一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胸苷的生產(chǎn)工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β?胸苷的生產(chǎn)工藝，包括菌種培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)工藝得到發(fā)酵液，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，減少發(fā)酵級數(shù)，并且使工藝易于控制，調(diào)整培養(yǎng)基的配方，降低發(fā)酵成本。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明工藝簡單，發(fā)酵級數(shù)少，工藝穩(wěn)定易于控制，成本較低，適合工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】
一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)卜胸苷的生產(chǎn)工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工藝?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]胸苷全稱為P-2’-脫氧胸苷，是一種天然化合物，是組成脫氧核糖核酸(DNA)這一生物大分子的四個天然核苷之一?，F(xiàn)在已知核苷及其變形的核苷在癌癥化療和作為抗病毒化合物方面起著極其重要的作用，到目前為止國際許可應(yīng)用的抗病毒的藥物，絕大多數(shù)是核苷衍生物?！?胸苷是抗艾滋病毒藥物AZT (疊氮胸苷)和D4T(司他夫定)最理想的原料藥，也可作為醫(yī)藥中間體，直接出口，所以合成￠-胸苷具有十分重要的意義和經(jīng)濟價值。
[0003]目前，胸苷的生產(chǎn)主要有化學(xué)合成法，DNA酶解法和發(fā)酵法。化學(xué)合成法有多種途徑，￠-胸苷是1935年被人們用化學(xué)方法合成出來的，但是化學(xué)合成法存在污染大，原料不易得，收率低等問題。DNA酶解法是指將DNA酶解后，分離出四種核苷酸，但是分離過程極為復(fù)雜，而且成本較高。發(fā)酵法是利用基因工程重組大腸桿菌，高效的合成胸苷，工藝簡單，周期短，含量高，原料易得，分離簡單，環(huán)境污染小。然而發(fā)酵法目前還處在實驗室研發(fā)階段，所用的原料昂貴，成本較高，在國內(nèi)還沒有形成產(chǎn)業(yè)化。目前我國生產(chǎn)￠-胸苷的廠家屈指可數(shù)，大多采用化學(xué)合成法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服上述不足，提供一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工〇
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實施的:一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟，(1)菌種培養(yǎng)al.將細(xì)菌接種于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿A中，于36-37°C培養(yǎng)22-24h;將生長成熟的菌種繼續(xù)接種于培養(yǎng)皿B中，于36-37°C培養(yǎng)12-16h; bl.將培養(yǎng)皿B用生理鹽水沖洗，得菌液，備用；(2)種子培養(yǎng)a2.向種子罐中加入適量的水，依次加入酵母浸粉5-25g/L，氯化鈉3-10 g/L，磷酸二氫鉀1-5 g/L，磷酸氫二鉀1-5 g/L，硫酸銨1-5 g/L，甘油10-60 g/L，消泡劑0-1 g/L，攪拌混勻；b2.用堿液將PH調(diào)至7.2-7.8，高溫高壓滅菌；c2.將罐溫降到35-40°C，用將菌液接入種子罐，罐溫35-40°C，罐壓0.03-0.07Mpa，培養(yǎng)時間為5_24h，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)a3.培養(yǎng)基配方為:六偏磷酸鈉2-10 g/L、磷酸二氫鉀2-10 g/L、磷酸氫二銨2-10 g/L、檸檬酸0.1-1 g/L、甘氨酸1-5 g/L、酵母浸粉0-40 g/L、脫脂豆粉10-50 g/L、玉米漿0-100 g/L、胰蛋白胨0-10 g/L、氯化鈣0-5 g/L、消泡劑0.2-0.8 g/L、三氯化鐵0.01-0.05 g/L、硫酸亞鐵0.01-0.05 g/L、煙酸0.005-0.02 g/L、維生素BI 0.005-0.02 g/L，將配好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中；
b3.用氨水調(diào)pH至7.2-7.8，高溫高壓滅菌；
c3.將罐溫降到30-37°C，分別加入葡萄糖2-10 g/L，七水合硫酸鎂1_5 g/L，碳酸鈣2-10 g/L，混勾；
d3.將種子液接種至發(fā)酵罐中，罐溫30-37 0C，罐壓0.03-0.07Mpa，培養(yǎng)時間為1_5天，
得發(fā)酵液。
[0006]進(jìn)一步的，發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)至2-10h時開始連續(xù)向培養(yǎng)基中加適量的葡萄糖溶液，控制還原糖的含量在0.1-1%。
[0007]進(jìn)一步的，種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，接種方式均采用差壓法。
[0008]進(jìn)一步的，所述消泡劑為聚醚。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
1.通過優(yōu)化發(fā)酵條件，減少了發(fā)酵級數(shù)，縮短了工藝流程；
2.工藝關(guān)鍵控制點由之前的控制溶氧改為控制pH，使得發(fā)酵水平大幅提高，并且穩(wěn)定性較好；
3.發(fā)酵生產(chǎn)過程中對配方進(jìn)行優(yōu)化，減少昂貴原料的使用，成本大幅降低，解決了發(fā)酵法實驗階段成本高的問題。
[0010]本發(fā)明工藝簡單，發(fā)酵級數(shù)少，工藝穩(wěn)定易于控制，成本較低，適合工業(yè)生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，在此發(fā)明的示意性實施例以及說明用來解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。
[0012]實施例1
一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)胸苷的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟，
(1)菌種培養(yǎng)
al.將細(xì)菌接種于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿A中，于37°C培養(yǎng)22h;將生長成熟的菌種繼續(xù)接種于培養(yǎng)皿B中，于37°C培養(yǎng)14h;
bl.將培養(yǎng)皿B用生理鹽水沖洗，得菌液，備用；
(2)種子培養(yǎng)
a2.向種子罐中加入適量的水，依次加入酵母浸粉15 g/L，氯化鈉8 g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，硫酸銨3 g/L，甘油30 g/L，聚醚0.3 g/L，攪拌混勻；b2.用喊液將PH調(diào)至7.2，尚溫尚壓滅囷；
c2.將罐溫降到35°C，采用差壓法將菌液接入種子罐，罐溫37°C，罐壓0.03Mpa，培養(yǎng)時間為18h，得種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
a3.培養(yǎng)基配方為:六偏磷酸鈉5 g/L、磷酸二氫鉀4 g/L、磷酸氫二銨4 g/L、檸檬酸
0.3 g/L、甘氨酸3 g/L、酵母浸粉20 g/L、脫脂豆粉20 g/L、玉米漿50 g/L、胰蛋白胨4 g/L、氯化鈣2 8/1、聚醚0.4 8/1、三氯化鐵0.02 8/1、硫酸亞鐵0.03 8/1、煙酸0.005 g/L、維生素BI 0.005 g/L，將配好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中；b3.用氨水調(diào)pH至7.2，高溫高壓滅菌；
c3.將罐溫降到37°C，分別加入葡萄糖5 g/L，七水合硫酸鎂2 g/L，碳酸鈣5 g/L，混勻；
d3.采用差壓法將種子液接種至發(fā)酵罐中，罐溫37°C，罐壓0.03Mpa，培養(yǎng)時間為3天。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)至5h時開始連續(xù)向培養(yǎng)基中加適量的葡萄糖溶液，控制還原糖的含量在0.5%，得發(fā)酵液。
[0013]實施例2
一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)胸苷的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟，
(1)菌種培養(yǎng)
al.將細(xì)菌接種于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿A中，于37°C培養(yǎng)22h;將生長成熟的菌種繼續(xù)接種于培養(yǎng)皿B中，于37°C培養(yǎng)16h;
bl.將培養(yǎng)皿B用生理鹽水沖洗，得菌液，備用；
(2)種子培養(yǎng)
a2.向種子罐中加入適量的水，依次加入酵母浸粉15 g/L，氯化鈉8 g/L，磷酸二氫鉀5g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，硫酸銨5 g/L，甘油40 g/L，聚醚0.5 g/L，攪拌混勻；b2.用喊液將PH調(diào)至7.5，尚溫尚壓滅囷；
c2.將罐溫降到40°C，采用差壓法將菌液接入種子罐，罐溫36°C，罐壓0.05 Mpa，培養(yǎng)時間為20 h，得種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
a3.培養(yǎng)基配方為:六偏磷酸鈉6 g/L、磷酸二氫鉀7 g/L、磷酸氫二銨7 g/L、檸檬酸
0.4 g/L、甘氨酸4 g/L、酵母浸粉20 g/L、脫脂豆粉30 g/L、玉米楽；60 g/L、胰蛋白胨4 g/L、氯化鈣4 8/1、聚醚0.6 8/1、三氯化鐵0.03 8/1、硫酸亞鐵0.03 8/1、煙酸0.01 g/L、維生素BI 0.01 g/L，將配好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中；b3.用氨水調(diào)pH至7.6，高溫高壓滅菌；
c3.將罐溫降到37°C，分別加入葡萄糖8 g/L，七水合硫酸鎂2 g/L，碳酸鈣5 g/L，混勻；
d3.采用差壓法將種子液接種至發(fā)酵罐中，罐溫37°C，罐壓0.05 Mpa，培養(yǎng)時間為5天。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)至5h時開始連續(xù)向培養(yǎng)基中加適量的葡萄糖溶液，控制還原糖的含量在0.6%，得發(fā)酵液。
[0014]實施例3
一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)胸苷的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟，
(1)菌種培養(yǎng)
al.將細(xì)菌接種于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿A中，于37°C培養(yǎng)24h;將生長成熟的菌種繼續(xù)接種于培養(yǎng)皿B中，于37°C培養(yǎng)16h;
bl.將培養(yǎng)皿B用生理鹽水沖洗，得菌液，備用；
(2)種子培養(yǎng)
a2.向種子罐中加入適量的水，依次加入酵母浸粉20 g/L，氯化鈉8 g/L，磷酸二氫鉀5g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，硫酸銨5 g/L，甘油40 g/L，聚醚0.8 g/L，攪拌混勻； b2.用喊液將PH調(diào)至7.8，尚溫尚壓滅囷；
c2.將罐溫降到37°C，采用差壓法將菌液接入種子罐，罐溫37°C，罐壓0.06 Mpa，培養(yǎng)時間為24h，得種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
a3.培養(yǎng)基配方為:六偏磷酸鈉8 g/L、磷酸二氫鉀8 g/L、磷酸氫二銨8 g/L、檸檬酸
0.6 g/L、甘氨酸4 g/L、酵母浸粉30 g/L、脫脂豆粉40 g/L、玉米楽；80 g/L、胰蛋白胨6 g/L、氯化鈣4 8/1、聚醚0.6 8/1、三氯化鐵0.04 8/1、硫酸亞鐵0.04 8/1、煙酸0.02 g/L、維生素BI 0.02 g/L，將配好的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中；b3.用氨水調(diào)pH至7.8，高溫高壓滅菌；
c3.將罐溫降到37°C，分別加入葡萄糖8 g/L，七水合硫酸鎂4 g/L，碳酸鈣8 g/L，混勻；
d3.采用差壓法將種子液接種至發(fā)酵罐中，罐溫37°C，罐壓0.07Mpa，培養(yǎng)時間為5天。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)至8 h時開始連續(xù)向培養(yǎng)基中加適量的葡萄糖溶液，控制還原糖的含量在0.8%，得發(fā)酵液。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)方案不限于上述具體實施例的限制，凡是根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的技術(shù)變形，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟，(1)菌種培養(yǎng)al.將細(xì)菌接種于盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿A中，于36-37°C培養(yǎng)22-24h;將生長成熟的菌 種繼續(xù)接種于培養(yǎng)皿B中，于36-37°C培養(yǎng)12-16h;bl.將培養(yǎng)皿B用生理鹽水沖洗，得菌液，備用；(2)種子培養(yǎng)a2.向種子罐中加入適量的水，依次加入酵母浸粉5-25g/L，氯化鈉3-10 g/L，磷酸二 氫鉀1-5 g/L，磷酸氫二鉀1-5 g/L，硫酸銨1-5 g/L，甘油10-60 g/L，消泡劑0-1 g/L，攪拌 混勻；b2.用堿液將PH調(diào)至7.2-7.8，高溫高壓滅菌；c2.將罐溫降到35-40 °C，用將菌液接入種子罐，罐溫35-40 °C，罐壓0.03-0.07Mpa，培 養(yǎng)時間為5_24h，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)a3.培養(yǎng)基配方為:六偏磷酸鈉2-10 g/L、磷酸二氫鉀2-10 g/L、磷酸氫二銨2-10 g/ L、檸檬酸0.1-1 g/L、甘氨酸1-5 g/L、酵母浸粉0-40 g/L、脫脂豆粉10-50 g/L、玉米漿0-100 g/L、胰蛋白胨0-10 g/L、氯化鈣0-5 g/L、消泡劑0.2-0.8 g/L、三氯化鐵0.01-0.05 g/ L、硫酸亞鐵0.01-0.05 g/L、煙酸0.005-0.02 g/L、維生素Bl 0.005-0.02 g/L，將配好的培 養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中；b3.用氨水調(diào)pH至7.2-7.8,高溫高壓滅菌；c3.將罐溫降到30-37°C，分別加入葡萄糖2-10 g/L，七水合硫酸鎂1-5 g/L，碳酸鈣2-10 g/L，混勾；d3.將種子液接種至發(fā)酵罐中，罐溫30-37 °C，罐壓0.03-0.07Mpa，培養(yǎng)時間為1-5天，得發(fā)酵液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于，發(fā)酵 培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)至2-10h時開始連續(xù)向培養(yǎng)基中加適量的葡萄糖溶液，控制還原糖的含量 在0?1_1%〇3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于，種子 培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，接種方式均采用差壓法。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)￠-胸苷的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述 消泡劑為聚醚。
【文檔編號】C12R1/19GK105950689SQ201610479603
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】林楠棋, 張欣, 張書汁, 李占濤, 李兆如
【申請人】焦作健康元生物制品有限公司