子數(shù)15的法呢基焦磷酸中生物合成倍半萜(C15),從碳原子數(shù)20的香葉基香葉基焦磷酸中生物合成二萜等。
在很長一段時(shí)間,人們相信在類萜的生物合成中不可或缺的IPP與DMAPP,只能通過經(jīng)由甲羥戊酸即“甲羥戊酸路徑”來進(jìn)行生物合成,但瀨戶及葛山等,發(fā)現(xiàn)除了“甲羥戊酸路徑”以外,經(jīng)由存在于多數(shù)真細(xì)菌或植物的色素體中的磷酸甲基赤蘚醇(MEP)路徑,也可以進(jìn)行生物合成(非專利文獻(xiàn)1)。
在類萜中,除了(C5H8)n的不飽和烴以外,在多數(shù)的植物及動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了它們的氧化還原生成物(醇、酮、酸等)或脫碳的化合物等,其中大量包括具有生理活性的物質(zhì)。例如包括脫落酸、赤霉素、油菜類固醇等植物激素、保幼激素等在生物體內(nèi)擔(dān)負(fù)極重要功能的化合物,或作為在結(jié)構(gòu)的一部分中具有異戊二烯結(jié)構(gòu)的復(fù)合萜的葉綠素、維生素K、泛醌、tRNA等表現(xiàn)有用生理活性的化合物。其中,維生素K為參與血液凝固體系的重要的維生素,除了被用作止血?jiǎng)┲?,在最近有啟示其參與骨代謝,期待其在骨質(zhì)疏松癥治療上的應(yīng)用,葉綠醌與甲基萘醌作為醫(yī)藥品而被允許。此外,泛醌或維生素K類中,對船體或橋腳等建造物上附著貝類具有防附著作用,期待其在防貝類附著涂料上的應(yīng)用。更進(jìn)一步,類胡蘿卜素具有抗氧化作用,β-胡蘿卜素、蝦青素及隱黃素等則作為具有預(yù)防癌癥或免疫活化活性的物質(zhì)而受到期待。
現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:特表2011-520471號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)2:特表2009-538601號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)3:特表2010-539902號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn)1:“生物科學(xué),生物技術(shù),生物化學(xué)(Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry)”(日本)2002年,第66卷,p1691-1627
非專利文獻(xiàn)2:“化學(xué)與生物”(日本)2012年,第50卷,p163-174
非專利文獻(xiàn)3:“細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)”(美國)1999,第181巻,p.1256-1263
非專利文獻(xiàn)4:“歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志(The EMBO Journal)”(英國)2000年,第19卷,p819-830
非專利文獻(xiàn)5:“應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(Applied Microbiology and Biotechnology)”(1998)49:p66-71
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
隨著與類萜合成相關(guān)的路徑的清晰,人們對其進(jìn)行了改良,并進(jìn)行用于提高類萜的產(chǎn)量的研究(非專利文獻(xiàn)2)。在這些類萜中,角鯊烯直接由法呢基焦磷酸生物合成,處于與多種三萜相連接的主要的中間體的位置,因而進(jìn)行了各種以提高角鯊烯的產(chǎn)量為目的的研究。例如,專利文獻(xiàn)1中,公開了一種含有以生成濃度增加的類異戊二烯的方式進(jìn)行修飾而在遺傳方面發(fā)生改變的酵母的組合物,其中記載,通過消除甲羥戊二酸單酰(hydroxymethylglutaryl)CoA還原酶(HMGR)的膜結(jié)合區(qū)域,而增加角鯊烯的產(chǎn)量。此外,在專利文獻(xiàn)2及專利文獻(xiàn)3中,公開了含有角鯊烯的類異戊二烯化合物的生產(chǎn)方法。
然而,專利文獻(xiàn)1所述的角鯊烯的產(chǎn)量至多為菌體干重量的5%左右,無法說是充分。此外,專利文獻(xiàn)2及3所公開的技術(shù)為用于調(diào)整制備條件的技術(shù),并非顯著超越了現(xiàn)有技術(shù)。
本發(fā)明的目的在于有效地生產(chǎn)有用的類萜化合物,特別是提供一種作為類萜的重要中間體的角鯊烯的制備方法。
解決技術(shù)問題的技術(shù)手段
本發(fā)明人等對類萜化合物的生產(chǎn)方法進(jìn)行仔細(xì)研究,結(jié)果驚訝地發(fā)現(xiàn),作為甲羥戊酸路徑的酶之一的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,通過使用具有特定氨基酸序列的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,甲羥戊酸路徑下游的化合物、特別是角鯊烯的產(chǎn)量飛躍性地增加。
本發(fā)明基于上述見解。
因此,本發(fā)明涉及:
[1]一種甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其含有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)的(a)Sα2氨基酸序列中第10位的丙氨酸(A)以外的氨基酸、(b)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的脯氨酸(P)以外的氨基酸、(c)Lα2氨基酸序列中第1位的丙氨酸(A)以外的氨基酸、及(d)Lα2氨基酸序列中第6位的谷氨酸(E)以外的氨基酸;
[2]根據(jù)[1]所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其中,所述Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為絲氨酸(S),HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸為丙氨酸(A),Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸為絲氨酸(S),Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為天冬酰胺(N);
[3]根據(jù)[1]或[2]所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,所述甲羥戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)進(jìn)一步含有選自由(e)Sα2氨基酸序列中第7位的異亮氨酸(I)以外的氨基酸、(f)Lα2氨基酸序列中第5位的異亮氨酸(I)以外的氨基酸、及(g)Sα2氨基酸序列中第6位的丙氨酸(A)以外的氨基酸構(gòu)成的組中的一種或兩種以上的氨基酸;
[4]根據(jù)[3]所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其中所述Sα2氨基酸序列中第7位的氨基酸為亮氨酸,Lα2氨基酸序列中第5位的氨基酸為蘇氨酸,Sα2氨基酸序列中第6位的氨基酸為亮氨酸;
[5]根據(jù)[1]~[4]的任一項(xiàng)所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其為含有下述(1)~(3)任一種氨基酸序列的多肽,且為具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多肽:(1)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位的氨基酸序列、(2)在序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位構(gòu)成的氨基酸序列中,經(jīng)1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入及/或添加的氨基酸序列、或(3)與序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位構(gòu)成的氨基酸序列的一致性為80%以上的氨基酸序列;
[6]根據(jù)[1]~[5]的任一項(xiàng)所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其為由下述(1)~(3)任一種氨基酸序列構(gòu)成的多肽,且為具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多肽:(1)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列、(2)在序列號(hào)1所表示的氨基酸序列中,經(jīng)1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入及/或添加的氨基酸序列、或(3)與序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的一致性為80%以上的氨基酸序列;
[7]根據(jù)[1]~[6]的任一項(xiàng)所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其不含有膜結(jié)合區(qū)域;
[8]一種多核苷酸,其編碼[1]~[7]任一項(xiàng)所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶;
[9]一種微生物,其具有[8]所述的多核苷酸;
[10]一種載體,其含有包含[8]所述的多核苷酸的DNA;
[11]一種轉(zhuǎn)化體,其具有[10]所述的載體;或
[12]一種類萜的制備方法,其特征在于,培養(yǎng)[11]所述的轉(zhuǎn)化體。
所述[1]所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶可置換為:
[13]一種甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其甲羥戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)的Sα2氨基酸序列中第10位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸,從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸為脯氨酸(P)以外的氨基酸,Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸,Lα2氨基酸序列中第5位的氨基酸為異亮氨酸(I)以外的氨基酸,Lα2氨基酸序列中第6位的氨基酸為谷氨酸(E)以外的氨基酸,且該甲羥戊二酸單酰CoA還原酶與Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為丙氨酸(A)、從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸為脯氨酸(P)、Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸為丙氨酸(A)、Lα2氨基酸序列的第5位的氨基酸為異亮氨酸(I)、Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為谷氨酸(E)、其他的氨基酸序列相同的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶相比較,活性提高;或
[14]根據(jù)[1]所述的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,其所述Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為絲氨酸(S),從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸為丙氨酸(A),Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸為絲氨酸(S),Lα2氨基酸序列的第5位的氨基酸為蘇氨酸(T),Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為天冬酰胺(N)。
發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明的突變酶及使用所述突變酶的類萜的制備方法,可以有效地生產(chǎn)有用的類萜化合物。例如,通過使用本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,在甲羥戊酸路徑中能夠使甲羥戊酸的產(chǎn)量增加。此外,能夠大量有效地產(chǎn)生作為類萜重要的中間體的角鯊烯。
附圖說明
圖1為表示甲羥戊酸路徑及其下游的類萜化合物的產(chǎn)生路徑的概略圖。
圖2為將本發(fā)明的ADK4653HMGR及目前所報(bào)告的HMGR的Sα2附近的氨基酸序列進(jìn)行取平對齊的圖,凡例記號(hào)如下所示:
ADK_HMGR:本發(fā)明的酶的氨基酸序列/HMG1:表示釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(DDBJ的檢索號(hào)M22002)/HMG2:表示來自釀酒酵母菌(DDBJ檢索號(hào)M22255)的酶的氨基酸序列/AF273765:表示來自Homo sapiens(人)的酶的氨基酸序列。(DDBJ:DNA Data Bank of Japan<www.ddbj.nig.ac.jp/>)此外,以下的凡例記號(hào)表示UniProt(Universal Protein Resource<www.uniprot.org/>)的檢索號(hào)。Q6BSE8:表示漢氏德巴利氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)(ATCC 36239)/G3AY61:表示纖維假絲酵母(Candida tenuis)(ATCC 10573)/J8PYR1:表示Saccharomyces arboricola(菌株H-6)/G8B666:表示近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis)(ATCC MYA-4646)/A3LX63:表示樹干畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis)(ATCC 58785)/H2AW26:表示Kazachstania africana(ATCC 22294)/G8Y9W2:表示畢赤酵母(Pichia sorbitophila)(ATCC MYA-4447)/F2QRB0:表示來自Komagataella pastoris(ATCC 76273)的酶的氨基酸序列。
圖3為將本發(fā)明的ADK4653HMGR及目前所報(bào)告的HMGR的HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域及Lα2附近的氨基酸序列進(jìn)行取平對齊的圖,凡例記號(hào)與上述圖2的說明相同。
圖4為表示基于含有全長ADK4653基因的清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)701號(hào))的甲羥戊酸的產(chǎn)生的增加的圖表。
圖5為表示基于含有全長ADK4653基因的清酒酵母的角鯊烯產(chǎn)生的圖表(SQ表示角鯊烯,ERG表示麥角固醇)。
圖6為表示基于含有縮短型ADK4653基因及清酒酵母的縮短型HMGR基因的清酒酵母的角鯊烯產(chǎn)生的圖表(SQ表示角鯊烯,ERG表示麥角固醇)。
圖7-1為對ADK4653HMGR的氨基酸序列及清酒酵母HMGR的氨基酸序列、來自人的酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較的圖。凡例記號(hào)如下所示:ADK_HMGR:本發(fā)明的酶的氨基酸序列/K7HMG1:釀酒酵母菌來自協(xié)會(huì)7號(hào)的酶的氨基酸序列(DDBJ的檢索號(hào)DG000049,CDS114719..117883)/AF273765:來自Homo sapiens(人)的酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列(DDBJ的檢索號(hào)AF273765)。
圖7-2為對ADK4653HMGR的氨基酸序列及清酒酵母HMGR的氨基酸序列、來自人的酶蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較的圖。凡例記號(hào)與上述圖7-1的說明相同。
圖8為表示基于含有全長ADK4653基因或縮短型ADK4653基因的清酒酵母的角鯊烯產(chǎn)生的經(jīng)時(shí)變化的圖表。
圖9為將ADK4653HMGR的Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸(c)由絲氨酸置換為丙氨酸,或?qū)⒌?位的氨基酸(f)由蘇氨酸置換為異亮氨酸,或進(jìn)行其組合的置換,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表。
圖10為將ADK4653HMGR的Sα2氨基酸序列中第10位的氨基酸(a)由絲氨酸置換為丙氨酸,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表。
圖11為將HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)(Lα2區(qū)域的N末端側(cè)到N末端側(cè)第2位的位置上存在的氨基酸)由丙氨酸置換為脯氨酸,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表。
圖12為將ADK4653HMGR的Lα2氨基酸序列中第6位的氨基酸(d)由天冬酰胺置換為谷氨酸,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表。
圖13為對使在清酒酵母(K701菌株)的縮短型HMGR的氨基酸序列中構(gòu)成Sα2的氨基酸的3個(gè)殘基、位于HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)與Lα2之間的氨基酸1個(gè)殘基及構(gòu)成Lα2的氨基酸的3個(gè)殘基中導(dǎo)入突變的突變酶(K701_突變型(Mutant))進(jìn)行表達(dá)的酵母的角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表。具體而言,將清酒酵母(K701菌株)的縮短型HMGR的氨基酸序列中Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸(e)由異亮氨酸置換為亮氨酸,將Sα2區(qū)域的第10位的氨基酸(a)由丙氨酸置換為絲氨酸,將Sα2區(qū)域的第6位的氨基酸(g)由丙氨酸置換為亮氨酸,HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端的第1位的氨基酸(b)(從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位上存在的氨基酸)由脯氨酸置換為丙氨酸,將Lα2區(qū)域的第1位的氨基酸(c)由丙氨酸置換為絲氨酸,將Lα2區(qū)域的第5位的氨基酸(f)由異亮氨酸置換為蘇氨酸,將Lα2區(qū)域的第6位的氨基酸(d)由谷氨酸置換為天冬酰胺,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究。
圖14為將ADK4653HMGR的Sα2氨基酸序列中第6位的氨基酸(g)由亮氨酸置換為丙氨酸(實(shí)施例7),將Sα2氨基酸序列中第7位的氨基酸(e)由亮氨酸置換為異亮氨酸(實(shí)施例8),并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表。
圖15為將清酒酵母(K701菌株)的縮短型HMGR的氨基酸序列中Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸(e)由異亮氨酸置換為亮氨酸,將Sα2區(qū)域的第10位的氨基酸(a)由丙氨酸置換為絲氨酸,將HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)(從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位上存在的氨基酸)由脯氨酸置換為丙氨酸,將Lα2區(qū)域的第1位的氨基酸(c)由丙氨酸置換為絲氨酸,將Lα2區(qū)域的第5位的氨基酸(f)由異亮氨酸置換為蘇氨酸,將Lα2區(qū)域的第6位的氨基酸(d)由谷氨酸置換為天冬酰胺,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表(實(shí)施例9)。
圖16為將清酒酵母(K701菌株)的縮短型HMGR的氨基酸序列中Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸(e)由異亮氨酸置換為亮氨酸,將Sα2區(qū)域的第10位的氨基酸(a)由丙氨酸置換為絲氨酸,將HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)(從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位上存在的氨基酸)由脯氨酸置換為丙氨酸,將Lα2區(qū)域的第1位的氨基酸(c)由丙氨酸置換為絲氨酸,將Lα2區(qū)域的第6位的氨基酸(d)由谷氨酸置換為天冬酰胺,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表(實(shí)施例10)。此外,還為將清酒酵母(K701菌株)的縮短型HMGR的氨基酸序列中Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸(e)由異亮氨酸置換為亮氨酸,將Sα2區(qū)域的第10位的氨基酸(a)由丙氨酸置換為絲氨酸,將Sα2區(qū)域的第6位的氨基酸(g)由丙氨酸置換為亮氨酸,將HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)(從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位上存在的氨基酸)由脯氨酸置換為丙氨酸,將Lα2區(qū)域的第1位的氨基酸(c)由丙氨酸置換為絲氨酸,將Lα2區(qū)域的第6位的氨基酸(d)由谷氨酸置換為天冬酰胺,并對角鯊烯產(chǎn)量進(jìn)行研究的圖表(實(shí)施例11)。
具體實(shí)施方式
[1]甲羥戊二酸單酰CoA還原酶
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶含有:(a)Sα2氨基酸序列中第10位的丙氨酸(A)以外的氨基酸、(b)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的脯氨酸(P)以外的氨基酸、(c)Lα2氨基酸序列中第1位的丙氨酸(A)以外的氨基酸、及(d)Lα2氨基酸序列中第6位的谷氨酸(E)以外的氨基酸。此外,所述Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸(a)優(yōu)選為絲氨酸(S),HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)優(yōu)選為丙氨酸(A),Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸(c)優(yōu)選為絲氨酸(S),Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸(d)優(yōu)選為天冬酰胺(N)。
甲羥戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)可進(jìn)一步含有選自由(e)Sα2氨基酸序列中第7位的異亮氨酸(I)以外的氨基酸、(f)Lα2氨基酸序列中第5位的異亮氨酸(I)以外的氨基酸、及(g)Sα2氨基酸序列中第6位的丙氨酸(A)以外的氨基酸所構(gòu)成的組中的一種或兩種以上的氨基酸。所述Sα2氨基酸序列中第7位的氨基酸優(yōu)選為亮氨酸,Lα2氨基酸序列中第5位的氨基酸優(yōu)選為蘇氨酸,Sα2氨基酸序列中第6位的氨基酸優(yōu)選為亮氨酸。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶與Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸(a)為丙氨酸(A)、HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)為脯氨酸(P)、Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸(c)為丙氨酸(A)、Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸(d)為谷氨酸(E)、Sα2氨基酸序列中第7位的氨基酸(e)為異亮氨酸、Lα2氨基酸序列的第5位的氨基酸(f)為異亮氨酸、Sα2氨基酸序列中第6位的氨基酸(g)為丙氨酸的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶相比,活性提高。
此外,所述“HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(b)”為存在于與“從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位上存在的氨基酸”相同位置的氨基酸。
《甲羥戊二酸單酰CoA還原酶》
甲羥戊二酸單酰CoA還原酶(以下,有時(shí)稱作HMGR)為膜結(jié)合蛋白質(zhì),由膜結(jié)合部位和活性部位構(gòu)成。HMGR在甲羥戊酸路徑中還原3-羥基-3-甲基戊二酸CoA(以下,有時(shí)稱作HMGCoA),從而變換為甲羥戊酸(MVA)的酶。在活性部位上,被稱作模體A~G的區(qū)域從真核生物至真細(xì)菌、古細(xì)菌被高度保存(非專利文獻(xiàn)3)。此外,通過人的HMGR的結(jié)晶解析,Lα1~9、Lβ1~6、Sα1~3、及Sβ1~4的區(qū)域被識(shí)別(非專利文獻(xiàn)4)。
在本發(fā)明中,作為所使用的HMGR優(yōu)選來自真核生物或古細(xì)菌,更優(yōu)選來自真核生物。如上所示雖然HMGR的活性區(qū)域被高度保存,但通過來自真核生物或古細(xì)菌的HMGR,可期待更大的效果。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中,特征性的氨基酸之一為存在于圖2所示的(a)Sα2的區(qū)域的第10位上的丙氨酸(A)以外的氨基酸。其沒有限定,優(yōu)選破壞α螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸,例如絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸或脯氨酸,或者對α螺旋結(jié)構(gòu)無影響的氨基酸,例如異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺,最優(yōu)選為絲氨酸(S)。此外,本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中,特征性的氨基酸之一為圖3所示的(b)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸,從Lα2區(qū)域的N末端向HMGR的N末端側(cè)的第2位的位置上存在的氨基酸為脯氨酸(P)以外的氨基酸。作為脯氨酸(P)以外的氨基酸沒有特別限定,優(yōu)選形成堅(jiān)固α螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸,例如谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、天冬氨酸,或表現(xiàn)容易形成α螺旋結(jié)構(gòu)傾向的氨基酸,例如色氨酸、精氨酸,最優(yōu)選為丙氨酸。
此外,本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中特征性的氨基酸之一為存在于圖3所示的(c)Lα2的區(qū)域的第1位上的丙氨酸(A)以外的氨基酸。其沒有限定,優(yōu)選為破壞α螺旋的結(jié)構(gòu)的氨基酸,例如絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸或脯氨酸,或優(yōu)選為對α螺旋結(jié)構(gòu)無影響的氨基酸,例如異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺,最優(yōu)選為絲氨酸(S)。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中特征性的氨基酸之一為圖3所示的(d)Lα2的區(qū)域的第6位的氨基酸為谷氨酸(E)以外的氨基酸。作為谷氨酸(E)以外的氨基酸沒有特別限定,優(yōu)選為破壞α螺旋的結(jié)構(gòu)的氨基酸,例如絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸或脯氨酸,或優(yōu)選為對α螺旋結(jié)構(gòu)無影響的氨基酸,例如異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺,最優(yōu)選為天冬酰胺(N)。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中所優(yōu)選的氨基酸之一為(e)所述Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸為異亮氨酸(I)以外的氨基酸。作為異亮氨酸(I)以外的氨基酸沒有特別限定,可列舉絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或亮氨酸,特別優(yōu)選具有形成α螺旋結(jié)構(gòu)的性質(zhì)的氨基酸,最優(yōu)選為亮氨酸(L)。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中優(yōu)選的氨基酸之一為存在于圖3所示的(f)Lα2的區(qū)域的第5位上的異亮氨酸(I)以外的氨基酸。其沒有限定,優(yōu)選為破壞α螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸,例如絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸或脯氨酸,或優(yōu)選為對α螺旋結(jié)構(gòu)無影響的氨基酸,例如纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺,最優(yōu)選為蘇氨酸(T)。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中優(yōu)選的氨基酸之一為圖2所示的(g)Sα2區(qū)域的第6位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸。作為丙氨酸(A)以外的氨基酸沒有特別的限定,優(yōu)選為絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺或亮氨酸,最優(yōu)選為亮氨酸(L)。
如表1所示,在所述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)的七個(gè)位置的氨基酸中,(a)、(b)、(c)、(d)四個(gè)位置的氨基酸分別為丙氨酸(A)以外的氨基酸、脯氨酸(P)以外的氨基酸、丙氨酸(A)以外的氨基酸及谷氨酸(E)以外的氨基酸是尤其重要的。具體而言,由比較例3~比較例6的結(jié)果可知,若將ADK4653_tHMGR的(a)、(b)、(c)及(d)的位置的氨基酸的任意一個(gè)置換為K701_tHMGR的氨基酸,則角鯊烯的產(chǎn)量的相對值急劇下降至0~13.9。因此,所述(a)、(b)、(c)及(d)的位置的氨基酸在甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的角鯊烯的產(chǎn)生中是尤其重要的。
更進(jìn)一步,由實(shí)施例6~11的結(jié)果可知,通過使(e)、(f)及(g)三個(gè)位置的氨基酸的任一個(gè)為異亮氨酸(I)以外的氨基酸、異亮氨酸(I)以外的氨基酸或丙氨酸(A)以外的氨基酸,表現(xiàn)出比K701_tHMGR更優(yōu)異的角鯊烯的產(chǎn)量。
由比較例2及實(shí)施例3可知,與K701_tHMGR(a=A,b=P,c=A,d=E,e=I,f=I,g=A)相比較,(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)位置的七個(gè)氨基酸不同的ADK4653_tHMGR(a=S,b=A,c=S,d=N,e=L,f=T,g=L)的角鯊烯的產(chǎn)量顯著優(yōu)異。更進(jìn)一步,由實(shí)施例5可知,通過將K701_tHMGR的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)位置的七個(gè)氨基酸置換為ADK4653_tHMGR的七個(gè)氨基酸,角鯊烯的產(chǎn)量的相對值為92.1,基本與ADK4653_tHMGR相同。ADK4653_tHMGR與K701_tHMGR的氨基酸序列長度不同,縮短型HMGR(tHMGR)的氨基酸序列的同一性為78%。在K701_tHMGR的氨基酸中,通過僅將7個(gè)氨基酸置換為ADK4653_tHMGR的氨基酸,角鯊烯的產(chǎn)量與ADK4653_tHMGR相同,這是值得驚訝的。
所述Sα2的區(qū)域具有12個(gè)氨基酸的長度?,F(xiàn)有所報(bào)告的Sα2的氨基酸序列按順序?yàn)?E/I/S)、E、G、(Q/S/F)、(N/K/S/A)、(L/A/S/T/V)、(I/V/M)、K、(K/N/E)、A、F、(N/D)。就本發(fā)明人等所知,作為Sα2的第10位的氨基酸,現(xiàn)有所報(bào)告的氨基酸僅為丙氨酸(A),沒有報(bào)告具有丙氨酸以外的氨基酸的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。
此外,所述Lα2的區(qū)域具有6個(gè)氨基酸的長度。現(xiàn)有所報(bào)告的Lα2的氨基酸序列按順序?yàn)锳、I、N、W、(I/L)、(E/N)。作為Lα2的第1位的氨基酸,現(xiàn)有所報(bào)告的氨基酸僅為丙氨酸(A),沒有報(bào)告具有丙氨酸以外的氨基酸的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。此外,作為Lα2的第5位的氨基酸所報(bào)告的氨基酸僅為亮氨酸(L)及異亮氨酸(I),沒有報(bào)告具有亮氨酸及異亮氨酸以外的氨基酸的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。更進(jìn)一步,作為Lα2的第6位的氨基酸報(bào)告的氨基酸幾乎全為谷氨酸(E),含有天冬酰胺(N)的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶據(jù)本發(fā)明人等所知只有一種。更進(jìn)一步作為從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸而被報(bào)告的氨基酸幾乎全為脯氨酸(P),只報(bào)告有各具有一個(gè)纈氨酸(V)、丙氨酸(A)或絲氨酸(S)的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。
所述HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)是在HMGR的活性中起到重要作用的區(qū)域。HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的一部份位于從上述Lα2區(qū)域到N末端側(cè)的數(shù)個(gè)氨基酸的位置,天冬氨酸(D)、賴氨酸(K)、賴氨酸(K)的序列被高度保存(非專利文獻(xiàn)4)。
在本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中,所述的(a)~(g)的7個(gè)氨基酸,分別最優(yōu)選(a)丙氨酸(A)以外的氨基酸、(b)脯氨酸(P)以外的氨基酸、(c)丙氨酸(A)以外的氨基酸、(d)谷氨酸(E)以外的氨基酸、(e)異亮氨酸(I)以外的氨基酸、(f)異亮氨酸(I)以外的氨基酸、及(g)丙氨酸(A)以外的氨基酸。然而,(a)~(d)的4個(gè)氨基酸分別可以為所述氨基酸以外的氨基酸。更進(jìn)一步,除了(a)~(d)的4個(gè)氨基酸以外,(e)~(g)的任一個(gè)氨基酸(即5個(gè)氨基酸)也可以是所述氨基酸以外的氨基酸。更進(jìn)一步,除了(a)~(d)的4個(gè)氨基酸以外,(e)~(g)的2個(gè)氨基酸(即6個(gè)氨基酸)也可以是所述氨基酸以外的氨基酸。
更進(jìn)一步,選自(a)~(g)的氨基酸的6個(gè)以上的氨基酸可以為各自的氨基酸以外的。例如,(a)、(b)、(c)、(d)、(f)及(g)的6個(gè)氨基酸可以為各自的氨基酸以外的,(a)~(f)的6個(gè)氨基酸也可以為各自的氨基酸以外的。
與Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為丙氨酸(A)、HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸為脯氨酸(P)、Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸為丙氨酸(A)、Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為谷氨酸(E)、且其他氨基酸序列相同的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶相比,本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性提高。即,通過Sα2氨基酸序列中第10位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸、HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸為脯氨酸(P)以外的氨基酸、Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸、Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為谷氨酸(E)以外的氨基酸,甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性提高。
此外,與Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為丙氨酸(A)、HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸為脯氨酸(P)、Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸為丙氨酸(A)、Lα2氨基酸序列的第5位的氨基酸為異亮氨酸(I)、Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為谷氨酸(E)、且其他氨基酸序列相同的甲基戊二酰CoA還原酶相比,本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性提高。即,通過Sα2氨基酸序列中第10位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸、從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸為脯氨酸(P)以外的氨基酸、Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸、Lα2氨基酸序列中第5位的氨基酸為異亮氨酸(I)以外的氨基酸、Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為谷氨酸(E)以外的氨基酸,甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性提高。
本說明書中,“甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性”基本指還原HMGCoA,變換為甲羥戊酸(MVA)。然而,作為活性的測定方法并不限于測定甲羥戊酸的產(chǎn)生,也可以包括測定甲羥戊酸路徑下游的各種類萜的產(chǎn)生。例如,如實(shí)施例所述,通過測定角鯊烯的積累,可測定甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶可使用公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)等獲得。例如,獲得酵母的mRNA,使用適宜的引物,通過PCR等對甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的基因進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的基因整合到適當(dāng)?shù)妮d體中,確定基因序列。在(a)Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為丙氨酸、(b)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸為脯氨酸、(c)Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸為丙氨酸、(d)Lα2氨基酸序列的第6位的氨基酸為谷氨酸的情況下,通過導(dǎo)入對其以外的氨基酸的突變,能夠獲得編碼本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的基因。更進(jìn)一步,在(e)Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸為異亮氨酸、(f)Lα2氨基酸序列的第5位的氨基酸為異亮氨酸、(g)Sα2區(qū)域的第6位的氨基酸為丙氨酸的情況下,可以導(dǎo)入對其以外的氨基酸的突變。通過將該基因整合到酵母等宿主中,使其表達(dá),可得到本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。
此外,編碼本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的基因可通過公知的合成基因的合成方法進(jìn)行合成,例如Khorana等的方法(Gupta et al.,1968)、Narang等的方法(Scarpulla et al.,1982)或Rossi等的方法(Rossi et al.,1982)。然后通過使合成的基因表達(dá),可得到本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶優(yōu)選為由含有(1)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位的氨基酸序列的多肽構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位的氨基酸序列構(gòu)成的多肽如實(shí)施例所述,表現(xiàn)出甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的優(yōu)異活性。因此,含有序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位的氨基酸序列的多肽也同樣表現(xiàn)出甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的優(yōu)異活性。例如,作為含有序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位的氨基酸序列的多肽,為了提高甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的表達(dá),可列舉在所述多肽的N末側(cè)或C末側(cè)融合谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或組氨酸標(biāo)簽等的融合蛋白質(zhì)。這樣的融合蛋白質(zhì)不損害甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的功能,容易進(jìn)行提純等。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶優(yōu)選為由下述多肽構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,所述多肽為含有在(2)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位構(gòu)成的氨基酸序列中經(jīng)1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入及/或加成的氨基酸序列的多肽,且為具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多肽。
本說明書中,“氨基酸序列中經(jīng)1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入、及/或加成的氨基酸”指通過氨基酸的置換等而發(fā)生改變。氨基酸的改變個(gè)數(shù),優(yōu)選為1~30個(gè),更優(yōu)選為1~10個(gè),進(jìn)一步優(yōu)選為1~5個(gè),最優(yōu)選為1~2個(gè)??捎糜诒景l(fā)明的突變肽的改變氨基酸序列的例子,可優(yōu)選該氨基酸為具有1個(gè)或數(shù)個(gè)(優(yōu)選為1、2、3或4個(gè))的保存性置換的氨基酸序列。
這里的“保存性置換”是指用另外化學(xué)上類似的氨基酸殘基置換1個(gè)或數(shù)個(gè)的氨基酸殘基。例如可列舉,通過其他疏水性殘基置換某個(gè)疏水性殘基的情況下,通過具有相同電荷的其他極性殘基置換某個(gè)極性殘基的情況等。能夠進(jìn)行這樣的置換的在功能上類似的氨基酸,每個(gè)氨基酸在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。作為非極性(疏水性)氨基酸,例如可列舉丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作為極性(中性)氨基酸,例如可列舉甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為帶有正電荷(堿性)氨基酸,可列舉精氨酸、組氨酸、賴氨酸等。此外,作為帶有負(fù)電荷(酸性)的氨基酸,可列舉天冬氨酸、谷氨酸等。
選自由本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中的(a)Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸向丙氨酸(A)以外的氨基酸的置換(突變)、(b)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸)向脯氨酸(P)以外的氨基酸的置換(突變)、(c)Lα2氨基酸序列的第1位的氨基酸向丙氨酸(A)以外的氨基酸的置換(突變)、(f)Lα2氨基酸序列的第5位的氨基酸向異亮氨酸(I)以外的氨基酸的置換(突變)、(d)Lα2氨基酸序列中第6位的氨基酸向谷氨酸(E)以外的氨基酸的置換(突變)、(g)Sα2區(qū)域的第6位的氨基酸向丙氨酸(A)以外的氨基酸的置換(突變)、及(e)Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸向異亮氨酸(I)以外的氨基酸的突變(置換)構(gòu)成的組中的4個(gè)以上的突變(置換),優(yōu)選為5個(gè)以上的突變(置換),更優(yōu)選為6個(gè)以上的突變(置換)最優(yōu)選為7個(gè)的突變(置換)是為了提高甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性的積極的置換(突變),所述保存性置換是為了用于保持甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的置換,本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地進(jìn)行實(shí)施。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶優(yōu)選為由下述多肽構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,所述多肽為含有與(3)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的514位~1022位構(gòu)成的氨基酸序列的一致性為80%以上的氨基酸序列的多肽,且為具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多肽。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶優(yōu)選為(1)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶。由序列號(hào)1所表示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽如實(shí)施例所述,表現(xiàn)出甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的優(yōu)異活性。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶優(yōu)選為由下述多肽構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,所述多肽為在(2)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列中經(jīng)1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入及/或加成的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,且為由具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多肽。這里的“氨基酸序列中經(jīng)1或多個(gè)氨基酸缺失、置換、插入及/或加成的氨基酸”與前述相同,指通過氨基酸的置換等而發(fā)生改變。例如,在序列號(hào)1所表示的氨基酸構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶中,即使第1位~513位的氨基酸缺失,也能表現(xiàn)甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性。因此,特別是在第1位~513位中,可以在不阻礙甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的活性的條件下進(jìn)行缺失、置換或插入。
本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶優(yōu)選為由下述多肽構(gòu)成的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶,所述多肽為由與(3)序列號(hào)1所表示的氨基酸序列的一致性為80%以上的氨基酸序列、更優(yōu)選該一致性為90%以上的氨基酸序列、最優(yōu)選為該一致性為95%以上的氨基酸序列構(gòu)成的多肽,且為具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多肽。此外,其中一致性是指氨基酸序列的相同性。
在本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的優(yōu)選形態(tài)中,不含膜結(jié)合區(qū)域。已知甲羥戊二酸單酰CoA還原酶為由膜結(jié)合(貫通)結(jié)構(gòu)域、連接部位及活性結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì),例如有關(guān)于S.cerevisiae的膜結(jié)合區(qū)域(非專利文獻(xiàn)5)等的記載。
此外,本發(fā)明中“不含膜結(jié)合區(qū)域”是指除了僅不含膜結(jié)合區(qū)域的情況之外,也指同時(shí)不含有一部份的連接區(qū)域的情況。在序列號(hào)1所述的氨基酸序列中,上述膜結(jié)合區(qū)域?yàn)榈?~第513位的氨基酸序列。
[2]多核苷酸
本發(fā)明的多核苷酸只要為編碼本發(fā)明的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的多核苷酸,則沒有特別限定。即,可列舉出編碼(a)Sα2氨基酸序列中第10位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸、(b)HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)的DKK區(qū)域的C末端開始的第1位的氨基酸(從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸)為脯氨酸以外的氨基酸、(c)Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸、(d)Lα2氨基酸序列中第6位的氨基酸為谷氨酸(E)以外的氨基酸的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的多核苷酸。作為本發(fā)明的多核苷酸,除所述的氨基酸外,進(jìn)一步可優(yōu)選例舉出編碼選自由(e)Sα2區(qū)域的第7位的氨基酸為異亮氨酸(I)以外的氨基酸、(f)Lα2氨基酸序列中第5位的氨基酸為異亮氨酸(I)以外的氨基酸、及(g)Sα2區(qū)域的第6位的氨基酸為丙氨酸(A)以外的氨基酸所構(gòu)成的組中的一種或兩種以上氨基酸的甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的多核苷酸。
具體而言,可列舉含有由序列號(hào)2所表示的堿基序列所構(gòu)成的序列的多核苷酸、或含有序列號(hào)2所表示的堿基序列中1540位~3066位的堿基所構(gòu)成的序列的多核苷酸。
更進(jìn)一步,還可以列舉,與由序列號(hào)2所表示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸、或含有由序列號(hào)2所表示的堿基序列中1540位~3066位的堿基構(gòu)成的序列的多核苷酸在嚴(yán)格的條件下雜交,并具有甲羥戊二酸單酰CoA還原酶活性的多核苷酸。此外,本說明書中的用語“多核苷酸”包含DNA及RNA兩者。
本說明書中的“嚴(yán)格的條件”是指只有在序列間存在90%以上的一致性、優(yōu)選為95%以上的一致性、更優(yōu)選為97%以上的一致性時(shí)發(fā)生雜交。具體而言,作為嚴(yán)格的條件,可列舉在65℃下實(shí)施一晚雜交,在室溫下用2×SSC進(jìn)行5分鐘的清洗以去除非特異反應(yīng),然后使用含有0.1%SDS的0.2×SSC,重復(fù)兩次在65℃下進(jìn)行30分鐘的清洗等。2×SSC的組成為0.3mol/L NaCl及30mmol/L檸檬酸鈉(pH7.0).
[3]微生物
本發(fā)明的微生物為具有本發(fā)明的多核苷酸的微生物。即,只要在細(xì)胞內(nèi)含有本發(fā)明的多核苷酸,則沒有特別限定,例如可列舉大腸菌、枯草菌、放線菌、面包酵母或鏈孢霉。
[4]載體
本發(fā)明的載體為含有具有本發(fā)明的多核苷酸的DNA的載體。即,本發(fā)明的載體只要含有本發(fā)明的所述多核苷酸,則沒有特別限定,例如可列舉在根據(jù)所用的宿主細(xì)胞而適當(dāng)選擇的公知的表達(dá)載體中,通過插入本發(fā)明的所述多核苷酸而獲得的載體。
作為表達(dá)載體,優(yōu)選在作為宿主的大腸菌、面包酵母等中可獨(dú)立復(fù)制或可整合到染色體中、外來蛋白質(zhì)的表達(dá)效率高的表達(dá)載體。用于使所述多核苷酸表達(dá)的表達(dá)載體優(yōu)選為在微生物中可獨(dú)立復(fù)制的同時(shí),由啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、所述DNA及轉(zhuǎn)錄終止序列所構(gòu)成的重組載體。此外,也可以含有控制啟動(dòng)子的基因。
更具體而言,作為表達(dá)載體,例如可列舉pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim社市售)、pKK233-2(Pharmacia社制)、pSE280(Invitrogen社制)、pGEMEX-1(Promega社制)、pQE-8(QIAGEN社制)、pQE-30(QIAGEN社制)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)〕、pLSA1[.Agric.Biol.Chem,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescriptII SK+,pBluescriptII SK(-)(Stratagene社制)、pTr S30(FERMBP-5407),pTrS 32(FERM BP-5408),pGEX(Pharmacia社制)、pET-3(Novagen社制)、pTerm2(US4686191,US4939094,US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pUC18[gene,33,103(1985)]、pUC19[Gene,33,103(1985)]、pSTV28(寶酒造社制)、pSTV29(寶酒造社制)、pUC118(寶酒造社制)、pPA1(特開昭63-233798號(hào)公報(bào))、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]等。
作為啟動(dòng)子,只要能在作為宿主的大腸菌、面包酵母等中進(jìn)行表達(dá)則可以為任意。例如可列舉出trp啟動(dòng)子(Ptrp)、lac啟動(dòng)子(Plac)、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、PSE啟動(dòng)子等來自大腸菌或噬菌體等的啟動(dòng)子,SPO1啟動(dòng)子、SPO2啟動(dòng)子、penP啟動(dòng)子等?;蛞部梢允褂弥T如將2個(gè)Ptrp串聯(lián)的啟動(dòng)子(Ptrpx2)、tac啟動(dòng)子、letI啟動(dòng)子、lacT7啟動(dòng)子等經(jīng)人工設(shè)計(jì)改變的啟動(dòng)子等。在本發(fā)明中,在上述啟動(dòng)子中,更優(yōu)選與組織無關(guān)而經(jīng)常使目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子,即組成性啟動(dòng)子。作為組成性啟動(dòng)子,可列舉醇脫氫酶1基因(ADH1)、翻譯延伸因子TF-1α基因(TEF1)、磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)、磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(TPI1)、磷酸丙糖脫氫酶基因(TDH3)、丙酮酸激酶基因(PYK1)的啟動(dòng)子。
[5]轉(zhuǎn)化體
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體只要含有本發(fā)明的所述多核苷酸,則沒有特別限定,例如,可以是本發(fā)明的所述多核苷酸整合到宿主細(xì)胞染色體中的轉(zhuǎn)化體,或者可以是以含有本發(fā)明的所述多核苷酸的載體的形式而包含的轉(zhuǎn)化體。此外,也可以是表達(dá)本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)化體,或者也可以是不表達(dá)本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體例如可以通過本發(fā)明的所述載體、或通過本發(fā)明的所述多核苷酸其自身、通過轉(zhuǎn)化所希望的宿主細(xì)胞而得到。
宿主細(xì)胞沒有特別限定,優(yōu)選大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、鏈孢霉等容易操作的菌株,也可使用昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等。但最優(yōu)選酵母。作為最優(yōu)選的酵母菌株,可列舉清酒酵母。特別優(yōu)選列舉出清酒酵母協(xié)會(huì)7號(hào)或701號(hào)。協(xié)會(huì)701號(hào)酵母為從協(xié)會(huì)7號(hào)培育的無泡酵母,特長在于不形成高泡,其他性質(zhì)則相同。
[6]類萜的制備方法及角鯊烯的制備方法
通過對以表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),可制備類萜或角鯊烯。例如,若對酵母記載,酵母可通過通常使用的YPD培養(yǎng)基等進(jìn)行培養(yǎng)。將通過同源重組進(jìn)行基因?qū)氲慕湍富蚓哂斜磉_(dá)載體的酵母進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),更進(jìn)一步,向YPD培養(yǎng)基等進(jìn)行植菌,然后培養(yǎng)24~240小時(shí)左右,優(yōu)選培養(yǎng)72~120小時(shí)左右。培養(yǎng)基中分泌的類萜或角鯊烯可直接提純使用,或通過公知的方法提純使用。細(xì)胞中積累的類萜或角鯊烯可通過以下方式獲得。即可通過常用技術(shù)例如細(xì)胞的酶處理、超聲波將細(xì)胞破碎后用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑提取,更進(jìn)一步,可通過使用離心分離、各種層析法等進(jìn)行提純。
根據(jù)本發(fā)明可通過提高在類萜生物合成路徑中位于上游的HMGR的活性而有效地生產(chǎn)各種類萜化合物,其中,可特別有效地生產(chǎn)角鯊烯,進(jìn)一步可特別有效地生產(chǎn)經(jīng)由角鯊烯而生物合成的麥角固醇、膽固醇等各種固醇化合物等。
實(shí)施例
以下,通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明,但本發(fā)明并不受其所限。
《實(shí)施例1:HMGR基因的克隆》
在本實(shí)施例中,進(jìn)行HMGR基因的克隆。
使用含有ML-236B的培養(yǎng)基對酵母(扣囊復(fù)膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera))進(jìn)行培養(yǎng),從所得到的ML-236B耐性菌株中獲得HMGR基因(以下,有時(shí)將該從ML-236B耐性菌株中得到的HMGR基因稱為“ADK4653”或“ADK4653基因”)。
(1)來自ML-236B耐性菌株的全長HMGR的獲得
將ML-236B耐性菌株的基因組DNA作為模版,通過PCR法擴(kuò)增HMGR基因。基因組DNA的制備通過Zymolyase 20T(Kirinkyowa-foods社)消化細(xì)胞壁后用常規(guī)方法進(jìn)行,使用NucleoBond AXG 20柱(MACHEREY-NAGEL社)進(jìn)行提純,PCR使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(takara-bio社)、下述引物(序列號(hào)3及4)、熱循環(huán)儀(TP240,takara-bio社)進(jìn)行。
5′-AATCAACTGGTACCCGGGATGTTTAGCCTTAGTAATTATGT-3′
(序列號(hào)3)
5′-TTAGTTAACCTCTAGAGCTCTTAAGATTTGATACAGATCTTTGA-3′
(序列號(hào)4)
PCR以3步驟的反應(yīng)(98℃:10秒,55℃:5秒,72℃:15秒)進(jìn)行35次循環(huán)。在引物的5’末端上加成克隆中使用的載體的克隆位點(diǎn)的同源序列。PCR產(chǎn)物在通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)有無目標(biāo)尺寸的DNA及額外帶之后,使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up柱(MACHEREY-NAGEL社)進(jìn)行提純。
(2)表達(dá)載體的構(gòu)筑
在克隆中使用表達(dá)用載體pAUR123(takara-bio社)。載體經(jīng)限制酶(SacI,takara-bio社)及限制酶(SmaI,takara-bio社)處理后,通過瓊脂糖凝膠電泳切取目標(biāo)DNA片段,使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up柱(MACHEREY-NAGEL社)進(jìn)行提純。對HMGR基因的載體的克隆則使用GeneArt Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Inbitrogen社),按照操作說明書進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)液直接通過大腸菌感受態(tài)細(xì)胞(HST08,takara-bio社)進(jìn)行轉(zhuǎn)化而使用。陽性克隆在確認(rèn)通過菌落PCR導(dǎo)入目標(biāo)基因之后,使用NucleoSpin質(zhì)粒(MACHEREY-NAGEL社)制備質(zhì)粒。菌落PCR使用TaKaRa Ex Taq(takara-bio社)、引物(序列號(hào)5及6)。用小片或牙簽拾取極微量的通過轉(zhuǎn)化而得到的大腸菌菌落,將其懸濁于PCR反應(yīng)液中。PCR反應(yīng)在94℃下進(jìn)行1分鐘的變性處理后,在進(jìn)行30循環(huán)的由98℃:10秒、61℃:30秒、72℃:3分鐘構(gòu)成的反應(yīng)工序后,在72℃下附加3分鐘的擴(kuò)展反應(yīng)。在PCR后,通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)有無插入,獲得ML-236B耐性菌株的全長HMGR(以下有時(shí)稱作“ADK4653_HMGR”)表達(dá)載體
5′-TCTGCACAATATTTCAAGC-3′
(序列號(hào)5)
5′-TTCGTTTTAAAACCTAAGAGTCAC-3′
(序列號(hào)6)
(3)縮短型HMGR(tHMGR)基因的克隆
以上述ML-236B耐性菌株的基因組DNA作為模版,通過PCR法擴(kuò)增縮短型HMGR基因?;蚪MDNA的制備為,通過常用方法提取DNA后,使用NucleoBond AXG20柱(MACHEREY-NAGEL社)提純。PCR使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(takara-bio社),3步驟的反應(yīng)(98℃:10秒,55℃:5秒,72℃:10秒)進(jìn)行35次循環(huán)。PCR引物使用序列號(hào)7及8。
5′-AATCAACTGGTACCCGGGATGTCTCAACGTCTTAGCAAGGCTAT T-3′
(序列號(hào)7)
5′-TTAGTTAACCTCTAGAGCTCTTAAGATTTGATACAGATCTTTGA-3′
(序列號(hào)8)
在引物的5’末端加成克隆中使用的載體的克隆位點(diǎn)的同源序列。
PCR產(chǎn)物在通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后,使用NucleoSpin Gel and PCR Clean-up柱(MACHEREY-NAGEL社)進(jìn)行提純。在克隆中使用表達(dá)用載體pAUR123(takara-bio社),通過GemeArt Seamless Clonig and Assembly Enzyme Mix(Inbitrogen社)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)液直接通過大腸菌感受態(tài)細(xì)胞(HST08,takara-bio社)的轉(zhuǎn)化而使用。陽性克隆在確認(rèn)通過菌落PCR導(dǎo)入目標(biāo)基因后,使用NucleoSpin質(zhì)粒(MACHEREY-NAGEL社)制備質(zhì)粒。通過序列解析確認(rèn)在克隆的縮短型HMGR基因中不含有PCR反應(yīng)造成的錯(cuò)誤。序列解析以提純的質(zhì)粒為模版,使用序列號(hào)5及6所示的引物通過DNA序列分析儀(Applied Biosystems社,3730xl)進(jìn)行分析,獲得ML-236B耐性菌株的縮短型HMGR(以下有時(shí)稱作“ADK4653_tHMGR”)的表達(dá)載體。
《比較例1》
在本比較例中從清酒酵母中進(jìn)行縮短型HMGR(tHMGR)基因的克隆。
除了使用清酒酵母(Saccharomycescerevisiae協(xié)會(huì)701號(hào))替代ML-236B耐性菌株,及使用作為引物的序列號(hào)9及10的引物以外,重復(fù)實(shí)施例1(3)的操作,構(gòu)筑清酒酵母的縮短型HMGR(以下有時(shí)稱作“K701_tHMGR”)的表達(dá)載體。
5′-AATCAACTGGTACCCGGGATGGACCAATTGGTGAAAACT-3′
(序列號(hào)9)
5′-TTAGTTAACCTCTAGAGCTCTTAGGATTTAATGCA-3′
(序列號(hào)10)
《實(shí)施例2》
在本實(shí)施例中,使用實(shí)施例1(2)中得到的載體,得到酵母的轉(zhuǎn)化體。使用該轉(zhuǎn)化體,進(jìn)行甲羥戊酸的生產(chǎn)及角鯊烯或麥角固醇的生產(chǎn)。
(1)酵母的轉(zhuǎn)化
使用在實(shí)施例1(2)中得到的全長HMGR表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)701號(hào))。載體預(yù)先通過限制酶(EcoO65I(BstEII,BstPI),takara-bio社)在抗性標(biāo)記基因內(nèi)的一處切斷,通過以直鏈狀使用,進(jìn)行基于同源重組的基因?qū)?。即在與作為載體的抗性標(biāo)記的金黃擔(dān)子素抗性基因(AUR-C)表現(xiàn)出一致性的宿主酵母的感受性基因部位上,引發(fā)同源重組,在宿主酵母的感受性基因部位插入載體基因。酵母的轉(zhuǎn)化使用冷凍-EZ酵母轉(zhuǎn)化(Frozen-EZ Yeast Transformation)II(ZYMO RESARCH社),以作為常用方法的醋酸鋰法為標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化體以含有0.5μg/mL抗生素(金黃擔(dān)子素A,takara-bio社)的YPD培養(yǎng)基進(jìn)行選拔。所得到的克隆確認(rèn)通過菌落PCR導(dǎo)入目標(biāo)基因。在菌落PCR中使用Tks Gflex DNA聚合酶(takara-bio社)、引物(序列號(hào)5及6)。拾取極微量酵母菌落,在細(xì)胞壁消化酶液(Zymolyase 20T,Kirinkyowa-foods社,3mg/mL,pH7.4)中懸濁,在37℃下反應(yīng)15分鐘,消化細(xì)胞壁。將酶處理反應(yīng)液作為模版DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)在94℃下進(jìn)行1分鐘的變性處理后,進(jìn)行30次循環(huán)由98℃:10秒、60℃:15秒、68℃:90秒構(gòu)成的反應(yīng)工序后,在68℃下附加2分鐘的擴(kuò)展反應(yīng)。在PCR后通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)插入。
(2)甲羥戊酸、角鯊烯或麥角固醇的產(chǎn)生的確認(rèn)
ADK4653基因通過表達(dá)用載體pAUR123(takara-bio社)的構(gòu)成表達(dá)啟動(dòng)子(ADH1基因的啟動(dòng)子)進(jìn)行組成性表達(dá)。通過測定作為該路徑代謝產(chǎn)物的甲羥戊酸、角鯊烯或麥角固醇,確認(rèn)到除了清酒酵母本來具有的HMGR基因之外,通過經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入的ADK4653基因的過剩表達(dá),甲羥戊酸路徑增強(qiáng)。對照實(shí)驗(yàn)區(qū)將通過未插入插入片段的載體的轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體作為對照組。
培養(yǎng)使用容量500mL的帶有擋板的三角燒瓶,將在50mL YPD培養(yǎng)基(葡萄糖5%)中添加培養(yǎng)基的1%量的預(yù)培養(yǎng)了24小時(shí)的菌體,以28℃、250rpm旋轉(zhuǎn)攪拌的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在規(guī)定的時(shí)間中取樣。甲羥戊酸、角鯊烯及麥角固醇的定量通過以下方式進(jìn)行。
(甲羥戊酸的定量)
甲羥戊酸,測定培養(yǎng)基中分泌生產(chǎn)的甲羥戊酸濃度。通過直接HPLC分析培養(yǎng)液的離心上清。HPLC通過HITACHI社LaChrom(Column Oven L-2300,Pump L-2130,Autosampler L-2200,UV Detector L-2400),使用柱(Thermo SCIENTIFIC社,AQUASIL C18)。洗脫液為水:三乙胺:乙酸=1000:1:1的等度洗脫,設(shè)定為柱溫度40℃、流量1.0mL/min,檢測通過UV(210nm)分析。
(角鯊烯及麥角固醇的定量)
將菌體破碎后用氯仿-甲醇提取,測定角鯊烯、麥角固醇。將2mL培養(yǎng)液離心,去除上清后,以容積計(jì)向菌體中添加0.6mL用于破碎的鋯珠(Nikkato社,YTZ珠,)、0.4mL甲醇,使用珠式破碎機(jī)(Taitec社,uT-12)進(jìn)行5分鐘粉碎(3200r/min)。向破碎液中加入0.8mL氯仿,翻倒攪拌至均勻。通過5分鐘超聲波處理、懸濁后,進(jìn)行離心分離(16000rpm,5min),回收有機(jī)層。樣本經(jīng)過濾器(ADVANTEC社,DISMIC-13HP)處理后提供于HPLC分析。HPLC通過日本分光工業(yè)社的系統(tǒng)(JASCO Intelligent HPLC Pump 880-PU,Ternary Gradient Umit 880-02,Intelligent UV/VIS Detector 870-UV,Senshu Scientific社,SSC-2100,GL Sciences Degassing Unit DG660B),使用柱(SIGMA-ALDRICH社,SUPELCOSIL LC-18)。洗脫液為乙腈:THF=8:2的等度洗脫,設(shè)定柱溫度30℃,流量1.0mL/min,檢測通過UV(220nm)分析。
甲羥戊酸的產(chǎn)生的結(jié)果如圖4所示。在使ADK4653_HMGR表達(dá)的宿主中,積累了對照組的2-2.8倍(185-355mg/L)的甲羥戊酸。
此外,角鯊烯及麥角固醇的產(chǎn)生的結(jié)果如圖5所示的。沒有確認(rèn)到使ADK4653_HMGR表達(dá)的清酒酵母的麥角固醇量的顯著變化。另一方面,角鯊烯的生產(chǎn)量表現(xiàn)出顯著增加,可確認(rèn)到甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。
此外,圖4、5的“無插入片段(no insert)”表示導(dǎo)入不含外部基因的pAUR123載體,不表達(dá)外部基因的條件。此外,ADK表示ADK4653。(以下的圖表相同。)
《實(shí)施例3》
本實(shí)施例中,使用實(shí)施例1(3)得到的載體,獲得酵母的轉(zhuǎn)化體。使用該轉(zhuǎn)化體,進(jìn)行角鯊烯或麥角固醇的產(chǎn)生。
除了使用ADK4653_tHMGR表達(dá)載體替代ADK4653_HMGR表達(dá)載體之外,重復(fù)實(shí)施例2(1)及(2)的操作。其結(jié)果如圖6所示。
《比較例2》
本比較例中,使用比較例1中得到的K701_tHMGR表達(dá)載體,研究角鯊烯的生產(chǎn)性。除了使用K701_tHMGR表達(dá)載體替代ADK4653_tHMGR表達(dá)載體之外,重復(fù)實(shí)施例3的操作,確認(rèn)到角鯊烯的產(chǎn)生(培養(yǎng)時(shí)間為5天)。其結(jié)果如圖6所示。
如圖6所示,若使用ADK4653_tHMGR替代ADK4653_HMGR進(jìn)行表達(dá),與ADK4653_HMGR相比較,表現(xiàn)出12倍的角鯊烯生產(chǎn)性。培養(yǎng)基中的角鯊烯生產(chǎn)量達(dá)到1.66g/L,干燥菌體的生產(chǎn)量表現(xiàn)為102mg/g(10.2%)。另一方面,在比較例2的K701_tHMGR中,未確認(rèn)到角鯊烯的增產(chǎn)效果。
所述ADK4653_HMGR及清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)7號(hào))的HMGR、人(Homo sapiens,AF273765)HMGR的氨基酸序列的比較如圖7-1及圖7-2所示。如圖7-1及圖7-2所示,在從清酒酵母得到的HMGR中,Sα2氨基酸序列的第10位的氨基酸為丙氨酸,與此相對,ADK4653_HMGR為絲氨酸。此外,在從清酒酵母得到的HMGR中,從Lα2氨基酸序列的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的氨基酸為脯氨酸,與此相對,ADK4653_HMGR為丙氨酸。此外,在從清酒酵母得到的HMGR中,Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸為丙氨酸,第5位的氨基酸為異亮氨酸,第6位的氨基酸為谷氨酸,與此相對,在ADK4653_HMGR中分別為絲氨酸及蘇氨酸及天冬酰胺。
此外,上述清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)7號(hào))與清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)701號(hào))的縮短型HMGR部分中的氨基酸序列相同。
《實(shí)施例4》
在本實(shí)施例中,對由ADK4653_tHMGR造成的角鯊烯生產(chǎn)量的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行了研究。
除了將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為3天、4天、5天、6天、7天或10天、或者3天、5天、7天或10天以外,重復(fù)實(shí)施例3的操作,測定角鯊烯的生產(chǎn)量。此外,同時(shí)測定細(xì)胞的重量變化。結(jié)果如圖8所示。
在使ADK4653_tHMGR表達(dá)的酵母中,與對照組(無插入片段)相比較,表現(xiàn)出顯著的角鯊烯生產(chǎn)量。此外,細(xì)胞在達(dá)到靜止期3天以后的角鯊烯量的變化少,通過3天內(nèi)的培養(yǎng)可獲得充分的收益量。另一方面,麥角固醇的含量則沒有確認(rèn)到對照組(無插入片段)與表達(dá)縮短型的基因(ADK4653_tHMGR)的酵母的差異。
《比較例3》
在本比較例中,使用在實(shí)施例1(3)中得到的ADK4653_tHMGR表達(dá)載體,進(jìn)行Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸的絲氨酸向丙氨酸的置換、或進(jìn)行Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸的絲氨酸向丙氨酸的置換與第5位的氨基酸的蘇氨酸向異亮氨酸的置換的組合,研究角鯊烯生產(chǎn)量。此外,K701_tHMGR作為比較對象(以下,比較例4~6也相同)。
角鯊烯生產(chǎn)量的測定通過以實(shí)施例2(2)為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行。培養(yǎng)為使用帶隔板的三角燒瓶,在YPD培養(yǎng)基(葡萄糖5%)中添加經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的菌體,以28℃、250rpm進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在2天的培養(yǎng)后,回收培養(yǎng)菌體,測定角鯊烯產(chǎn)量。
以所述ADK4653_tHMGR表達(dá)載體作為模版,導(dǎo)入氨基酸置換突變。具體而言,制備將Lα2區(qū)域的第1位的氨基酸由絲氨酸置換為丙氨酸的S820A載體,及將第1位的氨基酸由絲氨酸置換為丙氨酸、第5位的氨基酸由蘇氨酸置換為異亮氨酸的S820A/T824I載體。將得到的S820A載體或S820A/T824I載體導(dǎo)入到作為宿主的清酒酵母,獲得過剩表達(dá)的S820A菌株或S820A/T824I菌株。將各自菌株的角鯊烯產(chǎn)量作為指標(biāo),比較甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。結(jié)果如圖9所示。角鯊烯的產(chǎn)量以每組培養(yǎng)液的生產(chǎn)量為基礎(chǔ),將不導(dǎo)入突變的ADK4653_tHMGR的產(chǎn)量設(shè)為100%,以相對值表示(圖10~圖16也相同)。
此外,導(dǎo)入了突變的表達(dá)載體的制備以使用PrimeSTAR DNA聚合酶(takara-bio社),通過PCR法按照操作說明書(PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit產(chǎn)品編碼R046A)進(jìn)行。用滅菌蒸餾水稀釋導(dǎo)入突變的質(zhì)粒,以使反應(yīng)液中為2pg/μL的方式添加。以使最終濃度為0.2μM的方式添加引物,PCR以3步驟(98℃:10秒、55℃:15秒、72℃:45秒)進(jìn)行40次循環(huán),通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)到目標(biāo)尺寸的擴(kuò)增產(chǎn)物。向20μL感受態(tài)細(xì)胞(JM109,takara-bio社)中添加0.4μL PCR反應(yīng)液,進(jìn)行轉(zhuǎn)化。從通過轉(zhuǎn)化得到的大腸菌中提純導(dǎo)入有突變的質(zhì)粒,解析編碼HMGR的結(jié)構(gòu)基因的堿基序列。通過堿基序列的解析,驗(yàn)證突變導(dǎo)入的正確性(作為目標(biāo)的突變被導(dǎo)入、不存在不想要的PCR錯(cuò)誤)。通過導(dǎo)入了突變的表達(dá)載體,對作為宿主的清酒酵母實(shí)施轉(zhuǎn)化,解析角鯊烯的生產(chǎn)性。突變導(dǎo)入用引物以合成下述的引物進(jìn)行使用(序列號(hào)11、12、15及16)。
在Lα2氨基酸序列中第1位的氨基酸的絲氨酸置換為丙氨酸的情況下,角鯊烯產(chǎn)量降低,在同時(shí)置換2個(gè)氨基酸的突變體中,幾乎不表現(xiàn)高生產(chǎn)性。
由以上結(jié)果可知,與HMG-CoA結(jié)合部位相鄰的模體(Lα2)上存在的絲氨酸及蘇氨酸,是與角鯊烯的高生產(chǎn)性相關(guān)的重要的氨基酸殘基。突變酶(S820A)
5′-GCCATTAACTGGACCAATGGTCGTGGTAAGAGT-3′
(序列號(hào)11)
5′-GGTCCAGTTAATGGCAGCGGCTTTCTTATCAGT-3′
(序列號(hào)12)
突變酶(S820A/T824I)
5′-GCCATTAACTGGATCAATGGTCGTGGTAAGAGT-3′
(序列號(hào)15)
5′-GATCCAGTTAATGGCAGCGGCTTTCTTATCAGT-3′
(序列號(hào)16)
《比較例4》
在本比較例中,使用由實(shí)施例1(3)得到的ADK4653_tHMGR表達(dá)載體,將Sα2氨基酸序列在第10位的氨基酸由絲氨酸置換為丙氨酸,研究角鯊烯產(chǎn)量。培養(yǎng)為重復(fù)比較例3的操作,之后測定角鯊烯的產(chǎn)量。結(jié)果如圖10所示。其結(jié)果,在將第10位的氨基酸由絲氨酸置換為丙氨酸的突變體中,幾乎未表現(xiàn)出高生產(chǎn)性。
突變酶(S744A)
5′-TGAAAAAAGCTTTCAATTCTACTTCTA-3′
(序列號(hào)17)
5′-ATTGAAAGCTTTTTTCAACAAGTTTTG-3′
(序列號(hào)18)
《比較例5》
在本比較例中使用在實(shí)施例1(3)中得到的ADK4653_tHMGR表達(dá)載體將位于HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)與Lα2之間的第818位的氨基酸由丙氨酸置換為脯氨酸,研究角鯊烯產(chǎn)量。培養(yǎng)除了將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為3天以外,重復(fù)比較例3的操作,之后測定角鯊烯的產(chǎn)量。結(jié)果如圖11所示。其結(jié)果,在將第818位的氨基酸由丙氨酸置換為脯氨酸的突變體中,幾乎未表現(xiàn)出高生產(chǎn)性。
突變酶(A818P)
5′-TGATAAGAAACCAGCTTCTATTAACTG-3′
(序列號(hào)19)
5′-GCTGGTTTCTTATCAGTACAGTAGTTA-3′
(序列號(hào)20)
《比較例6》
在本比較例中,使用實(shí)施例1(3)中得到的ADK4653_tHMGR表達(dá)載體,將第825位的氨基酸由天冬酰胺置換為谷氨酸,研究角鯊烯產(chǎn)量。培養(yǎng)除了將培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為3天以外,重復(fù)比較例3的操作,之后測定角鯊烯的產(chǎn)量。結(jié)果如圖12所示。其結(jié)果,將第825位的氨基酸由天冬酰胺置換為谷氨酸的突變體中,幾乎未表現(xiàn)出高生產(chǎn)性。
突變酶(N825E)
5′-TGGACCGAAGGTCGTGGTAAGAGTATTG-3′
(序列號(hào)21)
5′-ACGACCTTCGGTCCAGTTAATAGAAGCG-3′
(序列號(hào)22)
《實(shí)施例5》
在本實(shí)施例中,使用比較例1中得到的K701_tHMGR表達(dá)載體,向構(gòu)成Sα2區(qū)域的氨基酸的3個(gè)殘基、位于HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)與Lα2區(qū)域之間的氨基酸的1個(gè)殘基及構(gòu)成Lα2區(qū)域的氨基酸的3個(gè)殘基中導(dǎo)入突變,制備突變酶,研究角鯊烯產(chǎn)量。
以下,對突變導(dǎo)入進(jìn)行具體說明。此外,本實(shí)施例中對突變部位進(jìn)行特定的號(hào)以圖7-1及圖7-2所示的清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)7號(hào))的序列號(hào)進(jìn)行代用。如上所述,雖然本申請中使用的是清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)701號(hào)),但由于活性部位(縮短型HMGR部分)的氨基酸序列與清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)7號(hào))相同,因此在本申請中用于位置特定。
如圖7-1及圖7-2所示,清酒酵母(釀酒酵母菌協(xié)會(huì)701號(hào))的Sα2區(qū)域的氨基酸序列為EEGQNAIKKAFN,HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)~Lα2區(qū)域的氨基酸序列為DKKPAAINWIE。
在K701_tHMGR表達(dá)載體中,以使Sα2區(qū)域的氨基酸序列為EEGQNLLKKSFN,且使HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)~Lα2區(qū)域的氨基酸序列為DKKAASINWTN的方式導(dǎo)入氨基酸置換突變。即,將存在于Sα2區(qū)域的第6位的丙氨酸(第772位)置換為亮氨酸,將存在于Sα2區(qū)域的第7位的異亮氨酸(第773位)置換為亮氨酸,將存在于Sα2區(qū)域的第10位的丙氨酸(第776位)置換為絲氨酸。并在HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)之后,將存在于從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的脯氨酸(第850位)置換為丙氨酸,更進(jìn)一步將存在于Lα2區(qū)域的第1位的丙氨酸(第852位)置換為絲氨酸,將存在于Lα2區(qū)域的第5位的異亮氨酸(第856位)置換為蘇氨酸,將存在于Lα2區(qū)域的第6位的谷氨酸(第857位)置換為天冬酰胺。
氨基酸置換突變的導(dǎo)入以所述K701_tHMGR表達(dá)載體作為模版,使用與比較例3相同的方法,在重復(fù)改變引物的操作的同時(shí),通過導(dǎo)入順序突變,構(gòu)筑置換了7個(gè)氨基酸殘基的載體。突變導(dǎo)入用引物將下述的引物合成而使用(序列號(hào)23~32)。
將構(gòu)筑的載體導(dǎo)入到作為宿主的清酒酵母中,獲得K701_突變型菌株,將各菌株的角鯊烯產(chǎn)量作為指標(biāo),比較甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。角鯊烯產(chǎn)量的測定通過以實(shí)施例2(2)為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行。培養(yǎng)則使用帶擋板的三角燒瓶,向YPD培養(yǎng)基(葡萄糖5%)添加經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的菌體,在28℃、250rpm下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在2天培養(yǎng)后,回收培養(yǎng)菌體,測定角鯊烯產(chǎn)量。此外,將ADK4653_tHMGR及K701_tHMGR作為比較對象。結(jié)果如圖13所示。使置換了7個(gè)殘基的氨基酸的突變酶進(jìn)行表達(dá)的酵母的角鯊烯產(chǎn)量,與K701_tHMGR相比顯著增加,表現(xiàn)出與ADK4653_tHMGR同等的產(chǎn)量。
從以上結(jié)果可知,與NADP(H)結(jié)合部位相鄰的模體(Sα2)及與HMG-CoA結(jié)合部位相鄰的模體(Lα2)附近所存在的7個(gè)殘基的氨基酸,是與角鯊烯的高生產(chǎn)性相關(guān)的重要氨基酸,通過導(dǎo)入了該突變的突變酶的表達(dá),使甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)變?yōu)榭赡堋?/p>
突變酶(K701_突變型:A852S/I856T)
5′-TCTATCAACTGGACCGAAGGTCGTGGTAAGAGT-3′
(序列號(hào)23)
5′-GGTCCAGTTGATAGAAGCTGGTTTTTTGTCGGT-3′
(序列號(hào)24)
突變酶(K701_突變型:A776S)
5′-AAAAAATCATTTAACTCTACATCAAGA-3′
(序列號(hào)25)
5′-GTTAAATGATTTTTTAATTTGCGTTTTG-3′
(序列號(hào)26)
突變酶(K701_突變型:E857N)
5′-TGGACCAATGGTCGTGGTAAGAGTGTC-3′
(序列號(hào)27)
5′-ACGACCATTGGTCCAGTTGATAGAAGC-3′
(序列號(hào)28)
突變酶(K701_突變型:P850A)
5′-CGACAAAAAAGCCGCTTCTATCAACTG-3′
(序列號(hào)29)
5′-GCGGCTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTA-3′
(序列號(hào)30)
突變酶(K701_突變型:A772L/I773L)
5′-AAAACTTGTTGAAAAAATCATTTAACTC-3′
(序列號(hào)31)
5′-TTTTCAACAAGTTTTGTCCCTCTTCTG-3′
(序列號(hào)32)
《實(shí)施例6》
在本實(shí)施例中,使用實(shí)施例1(3)中得到的ADK4653_tHMGR表達(dá)載體,Lα2氨基酸序列中第5位氨基酸的蘇氨酸置換為異亮氨酸,研究角鯊烯產(chǎn)量。
作為突變導(dǎo)入用引物,除了使用下述的序列號(hào)13及14的引物以外,重復(fù)比較例3的操作,得到T824I載體。將T824I載體導(dǎo)入清酒酵母,獲得T824I菌株。以角鯊烯產(chǎn)量作為指標(biāo),比較甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。結(jié)果如圖9所示。
在Lα2氨基酸序列中第5位氨基酸的蘇氨酸置換為異亮氨酸的情況下,角鯊烯產(chǎn)量為ADK4653_tHMGR的50.3%,但與K701_tHMGR相比顯著提高。
突變酶(T824I)
5′-TCTATTAACTGGATCAATGGTCGTGGTAAGAGT-3′
(序列號(hào)13)
5′-GATCCAGTTAATAGAAGCGGCTTTCTTATCAGT-3′
(序列號(hào)14)
《實(shí)施例7及8》
在本實(shí)施例中,使用實(shí)施例1(3)中得到的ADK4653_tHMGR表達(dá)載體,將第740位的氨基酸由亮氨酸置換為丙氨酸,或?qū)⒌?41位的氨基酸由亮氨酸置換為異亮氨酸,測定角鯊烯產(chǎn)量。突變的導(dǎo)入通過與比較例3相同的方法,使用下述的引物進(jìn)行。
培養(yǎng)為重復(fù)比較例3的操作,測定角鯊烯的產(chǎn)量。結(jié)果如圖14所示。其結(jié)果,在將第740位的氨基酸由亮氨酸置換為丙氨酸的情況下,角鯊烯產(chǎn)量為ADK4653_tHMGR的54.2%,但與K701_tHMGR相比顯著提高。此外,在將第741位的氨基酸由亮氨酸置換為異亮氨酸的情況下,角鯊烯產(chǎn)量為ADK4653_tHMGR的18.8%,但與K701_tHMGR相比顯著提高。
突變酶(L740A)
5′-AAAACGCATTGAAAAAATCATTCAATTC-3′
(序列號(hào)33)
5′-TTTTCAATGCGTTTTGACCTTCTTCAGTA-3′
(序列號(hào)34)
突變酶(L741I)
5′-ACTTGATTAAAAAATCATTCAATTCTA-3′
(序列號(hào)35)
5′-ATTTTTTAATCAAGTTTTGACCTTCTTCA-3′
(序列號(hào)36)
《實(shí)施例9》
在本實(shí)施例中,使用在比較例1中得到的K701_tHMGR表達(dá)載體,除了將向構(gòu)成Sα2區(qū)域的氨基酸中導(dǎo)入的突變由3個(gè)殘基變?yōu)?個(gè)殘基以外,以與實(shí)施例5相同的方式制備突變酶,研究角鯊烯產(chǎn)量(對突變部位進(jìn)行特定的序號(hào)的定義與實(shí)施例5相同。)
即,在K701_tHMGR表達(dá)載體中,以使Sα2區(qū)域的氨基酸序列為EEGQNALKKSFN、且HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)~Lα2區(qū)域的氨基酸序列為DKKAASINWTN的方式導(dǎo)入氨基酸置換突變。即,將存在于Sα2區(qū)域的第7位的異亮氨酸(第773位)置換為亮氨酸,將存在于Sα2區(qū)域的第10位的丙氨酸(第776位)置換為絲氨酸。且在HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)之后,將存在于從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的脯氨酸(第850位)置換為丙氨酸,更進(jìn)一步,將存在于Lα2區(qū)域的第1位的丙氨酸(第852位)置換為絲氨酸,將存在于Lα2區(qū)域的第5位的異亮氨酸(第856位)置換為蘇氨酸,將存在于Lα2區(qū)域的第6位的谷氨酸(第857位)置換為天冬酰胺。
氨基酸置換突變的導(dǎo)入以所述K701_tHMGR表達(dá)載體為模版,以與比較例3相同的方法,重復(fù)改變引物的操作,通過導(dǎo)入順序突變,構(gòu)筑置換了6個(gè)殘基的氨基酸的載體。突變導(dǎo)入用引物使用在實(shí)施例5中所使用的引物(序列號(hào)23~30),及將下述的引物進(jìn)行合成而使用(序列號(hào)37~38)。
將所構(gòu)筑的載體導(dǎo)入到作為宿主的清酒酵母中,獲得K701_突變型2菌株。將各菌株的角鯊烯產(chǎn)量作為指標(biāo),比較甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。角鯊烯產(chǎn)量的測定使用以實(shí)施例2(2)為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行。培養(yǎng)則使用帶擋板的三角燒瓶,向YPD培養(yǎng)基(葡萄糖5%)添加經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的菌體,在28℃、250rpm下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在2天培養(yǎng)后,回收培養(yǎng)菌體,將ADK4653_tHMGR、K701_tHMGR作為比較對象,測定角鯊烯產(chǎn)量。結(jié)果如圖15所示。對置換了6個(gè)殘基的氨基酸的突變酶(K701_突變型2)進(jìn)行表達(dá)的酵母的角鯊烯產(chǎn)量與K701_tHMGR相比顯著增加。
突變酶(K701_突變型:I773L)
5′-ACGCATTGAAAAAATCATTTAACTCTA-3′
(序列號(hào)37)
5′-ATTTTTTCAATGCGTTTTGTCCCTCTTC-3′
(序列號(hào)38)
《實(shí)施例10》
在本實(shí)施例中,使用在比較例1中得到的K701_tHMGR表達(dá)載體,除了將構(gòu)成Sα2區(qū)域的氨基酸中導(dǎo)入的突變由3個(gè)殘基變?yōu)?個(gè)殘基,且構(gòu)成Lα2區(qū)域的氨基酸中導(dǎo)入的突變由3個(gè)殘基變?yōu)?個(gè)殘基以外,以與實(shí)施例5相同的方式制備突變酶,研究角鯊烯產(chǎn)量(對突變部位進(jìn)行特定的序號(hào)的定義與實(shí)施例5相同。)。
即,在K701_tHMGR表達(dá)載體中,以使Sα2區(qū)域的氨基酸序列為EEGQNALKKSFN,且HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)~Lα2區(qū)域的氨基酸序列為DKKAASINWIN的方式導(dǎo)入氨基酸置換突變。即,將存在于Sα2區(qū)域的第7位的異亮氨酸(第741位)置換為亮氨酸,將存在于Sα2區(qū)域的第10位的丙氨酸(第776位)置換為絲氨酸。且在HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)之后,將存在于從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的脯氨酸(第850位)置換為丙氨酸,更進(jìn)一步,將存在于Lα2區(qū)域的第1位的丙氨酸(第852位)置換為絲氨酸,將存在于Lα2區(qū)域的第6位的谷氨酸(第857位)置換為天冬酰胺。
突變導(dǎo)入為,通過所述引物(序列號(hào)23~29及37~38)導(dǎo)入突變,更進(jìn)一步,通過下述的引物(序列號(hào)39~40)導(dǎo)入回復(fù)突變。
氨基酸置換突變的導(dǎo)入以所述K701_tHMGR表達(dá)載體作為模版,以與比較例3相同的方法,重復(fù)改變引物的操作,同時(shí)導(dǎo)入順序突變,由此構(gòu)筑置換了5個(gè)殘基的氨基酸的載體。
將構(gòu)筑的載體導(dǎo)入到作為宿主的清酒酵母中,獲得K701_突變型3菌株。將各菌株的角鯊烯產(chǎn)量作為指標(biāo),比較甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。角鯊烯產(chǎn)量的測定使用以實(shí)施例2(2)為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行。培養(yǎng)則使用帶擋板的三角燒瓶,向YPD培養(yǎng)基(葡萄糖5%)添加經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的菌體,在28℃、250rpm下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在2天培養(yǎng)后,回收培養(yǎng)菌體,以ADK4653_tHMGR、K701_tHMGR作為比較對象測定角鯊烯產(chǎn)量。結(jié)果如圖16所示。使置換了5個(gè)殘基的氨基酸的突變酶(K701_突變型3)進(jìn)行表達(dá)的酵母的角鯊烯產(chǎn)量與K701_tHMGR相比明顯增加。
突變酶(K701_突變型:T856I)
5′-AACTGGATCAATGGTCGTGGTAAGAGT-3′
(序列號(hào)39)
5′-ACCATTGATCCAGTTGATAGAAGCGGC-3′
(序列號(hào)40)
《實(shí)施例11》
在本實(shí)施例中,使用比較例1中得到的K701_tHMGR表達(dá)載體,除了將向構(gòu)成Lα2區(qū)域的氨基酸中導(dǎo)入的突變由3個(gè)殘基變?yōu)?個(gè)殘基以外,以與實(shí)施例5相同的方式制備突變酶,研究角鯊烯產(chǎn)量(對突變部位進(jìn)行特定的序號(hào)的定義與實(shí)施例5相同。)。即,在K701_tHMGR表達(dá)載體中,以使Sα2區(qū)域的氨基酸序列為EEGQNLLKKSFN,且HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)~Lα2區(qū)域的氨基酸序列為DKKAASINWIN的方式導(dǎo)入氨基酸置換突變。即,將存在于Sα2區(qū)域的第6位的丙氨酸(第772位)置換為亮氨酸,將存在于Sα2區(qū)域的第7位的異亮氨酸(第773位)置換為亮氨酸,將存在于Sα2區(qū)域的第10位的丙氨酸(第776位)置換為絲氨酸。且在HMG-CoA結(jié)合位點(diǎn)之后,將存在于從Lα2區(qū)域的氨基末端向HMGR的氨基末端的第2位的脯氨酸(第850位)置換為丙氨酸,更進(jìn)一步,將存在于Lα2區(qū)域的第1位的丙氨酸(第852位)置換為絲氨酸,將存在于Lα2區(qū)域的第6位的谷氨酸(第857位)置換為天冬酰胺。
氨基酸置換突變的導(dǎo)入以所述K701_tHMGR表達(dá)載體作為模版,通過與比較例3相同的方法,重復(fù)改變引物的操作,通過導(dǎo)入順序突變構(gòu)筑置換了6個(gè)殘基的氨基酸的載體。
突變導(dǎo)入為通過所述引物(序列號(hào)23~32)導(dǎo)入突變,更進(jìn)一步,通過上述引物(序列號(hào)39~40)導(dǎo)入回復(fù)突變。
將構(gòu)筑的載體導(dǎo)入到作為宿主的清酒酵母中,獲得K701_突變型4菌株。將各菌株的角鯊烯產(chǎn)量作為指標(biāo),比較甲羥戊酸路徑的增強(qiáng)效果。角鯊烯產(chǎn)量的測定使用以實(shí)施例2(2)為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行。培養(yǎng)則使用帶擋板的三角燒瓶,向YPD培養(yǎng)基(葡萄糖5%)添加經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的菌體,在28℃、250rpm下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)攪拌的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。在2天培養(yǎng)后,回收培養(yǎng)菌體,以ADK4653_tHMGR、K701_tHMGR作為比較對象,測定角鯊烯產(chǎn)量。結(jié)果如圖16所示。使置換了6個(gè)殘基的氨基酸的突變酶(K701_突變型4)進(jìn)行表達(dá)的酵母的角鯊烯產(chǎn)量與K701_tHMGR相比明顯增加。
將實(shí)施例3及5~11、以及比較例2~6的(a)~(g)的位置的氨基酸(來自ADK4653_tHMGR或K701_tHMGR的氨基酸的置換)及ADK4653_tHMGR設(shè)為100時(shí),各實(shí)施例及比較例的角鯊烯的產(chǎn)量的相對值總結(jié)于表1。此外,氨基酸以直線表示。
[表1]
表中的網(wǎng)線的氨基酸表示K701_tHMGR的氨基酸。
(a)Sα2區(qū)域的第10位:ADK4653_tHMGR的第744位氨基酸、K701_tHMGR的第776位氨基酸
(b)DKK區(qū)域的C末端的第1位:ADK4653_tHMGR的第818位氨基酸、K701_tHMGR的第850位氨基酸
(c)Lα2區(qū)域的第1位:ADK4653_tHMGR的第820位氨基酸、K701_tHMGR的第852位氨基酸
(d)Lα2區(qū)域的第6位:ADK4653_tHMGR的第825位氨基酸、K701_tHMGR的第857位氨基酸
(e)Sα2區(qū)域的第7位:ADK4653_tHMGR的第741位氨基酸、K701_tHMGR的第773位氨基酸
(f)Lα2區(qū)域的第5位:ADK4653_tHMGR的第824位氨基酸、K701_tHMGR的第856位氨基酸
(g)Sα2區(qū)域的第6位:ADK4653_tHMGR的第740位氨基酸、K701_tHMGR的第772位氨基酸
由比較例2及實(shí)施例3可知,與K701_tHMGR(a=A、b=P、c=A、d=E、e=I、f=I、g=A)相比,(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)位置的7個(gè)氨基酸不同的ADK4653_tHMGR(a=S、b=A、c=S、d=N、e=L、f=T、g=L)的角鯊烯的產(chǎn)量顯著優(yōu)異。更進(jìn)一步,由實(shí)施例5可知,通過將K701_tHMGR的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)位置的7個(gè)氨基酸置換為ADK4653_tHMGR的7個(gè)氨基酸,角鯊烯的產(chǎn)量的相對值為92.1,與ADK4653_tHMGR基本相同。ADK4653_tHMGR與K701_tHMGR的氨基酸序列長度也不同,縮短型HMGR(tHMGR)的氨基酸序列的同一性為78%。令人感到驚訝的是,K701_tHMGR的氨基酸中,僅通過將7個(gè)堿基的氨基酸置換為ADK4653_tHMGR的氨基酸,角鯊烯的產(chǎn)量與ADK4653_tHMGR相同。即認(rèn)為,在甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的角鯊烯的生產(chǎn)中,所述(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(g)位置的7個(gè)氨基酸起到了重要的作用。
更進(jìn)一步,由比較例3~比較例6的結(jié)果可知,若將ADK4653_tHMGR的(a)、(b)、(c)及(d)位置的氨基酸的任意一個(gè)置換為K701_tHMGR的氨基酸,角鯊烯的產(chǎn)量的相對值為0~13.9,急劇下降。即認(rèn)為,所述(a)、(b)、(c)及(d)位置的氨基酸尤其在甲羥戊二酸單酰CoA還原酶的角鯊烯的生產(chǎn)是重要的。
此外,由實(shí)施例6~11的結(jié)果可知,(e)、(f)及(g)位置的3個(gè)氨基酸的任意一個(gè)為K701_tHMGR的氨基酸的情況下,角鯊烯的產(chǎn)量的相對值為18.2~54.2。即,與(a)、(b)、(c)及(d)位置的氨基酸相比,(e)、(f)及(g)位置的氨基酸即使為K701_tHMGR的氨基酸,仍表現(xiàn)出高的角鯊烯的生產(chǎn)性。
工業(yè)實(shí)用性
根據(jù)本發(fā)明,在類萜化合物的生產(chǎn)中,能夠提高甲羥戊酸的產(chǎn)生及角鯊烯的產(chǎn)生。因此,通過本發(fā)明而得到的甲羥戊酸及角鯊烯,可用作例如醫(yī)藥品的生產(chǎn)原料。
以上根據(jù)特定的形態(tài)對本發(fā)明進(jìn)行了說明,本領(lǐng)域技術(shù)人員的顯而易見的變形或改良也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。